Szimulációk egyszerősített fehérjemodellekkel Szilágyi András
Szimulációs módszerek alkalmazhatósági tartományai
Egyszerősített modellek Három típusát mutatjuk be: Játék rácsmodellek Realisztikusabb rácsmodellek Diszkrét molekuladinamika
Kitérı: A fehérjék felgombolyodása DNS RNS polipeptidlánc mőködıképes fehérjemolekula transzkripció transzláció felgombolyodás Anfinsen kísérletei (1961): Az aminosavsorrend tartalmazza a háromdimenziós szerkezet kialakulásához szükséges összes információt. A natív szerkezet a termodinamikailag legstabilisabb állapot. A fehérjék stabil konformációs állapotai: A legombolyodott (denaturált) állapot. Jele: U (unfolded) vagy D (denatured) A felgombolyodott (natív, általában biológiailag aktív) állapot. Jele: F (folded) vagy N (natív). A köztes állapotok (köztitermékek, intermedierek). Jelük: I (intermediate)
Állandó nyomáson és hımérsékleten egy rendszer egyensúlyi állapotát a szabadentalpia (G) minimuma adja Az entalpiacsökkentı folyamatok (pl. kölcsönhatások létrejötte) és az entrópianövelı folyamatok (pl. egy láncmolekula mozgásszabadságának megnövekedése) egyaránt csökkentik a szabadentalpiát. A hımérséklet határozza meg, hogy melyik típusú folyamat érvényesülhet jobban (a magasabb hımérséklet az entrópianövelı folyamatoknak kedvez).
A felgombolyodás termodinamikája Alacsony hımérsékleten a natív állapot (sok kölcsönhatás, alacsony entrópia), magas hımérsékleten a denaturált állapot (kevés kölcsönhatás, magasabb entrópia) a stabilabb. Egy bizonyos hımérsékleten (T m olvadáspont ) kooperatív átmenet történik a két állapot között (jellegzetes csúcs a hıkapacitásgörbében). (A hımérsékletet eléggé lecsökkentve általában megint a denaturált állapot lesz a stabilabb hidegdenaturáció)
Rácsmodellek Rácsmodell: "önelkerülõ" gyöngysor, rácspontokon 2D HP modell 3D HP modell Ken A. Dill (UCSF) Perturbált heteropolimer modell, kétbetûs kóddal Eugene Shakhnovich (Harvard)
A rácsmodellek típusai HP modell (Hidrofób-Poláros) [Ken A. Dill és mások] Kétféle aminosav: Hidrofób és Poláros (kétbetős kód) 2D és 3D modellek. Eredményeik hasonlóak; a 2D modellek könnyebben számíthatóak. Hidrofób maggal rendelkezõ modell 2D-ben 16, 3D-ben 64 aminosavból készíthetõ. Egyparaméteres: ε kontaktenergia (a HH kontaktus energiája) A kontaktusok energiája: (E HH, E HP, E PP ) = ( ε, 0, 0) Perturbált heteropolimer modellek [Eugene I. Shakhnovich és mások] Erıs vonzás a monomerek között, gyenge variációval Többnyire 27-mer, alapállapota 3x3x3-as kockán (103 346 lehetséges állapot) Két változat: Független kontaktenergiák: E(i,j) = B ij Kétbetős kód: A,B. Ált. E AB > E AA, E BB. (Ált. nem mag-felszín szeparációhoz, hanem jobb-bal elkülönüléshez vezet.)
Elınyök A rácsmodellek elınyei és hátrányai Szekvenciatér és konformációtér teljességében felderíthetı Egzaktul kiszámítható mennyiségek! (Jobb az egyszerő, de egzaktul számolható modell, mint a bonyolult, de csak közelítıleg számítható.) Nem csak fehérjékre vonatkoztatható Használható analitikus elméletek tesztelésére (mint spinüveg-modell, átlagtér-elméletek) Használható konformációkeresı algoritmusok tesztelésére Hátrányok Az atomi felbontás hiánya A szerkezeti és energetikai részletek nem pontosak A lánc sokszor irreálisan rövid
A rácsmodellek elemzése Enumeráció: a modell összes lehetséges állapotának elıállítása, megszámlálása és jellemzése. Kisebb modelleknél járható. Monte Carlo mintavétel, ill. szimuláció: Monte Carlo módszerrel (véletlenszerő generálás) véletlen állapotok elıállítása, ebbıl statisztikai számítás. Nagyobb modelleknél. (Hibalehetıségek vannak, pl. rossz becslésekbıl.) A natív állapot megkeresése: Kisebb modelleknél az összes lehetséges állapot végigpróbálásával, nagyobbaknál becslés speciális algoritmusokkal. A HP modellek alapállapotának megkeresése ún. NP-nehéz feladat
Egyszerő rácsmodellek: 1. Négytagú játékmodell A: energiaszintek, B: állapotok, C: h kontaktushoz tartozó állapotok száma, g(h) Legegyszerőbb 2D HP rácsmodell, szekvencia: HPPH h db kontaktusnál az energia: hε
A: Natív populáció részaránya, B: G felgombolyodási szabadentalpia. T m olvadáspontnál a natívhányad 50%, a szabadentalpia nulla. A szabadentalpiafüggvény lineáris (valódi fehérjéknél görbült) A: energia, B: hõkapacitás. A hõkapacitásgörbe jellegzetes átmeneti csúcsot mutat Már ez a legegyszerőbb modell is mutatja a fehérjék egyes termodinamikai tulajdonságait
2. Hattagú játékmodell Hattagú 2D HP modell, szekvencia: HPHPPH. Három energiaszint: három állapot Populációeloszlások a hõmérséklet függvényében: A populáció a tisztán natív állapotból indulva a köztes állapoton át folyamatosan áttolódik a denaturált állapotra
Felgombolyodási szabadentalpia a hõmérséklet függvényében: Az intermedier állapot miatt már nem lineáris, hanem görbül, mint a valódi fehérjéknél. Ha epszilont hõmérsékletfüggõvé tesszük (a hõmérséklet csökkenésével csökken, akárcsak a hidrofób kölcsönhatás), a szaggatott vonallal jelzett görbét kapjuk. Ez mutatja a valódi fehérjékre jellemzõ, parabolaszerû görbét, a hidegdenaturációval. Egy egyszerû hattagú modell már a fehérjék szabadentalpia-görbéjét is jól modellezi
3. Húsztagú modellek A szekvenciától függõen sokféle viselkedés: A: natív részarány, B: hõkapacitás, epszilon/kt függvényében, C: a modellek natív állapotai (legmélyebb energiaszint) ε a hidrofób kölcsönhatás erısségét jellemzi, ε/kt a denaturálószer-koncentrációnak feleltethetı meg (i): két csúcsú széles átmenet: kétdoménes fehérje (ii), (iii): egyetlen éles csúcs
(ii) populációeloszlása a hımérséklet függvényében: T=0,3 és T=0,4-nél az eloszlásnak minimuma van: kooperatív, kétállapotú rendszer Egy húsztagú modell már kétállapotú kooperativitást képes mutatni, akárcsak a valódi fehérjék A modell natív állapota egy β-lemezt és két hélixet tartalmaz, poláros felszínnel
Rácsmodell felgombolyodásának szimulációja Monte Carlo módszerrel (ld. elızı elıadás) lehetséges, ehhez definiálni kell egy mozgáskészletet (move set). Példa:
Egy 13 tagú HP modell felgombolyodásának szimulációja Két útvonal, egy gyors és egy lassú. A lassú útvonalon kinetikus csapda (lokális energiaminimum). Ez az egyszerő modell is komplex felgombolyodási kinetikát mutat (a lizozimhoz hasonló).
Egy 13 tagú HP modell felgombolyodásának szimulációja (folytatás) A populációk idıfüggése: (A számok az adott állapotban meglévı HH kontaktusok számát jelentik. Szaggatott vonal: a hidrofób kontaktusok száma a natív szerkezethez viszonyítva) Gyors hidrofób kollapszus, majd 5 nagyságrenddel hosszabb idıskálán lassú átrendezıdés a natív állapotba. Jól mutatja a valódi fehérjéknél megfigyelt sajátosságokat.
Szabadenergia-felületek rácsmodellekbıl Rácsmodellek Monte Carlo szimulációiból számítható a szabadenergia: ahol F = E TS E az energia (a kontaktusok számából) S az entrópia (az adott energiájú állapotok számából számítható). A szabadenergiát megfelelõ mennyiségek mint koordináták függvényében ábrázolva szemléletes felületek adódnak. Ilyen mennyiségek pl.: C: az összes kontaktusok száma Q 0 : a natív kontaktusok száma (olyan kontaktus, ami a natív szerkezetben is megvan)
Egy 27 elemő modell szabadenergia-felülete: A szimuláció menete ezen a felületen szemléltethetõ: A szimuláció random szerkezetbõl indul (kevés kontaktus): hozzáférhetõ állapotok száma kb. 10 16 Gyorsan összeesik egy kompakt szerkezetté, mely a lehetséges kontaktusok 60%-át tartalmazza, de a 60%-nak csak 25%-a natív kontaktus. A hozzáférhetõ állapotok száma kb. 10 10. Itt egy széles minimum van a szabadenergiában Ezután lassú folyamat következik: a lánc keresi a natív állapot felé vezetõ átmeneti állapotot Átmeneti állapotok száma 10 3 Az átmeneti állapotból gyorsan betalál a natívba (1 állapot) Zöld, piros: lehetséges, különbözõ útvonalak. Sárga: átlag.
125 elemő modell (5x5x5-ös kocka a natív állapot) szabadenergia-felülete Két mennyiség mint koordináta: Q c : a belsõ magban lévõ natív kontaktusok (34 darab), Q s : olyan kontaktusok, amelyek a legfontosabb intermedierben nincsenek benne (15 darab) A felgombolyodás menete: Gyors összeesés, majd lassú keresés A molekulák 15%-ában gyorsan kialakul a natív mag, majd közvetlenül a natív állapotba jut (sárga útvonal) A molekulák 40%-a különféle nemnatív kontaktusokat létesít, így egy hosszú élettartamú intermedier alakul ki (piros útvonal), melyben két szubdomén van, egyikben a natív 5x5x5-ös kocka felsõ három síkja megvan, a másik a többi részbõl áll. Mindkét szubdomén eléggé felgombolyodott, de a köztük lévõ kapcsolatok nem jöttek létre. A maradék 45%-ban szintén rosszul kezd felgombolyodni, de gyorsabban áthidalja a dolgot (ezt nem jelöltük)
A rácsmodellek következtetései Bizonyos szekvenciájú rácsmodellek stabil, kompakt állapotokba esnek össze. Ezek számos tekintetben igen hasonlóak a fehérjékhez: Kompakt, unikális natív szerkezet Másodlagos és harmadlagos szerkezet Apoláros mag, poláros felszín Éles, szigmoidális, kooperatív átmenet Kétállapotú kooperativitás Kompakt, komplex denaturált állapotok Többfázisú felgombolyodási kinetika Szabadenergiafelületek, kinetikus komplexitás jól modellezhetõ
Realisztikusabb rácsmodellek Elég sőrő 3D rácson, ha nem kötjük ki, hogy a kötések rácséleken feküdjenek, valóságos fehérjeszerkezet is reprezentálható Minden mozgás a rácsra korlátozódik, ezért Monte Carlo módszerrel hatékonyan szimulálható Tudás alapú (empirikus) potenciálfüggvényekkel
CABS modell (Zhang- Kolinski-Skolnick 2003) Atomok egy 0,87 angström cellamérető rácson Csak C α, C β és az oldallánc tömegközéppontja Monte Carlo mozgáskészlet
Empirikus potenciálfüggvény
A paramétereket az ismert szerkezetek adatbázisából vezették le (ezért tudásalapú)
A potenciálfüggvény 19 szabad paramétert (súlyt) tartalmaz. Ezeket optimalizálták egy decoy (csalétek) halmaz segítségével oly módon, hogy az energia és az RMSD közötti korreláció maximális legyen. Tölcséresített potenciálfüggvény : a szerkezetet beirányítja a globális minimumba. CASP2004-en a CABS modellen alapuló szerkezetpredikciós módszer kiválóan szerepelt. 100 aminosav alatti fehérjéket általában a helyes szerkezetbe gombolyít fel (NMR szerkezetnek megfelelı pontossággal).
Diszkrét molekuladinamika (DMD) A hagyományos molekuladinamikában a Newton-féle mozgásegyenleteket integráljuk. Az idıbeli lépésköznek elegendıen kicsinek kell lennie, a molekula leggyorsabb mozgásaihoz igazodva. DMD: a dinamikát ütközési események egymásutánjaként fogjuk fel. Két ütközés között az atomok egyenes vonalú, egyenletes mozgást végeznek, ezt nem szükséges követni, a számítás rögtön a következı ütközésre léptetheti a rendszert. Ezáltal több nagyságrenddel gyorsabban végezhetı a szimuláció! Ennek ára: a potenciálfüggvényt diszkretizálni kell.
A potenciálfüggvény diszkretizálása A párpotenciált lépcsızetes függvénnyel közelítjük
DMD szimuláció 1 Ballisztikus szakasz 2 Ütközés v i v j v i v j r = σ r + vτ = σ r = r j r i v = v j v i b = rv r = r v = v A következı ütközés ideje az alábbi egyenlet két megoldása közül a kisebb pozitív: 2 2 2 2 ± ( ) = b b v r σ τ 2 v
Az ütközések feldolgozása Általánosított ütközések: potenciálfallal i 1 m i v i = m j v j lendület j kilépés s =1 potenciálgödör belépés s =1 2 E + U = E k v i = m j Φr v j = m i Φr k energia megoldható m i + m j m = 2 visszapattanás s = 1 U visszapattanás s = 1 Φ = b + s b 2 2 4σ m U m m 2 2σ m i j U r
Eseményfa Az ütközési eseményeket bináris keresıfában tároljuk root t = 23.7 A = 4 B = 3 : t = 25.1 A = 6 B = 8 : t = 32.1 A =1 B = 7 : t =19.2 A = 9 B = 1 : t = 24.2 A = 3 B = 8 : t = 31.6 A = 2 B = 4 : t = 43.8 A = 4 B = 5 : t = 23.9 A = 9 B = 2 : t = 24.7 A = 4 B = 10 : t = 47.8 A = 6 B = 9 :
Egyszerősített fehérjemodell Négygolyós modell Négyféle egyesített atom N C C α R = C β R O C N H C α H C O H N H C α R O C alanin: R = C β
Peptidgerinc kovalens kötés effektív kötés C βi A kötésszög-kényszereket 1-3 effektív kötésekkel valósítjuk meg C αi N i+1 C i+1 N C i Φ α, i Ψ C i i+1 i Kovalens kötés potenciálja: U r id r végtelen mély derékszögő gödör ±2% fluktuációt engedünk meg az ideális kötéshossz körül C β, i+1
Hidrogénkötés C α, i-1 C αi Segédkölcsönhatásokat vezetünk be az orientációfüggés modellezésére N i U 4.0Å 4.2Å ε HB / 2 ε HB / 2 r min r 1 r 2 r max r N j+1 C j C αj V ( r) 0, ε HB / 2 = ε HB + r > r > r max 2 r > r > r 2 1 r > r > r 1 min otherwise
Hımérsékletszabályozás Andersen-termosztát: Véletlenszerő ütközések történnek a hıfürdı szellemrészecskéivel Két ilyen ütközés között eltelı idı valószínőségeloszlása: P( t) = ν e νt ν az ütközésgyakoriság, ezt úgy választjuk meg, hogy az események 1%-a legyen szellemütközés A kinetikus energia fluktuációi jó egyezést mutatnak az elméleti értékekkel
Hexadeka-alanin
A hidrogénkötések számának fluktuációja 330 Kelvinen, 1 mikroszekundum idıtartam szimulációja során
Másodlagosszerkezet-tartalom a hımérséklet függvényében
A DMD perspektívái Mostanában újra felfedezett módszer Korlátja: bonyolultabb potenciálfüggvények diszkretizálása nehezen megoldható Jól alkalmazható: peptidek és kisebb fehérjék konformációs terének feltérképezésére, asszociáció, aggregáció modellezésére