EGY MAGYARORSZÁGI ERİMŐ VÍZELİKÉSZÍTİ ÜZEMÉNEK MIKROBIOLÓGIAI VIZSGÁLATA Kéki Zsuzsa Környezettudományi Doktori Iskola Környezetbiológia Program Témavezetı: Majorosné Dr. Tóth Erika ELTE Mikrobiológiai Tanszék
BEVEZETÉS Vízelıkészítı és víztisztító rendszerekben nagytisztaságú vizek szerves és szervetlen molekulák csak nyomokban oligotróf környezet Korróziós jelenségek Oligotróf szervezetek biofilm képzıdés A biofilm egy határfelületeken kialakuló, élı és elpusztult sejtek biopolimerjeibıl, ásványi anyagokból és/vagy fémionokból álló, komplex mátrixba ágyazódott mikrobiális közösség Korábbi tenyésztéses és tenyésztéstıl független vizsgálatok: vízköröket ellátó póttápvíz, csırendszerek biofilmek, vegyszerek, ioncserélı gyanták Korábbi vizsgálatok eredményei alapján: a vízben megjelenı mikrobák nagy része a nyersvízbıl, a vezetékek már meglévı biofilmjeirıl, illetve a gyanta felszínérıl származik
BEVEZETÉS A KEVERTÁGYAS IONCSERÉLİ GYANTA UTÁNI CSİSZAKASZON ÁRAMLÓ VÍZ PARAMÉTEREI Összes keménység 0 mval/kg Vastartalom (1-4)x10-3 mg/kg Nátrium tartalom 0 mg/kg Kálium tartalom 0 mg/kg KMnO 4 fogyasztás 0,2-6 mg/kg Lebegı anyag tartalom 0 mg/kg Nitrát tartalom 0 mg/kg Szulfát tartalom 0 mg/kg Klorid tartalom (1-3)x10-3 mg/kg Szilikát tartalom (1-8)x10-3 mg/kg Vezetıképesség 0,04-0,08 µs/cm
MUNKÁM CÉLJA Kritikus pontok és mintavételi gyakoriság meghatározása A vízelıkészítı üzem mikrobafertızöttség szempontjából kritikus pontjairól származó vízminták csíraszám, sejtszám meghatározása, valamint mikrobaközösségeinek összehasonlítása denaturáló grádiens gélelektroforézissel (DGGE) Biocidtesztek az üzem csırendszerének biofilmjeibıl származó baktériumtörzsekkel Hatékony módszer kidolgozása a vízelıkészítı üzem vízrendszerének mikrobamentesítésére: laboratóriumi modellrendszer felállítása, ioncserélı gyanták kezelése biociddel Az erımő vízelıkészítı üzemének csırendszerébıl származó biofilmminták és ioncserélı gyanták felszínének pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) vizsgálata oligotróf baktériumok tenyésztésére alkalmas speciális táptalajok kidolgozása
ELİZETES MINTAVÉTEL - DECEMBER ANYAG ÉS MÓDSZER finomsótalanvíz-tartály 11 nyersvíz-tartály elılágyvíz-tartály 6 7 sótalanvíz-tartály NaOH primer kör elıkezelt Duna víz 1 2 4 3 meszes reaktor Ca(OH) 2 scavenger kationcserélı anioncserélı kavics szőrı FeSO 4 NaCl HCl NaOH 5 8 9 10 kevertágy H SO 2 4 12 secunder kör marginális részek alapsótlanító blokk SEJTSZÁM MEGHATÁROZÁS DAPI Vízminta - Sejtek fixálása 8%-os paraformaldehiddel Szőrés 0,25 µm-es membránfilterrel sejtek festése DAPI (diamino-fenilindol 1µg/ml) epifluoreszcens mikroszkópia (Nikon80i) sejtszám meghatározás (Image Pro Plus) DENATURÁLÓ GRÁDIENS GÉLELEKTROFORÉZIS DGGE DNS izolálás (Ultra Water Clean DNA Kit) 16S rdns amplifikálása (27f 1492r) - nested PCR (338F GC kapocs 519r) DGGE Kiértékelés (Foretics)
ANYAG ÉS MÓDSZER MINTAVÉTELI HELYEK finomsótalanvíz-tartály 11 nyersvíz-tartály elılágyvíz-tartály 6 7 sótalanvíz-tartály NaOH primer kör elıkezelt Duna víz 1 2 4 3 5 8 9 10 meszes reaktor Ca(OH) 2 scavenger kationcserélı anioncserélı kavics szőrı FeSO 4 NaCl HCl NaOH H SO kevertágy 2 4 12 secunder kör marginális részek alapsótlanító blokk CSÍRASZÁM BECSLÉS Hígítási sor - Direkt szélesztés - R2A táptalaj csíraszám SPECIÁLIS meghatározása TÁPTALAJOK TENYÉSZTÉS Nyomelem SEJTSZÁM oldat MEGHATÁROZÁS Vitamin oldat Baktérium DAPI kivonat Vízminta - Sejtek fixálása 8%-os paraformaldehiddel Szőrés 0,25 µm-es membránfilterrel sejtek festése DAPI (diamino-fenilindol 1µg/ml) epifluoreszcens mikroszkópia (Nikon80i) sejtszám meghatározás (Image Pro Plus) SEJTSZÁM MEGHATÁROZÁS DAPI Vízminta - Sejtek fixálása 8%-os paraformaldehiddel Szőrés 0,25 µm-es membránfilterrel sejtek festése DAPI (diamino-fenilindol 1µg/ml) epifluoreszcens mikroszkópia (Nikon80i) sejtszám meghatározás (Image Pro Plus) DENATURÁLÓ GRÁDIENS GÉLELEKTROFORÉZIS DGGE DNS izolálás (Ultra Water Clean DNA Kit) 16S rdns amplifikálása (27f 1492r) - nested PCR (338F GC kapocs 519r) DGGE Kiértékelés (Foretics) PÁSZTÁZÓ ELEKTRONMIKROSZKÓPOS VIZSGÁLAT SEM Kémiai fixálás (5%-os glutáraldehid) - Elıfagyasztás folyékony nitrogénben Liofilizálás Arannyal gızölés SEM vizsgálat (HITACHI S-2600N)
EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK SEJTSZÁM MEGHATÁROZÁS - DECEMBER PAKS 2008 DECEMBER SEJTSZÁM 7,00E+04 6,00E+04 5,00E+04 4,00E+04 3,00E+04 2,00E+04 1,00E+04 0,00E+00 01WP13S001 I. 01WP13S001 II. 01WP13S001 III. 01WK02A007 I. 01WK02A007 II. 01WK02A007 III. 01WM05S002 I. 01WM05S002 II. 01WM05S002 III. SEJTSZÁM (/ml) FINOMSÓTALANVÍZ ANIONCSERÉLİ KEVERTÁGYAS IONCSERÉLİ DENATURÁLÓ GRÁDIENS GÉLELEKTROFORÉZIS (DGGE DECEMBER) ALAPJÁN KÉSZÍTETT HASONLÓSÁGI FA DGGE - gélfotó
EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK CSÍRASZÁM BECSLÉS PAKS 2009 FEBRUÁR CSÍRASZÁM 3,00E+03 2,50E+03 2,00E+03 1,50E+03 1,00E+03 5,00E+02 CSÍRASZÁM (TKE/ml) 0,00E+00 01WA18S001_02.18 01WA10S001_02.18 01WA10S001_02.19 01WA10S001_02.20 01WA10S001_02.21 01WA10S001_02.22 01WA10S001_02.23 01WA10S001_02.24 01WD06S001_02.18 01WD06S001_02.19 01WD06S001_02.20 01WD06S001_02.21 01WD06S001_02.22 01WD06S001_02.23 01WD06S001_02.24 01WD07S001_02.18 01WD07S001_02.19 01WD07S001_02.20 01WD07S001_02.21 01WD07S001_02.22 01WD07S001_02.23 01WD07S001_02.24 01WD06S003 01WD07S003 KR KIM. KL KIM. DUNA VÍZ NYERSVÍZTARTÁLY KAVICSSZŐRİRE RÁMENİ (KR) KAVICSSZŐRİRİL LEJÖVİ (KL)
EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK SEJTSZÁM MEGHATÁROZÁS PAKS 2009 FEBRUÁR SEJTSZÁM 1,00E+06 9,00E+05 8,00E+05 7,00E+05 6,00E+05 5,00E+05 4,00E+05 3,00E+05 2,00E+05 SEJTSZÁM (/ml) 1,00E+05 0,00E+00 01WM05S001_T2_03.03 01WA18S001_02.18 01WA10S001_02.19 01WA10S001_02.21 01WA10S001_02.23 01WD06S001_02.18 01WD06S001_02.20 01WD06S001_02.22 01WD06S001_02.24 01WD07S001_02.18 01WD07S001_02.20 01WD07S001_02.22 01WD07S001_02.24 01WH05S003_T0_02.18 01WH05S003_T2_02.20 01WH05S003_T4_02.22 01WJ05S003_T0_02.18 01WJ05S003_T2_02.18 01WK05S003_T0_02.18 01WK05S003_T2_02.18 01WM05S001_T0_02.18 01WM05S001_T4_03.17 01WM05S004_02.18 01WM03S004_02.24 01WM03S004_03.09 DUNA VÍZ NYERSVÍZ - TARTÁLY KAVICSSZŐRİRE RÁMENİ KAVICSSZŐRİL LEJÖVİ SCAVENGER KATION CSERÉLİ ANION CSERÉLİ KEVERTÁGYAS IONCSERÉLİ
1,40E+03 1,20E+03 1,00E+03 8,00E+02 6,00E+02 4,00E+02 2,00E+02 0,00E+00 EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK PAKS 2009 FEBRUÁR KAVICSSZŐRİ_CSÍRASZÁM 01WD07S001_02.18. Kavicsszőrırıl lejövı víz DAPI CSÍRASZÁM (TKE/ml) 01WD06S001_02.18 01WD07S001_02.18 01WD06S001_02.19 01WD07S001_02.19 01WD06S001_02.20 01WD07S001_02.20 01WD06S001_02.21 01WD07S001_02.21 01WD06S001_02.22 01WD07S001_02.22 01WD06S001_02.23 01WD07S001_02.23 01WD06S001_02.24 01WD07S001_02.24 01WD06S003_02.18 01WD07S003_02.18 6,00E+05 5,00E+05 4,00E+05 3,00E+05 2,00E+05 1,00E+05 0,00E+00 festés epifluoreszcens mikroszkópos kép PAKS 2009 FEBRUÁR KAVICSSZŐRİ_SEJTSZÁM 01WD07S001_02.23. Kavicsszőrırıl lejövı víz DAPI festés epifluoreszcens mikroszkópos kép SEJTSZÁM (/ml) 01WD06S001_02.18 01WD07S001_02.18 01WD06S001_02.19 01WD07S001_02.19 01WD06S001_02.20 01WD07S001_02.20 01DW06S001_02.21 01WD07S001_02.21 01DW06S001_02.22 01WD07S001_02.22 01DW06S001_02.23 01WD07S001_02.23 01DW06S001_02.24 01WD07S001_02.24 01WD06S003_02.18 01WD07S003_02.18
EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK PÁSZTÁZÓ ELEKTRONMIKROSZKÓPOS VIZSGÁLATOK - SEM SCAVENGER GYANTA KATIONCSERÉLİ GYANTA
EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK ANIONCSERÉLİ GYANTA KEVERTÁGYAS IONCSERÉLİ GYANTA
EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK PAKS 2009 FEBRUÁR IONCSERÉLİK_SEJTSZÁM SCAVENGER 4,00E+05 3,50E+05 KATIONCSERÉLİ 3,00E+05 2,50E+05 2,00E+05 1,50E+05 1,00E+05 ANIONCSERÉLİ KEVERTÁGYAS IONCSERÉLİ 5,00E+04 0,00E+00 01WH05S003_T0_02.18 01WH05S003_T1_02.19 01WH05S003_T2_02.20 01WH05S003_T3_02.21 01WH05S003_T4_02.22 01WH05S003_T5_02.23 01WJ05S003_T0_02.18 01WJ05S003_T1_02.18 01WJ05S003_T2_02.18 01WJ05S003_T3_02.18 01WK05S003_T0_02.18 01WK05S003_T1_02.18 01WK05S003_T2_02.18 01WK05S003_T3_02.18 01WM05S001_T0_02.18 01WM05S001_T1_02.24 01WM05S001_T2_03.03 01WM05S001_T3_03.09 01WM05S001_T4_03.17 01WM05S001_T5_03.23 01WM05S004_02.18 01WM03S004_02.19 01WM03S004_02.24 01WM03S004_03.03 01WM03S004_03.09 SEJTSZÁM (/ml) KEVERTÁGYAS IONCSERÉLİ LAZÍTÓVIZE Epifluoreszcens mikroszkópos képek SCAVENGER KATIONCSERÉLİ ANIONCSERÉLİ KEVERTÁGYAS IONCSERÉLİ UA. LAZÍTÓVIZE
EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK DENATURÁLÓ GRÁDIENS GÉLELEKTROFORÉZIS (DGGE FEBRUÁR) ALAPJÁN KÉSZÍTETT HASONLÓSÁGI FA
ÖSSZEFOGLALÁS A vízelıkészítı üzem egyes pontjainál (kavicsszőrı, kevertágy) a rendszer fokozott mikrobaterhelését lehetett megállapítani Máshol jelentıs csíra- és sejtszám csökkenést figyeltünk meg (meszes lágyító, anioncserélı) erısen alkalikus ph (9-11) A mikroszkópos vizsgálatok (SEM) azt mutatják, hogy a gyanták sokszor töredeznek, minden gyantatípus felszínén találhatóak mikrobák, a gyantaszemek gyakran biofilm által kapcsolódnak, legterheltebbnek a kevertágyas gyanta tőnik A DGGE profilt illetıen elmondható, hogy a különbözı idıpontokban vett vízmintákban fellelhetı baktériumközösségek mintavételi helyenként egységesen csoportokba rendezıdtek
TOVÁBBI CÉLJAINK A vízelıkészítı üzem csırendszerében lévı biofilmbıl származó baktériumtörzsek tesztelése különbözı biocidekkel Ioncserélı gyanták kezelése különbözı hatóidıkkel és biocid koncentrációkkal ezzel párhuzamosan a gyanták ioncserélı tulajdonságában biocid hatására bekövetkezı esetleges változások monitorozása Laboratóriumi modellrendszer tesztelése biocid kezeléssel az erımő vízrendszerére adaptálható mikrobamentesítı eljárás kidolgozása A speciális táptalajokról nyert izolátumok csoportosítása (ARDRA), valamint a csoportreprezentánsok meghatározása 16S rdns elemzés alapján
A bemutatott vizsgálatokkal párhuzamosan több, az erımő ultra tiszta vizébıl, illetve a budapesti ivóvízhálózatból származó, a tudomány számára új taxonok polifázikus taxonómiai vizsgálata is lezajlott, melybıl nyert eredmények tudományos folyóiratban történı publikációja folyamatban van. Tóth, E.M., Bohus, V., Kéki, Zs., Homonnay, Z.G.,Schumann, P., Borsodi, A.K., Márialigeti, K. Hidropsixibacter pannonicus and Hidropsixibacter pallens gen. nov., sp. nov, 2 novel bacterium isolated from the ultra pure water of a power plant Makk, J., Homonnay, Z.G., Márialigeti, K., Borsodi, A.K., Kéki, Zs., Schumann, P., Tóth, E.M. Tahibacter aquaticus gen. nov., sp. nov, a novel bacterium isolated from water distribution system of Budapest Homonnay, Z.G., Makk, J., Márialigeti, K., Kéki, Zs., Schumann, P., Tóth, E.M. Brevibacterium aquaticum sp. nov, a novel bacterium isolated from water distribution system of Budapest
KÖSZÖNÖM A MEGTISZTELİ FIGYELMET