Genomikai vizsgálatok jelentősége a daganatterápiában Csuka Orsolya Országos Onkológiai Intézet Pathogenetikai Osztály Budapest 2011. április
Integrált kliniko-genomikai modell kialakítása a daganatos betegek személyre szabott orvoslására 1. Molekuláris staging Daganat progresszió 2. Primér tumorok genomikai mintázata Mutáció és génexpresszió Prognózis, új terápiás targetek 3. A daganat farmako-genomikai jellemzése Individualizált terápiás protokoll
Mikrometasztázisok kimutatásának stratégiája mrns Epithel eredet citokeratin RT-PCR Tumorspecifikus markerek RT-PCR CEA DNS károsodások 1. Primer tumorok genetikai károsodásának jelemzése p53, K-ras, APC 2. Mikrometasztázisok azonosítása DNS károsodás alapján
Keringő daganatsejtek izolálása Terápiás érzékenység DNS RNS Protein génpolimorfizmus hipermetiláció génexpresszió Molekuláris staging PET, CT, MRI
Keringő daganat sejtek Hipermetiláció vizsgálata Szérum DNS Primer tumor
Hipermetilált gének fej-nyak daganatokban ADAM23 Sejt adhézió, migráció Funkció APC CCNA1 CCND2 CDH1 CDH13 CST6 CXCL12 DAPK MGMT RARβ2 TNFRSF10D Sejt adhézió Sejt ciklus Sejt ciklus Sejt adhézió, invázió Sejt adhézió, invázió Proteáz inhibítor, invázió Limfocita aktiválás Apoptózis DNS-repair Transzkripció szabályozás, növekedés, differenciálódás Apoptózis
80% Hipermetilált gének fej-nyak daganatokban 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
Hipermetilált gének az emlő daganatok molekuláris altípusaiban Emlő cc altípusok Luminális A ADAM23 CCND2 TNFRSF10D HER2+ CCNA1 CDH1 CDH13 CST6 Bazális BRCA1 CCND2 Funkció Sejt adhézió, migráció Sejt ciklus Apoptózis Sejt ciklus Sejt adhézió, invázió Sejt adhézió, invázió Proteáz gátló, invázió Sejt ciklus, DNS repair, Apoptózis Sejt ciklus
Emlő daganatok metilációs vizsgálata 35 30 Luminal * 25 20 15 * Basal * HER2+ 10 5 0
Epigenetikus marker vizsgálatok jelentősége Korai detektálás Tumorok tipizálása metilációs mintázat alapján Molekuláris staging Prognózis Kemoszenzitivitás Monitorizálás
Rezisztencia faktorok vizsgálata Molekuláris staging Molekuláris módszerek alkalmazása a daganatterápiában Gén polimorfizmusok vizsgálata Terápiás target azonosítása
Daganatellenes szer 5 FU Taxán Platinum származékok Terápiás érzékenység predikciója fej-nyak daganatokban Polimorfizmus - Timidilát szintáz - MTHR - Dihidropirimidin dehidrognáz (DPD) - MDR1 polimorfizmus - EGFR, HER2 státusz - DNS repair gének (XPD, XRCC1 EGFR inhibitorok Cetuximab - EGFR (intron 1) polimorfizmus - EGFR (intron 1CA repeat)
Fej-nyak daganatok farmakogenomikai vizsgálata 1. DNA repair enzim polimorfizmus vizsgálata XPD cd 312, XRCC1 cd 399 n = 152 2. Taxan érzékenység vizsgálata MDR1 polimorfizmus n = 90 3. Célzott terápia tirozin kináz gátlók vizsgálata: DNS chip, EGFR polimorfizmus vizsgálata n = 90
XPD cd312 polimorfizmus genotípus megoszlása lokalizációnként 100 80 60 40 20 Homozigóta mutáns Homozigót a normál Heterozigóta 0 összes szájüregi garat gége normál heterozigóta mutáns
Taxán rezisztencia markerek vizsgálata fej-nyak daganatokban 1. MDR 1 polimorfizmus (27%) 2. MRP1, MRP2 O.E. (35%) 3. HER2 O.E. (32%) 4. HER2, EGFR O.E. (28%)
ABCB1/MDR1 exon12 C1236T polimorfizmus SSCP analízise N H H M H N N: normál homozigóta H: heterozigóta M: mutáns homozigóta normál homozigóta heterozigóta mutáns homozigóta
Erbitux Erlotinib Tirozin kináz gátlók alkalmazása HNSCC kezelésére Iressa Lapatinib
EGFR G 216T polymorphism Normal (GG) Mutant (TT) Heterozygous (GT) N H M
EGFR G 216T génpolimorfizmus fej-nyak daganatokban 50% Normal Heterozigóta Mutáns 40% 30% 20% 10% 0% 45,60% GG 40,00% GT EGFR genotípus 14,40% TT Erbitux rezisztencia n=152
Gyakoriság 21-21 20-21 20-20 18-21 18-20 18-18 17-20 16-21 16-20 16-19 16-18 16-17 16-16 15-21 15-16 14-18 20% 18% 16% 14% 12% 10% 8% Magas exp. EGFR intron 1 (CA repeat) genotípus fej-nyak daganatokban 63% Erbitux rezisztencia Alacsony exp. 6% 4% 2% 0% EGFR genotípus repeat szám
Gén polimorfizmusok vizsgálata fej-nyak daganatokban 1. Terápiás érzékenységet jelző génpolimorfizmusok (XRCC1, XRCC3, XPD) gyakorisága eltérő a daganat lokalizációja szerint. Eltérő CisPt érzékenység? 2. EGFR intron 1 alacsony CA repeat száma magas expresszióval társul (terápiásérzékenység predikciója) 3. Taxán rezisztencia predikciója MDR1 polimorfizmus alapján
Molekuláris vizsgálatok jelentősége terápiás terv kialakításában 1. Molekuláris staging 2. Primer tumorok molekuláris tipizálása 3. Rizikócsoportok kialakítása 4. Rezisztencia faktorok felderítése 5. Terápiás target jellemzése
Terápiás target jellemzése 1. Mutációs spektrum meghatározás 2. Allél vesztés (LOH) vizsgálata 3. Epigenetikus inaktiválás, metilációs mintázat
Tüdő cc. EGFR és K-ras mutáció TTF1 CK7 EGFR e19 wt EGFR e21 wt KRAS e2 mut
Tüdő adenocarcinoma K-ras és EGFR mutáció vizsgálata Mutáció EGFR e19 del EGFR e21 L858R KRAS e2 mut. Tarceva resist. KRAS e2 + EGFR e19 mut KRAS e2 + EGFR e21 mut Gyakoriság 12/92 (13%) 4/64 (6.3%) 22/77 (28.6%) 0/77 (0%) 2/55 (3.6%) N=250
P Raf1 P I B NF- B P MKP MP1 ERK 1/2 p90rsk Sejt proliferáció B-Raf A-Raf SOS MEKK1 P P P P P KSR MNK1/2 PAK Rap1 PP1/ PP2 Translation IKK c-raf MEK1,2 Integrins DAG GTP EPAC Rac FAK SHC GRB2 EGFR Signaling P SHC Src PKA Ca 2+ PLC VHR camp PI3K Hormones, Neurotransmitters SOS ZAP70 PKC SOS G N C TGR-CD3 Complex Ag ECM Ca 2+ Cytokines AC LAT GRB2 PLC GTP Mut RAS Growth faktor
A549 (mut K-ras) kezelése MEK ½ inhibitorral (Calbiochem) Sejtszám % 100,0 Kontrol Erbitux Erbitux + 300 μm MEK inh. 3 nm 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0
VEGF Vastagbél daganatok szignálátvitel útjai HGF EGF HGF mab Avastin C-MET Erbitux Insulin IGF-1mAb HER2 IGF-1R/ IR PI3K VEGFR RAS PIP3 PIP3 PDk1 PTEN Vatalanib Pazopanib Lapatinib Tipifarnib Sorafenib RAF MEK ERK SRC Everolimus COX2 4EBP AKT mtor mtor BAD FoxO3 Apoptosis Transcription AZD6244 PGE PIP3 Vorinostat Proliferation Differentiation Proliferation Invasion Survival Protein translation Hif-1α Angiogenesis
Erbitux és Irinotecan kezelés hatása K-ras wt és mt vastagbél sejtvonalakra Gátlás% 100 80 Kontrol HT/29 wt Erbitux 300 M Irinotecan 5 M SW620 mt Kontrol Erbitux 300 M Irinotecan 5 M Erbitux + Irinotecan 60 Erbitux + Irinotecan 40 20 0
ERK1 JNK1 JNK pan p38g p38d RSK1 GSK-3a/b Akt1 Akt2 ERK2 JNK2 p38a p38b RSK2 GSK-3b Akt3 Akt pan JNK3 MSK2 HSP27 p70 S6 Kinase 60 HT/29 sejtvonal foszforilációs szintjeinek változása erbitux és irinotecan kezelés hatására Kontroll ERK Kezelt 40 20 AKT 0-20 HT/29 HT/29 E+I Változás% -40 ERK1 AKT3-60 ERK2-80
EGFR és HER2, MEK, BRCA1 knock out variánsok kialakítása srnai technikával; gén expressziós mintázat meghatározása oligo DNS chip-el
Synaptic Signaling Translation p70s6k 4EBP1 eif4e Protein Synthesis Cell Survival Akt Signaling G GTP mtor ERK Pathway Blocks Apoptosis 14-3-3 GP CR TSC2 Raf1 XIAP P BAD Chk1 PIP3 Regulation of Cyclic Nucleotide TSC1 P Ser87 P p21(cip1) p27(kip1) 14-3-3 P CREB P P MDM2 PI3K P PDE3B Growth Factors PDK-1 RT K GAB2 Caspase Cascade Caspase9 IRS1 P P EGFR és HER2 kiütés PI3K Akt Akt PIP2 CTMP HSP90 CDC37 PTEN PIP3 PP2A PDK-1 P P GSK3 JIP1 AR ASK1 Sejt proliferáció PI3K DNA-PK Akt gátlás
Kont Tax Erb Erb + Tax K-EGFR Tax Erb Erb + Tax Akt expresszió EGFR knock out fej-nyak daganat xenograftban GAPDH % FaDu EGFR+ FaDu EGFRØ 120 100 80 60 40 20 0 FaDu EGFR+ FaDu EGFR Knock Out
EGFR knock out fej-nyak daganat xenograft terápiás érzékenysége Tumor gátlás a kontroll %-ában 51 napos tumor esetén 120% EGFR Knock out EGFR + 100% Detroit 562 Detroit 562 normál 80% 60% gátlás szignifikanciája: p<0,001 40% 20% 0% Taxoter 1x30 mg/kg 3x15 mg/kg 1x30 mg/kg 3x15 mg/kg EGFR- EGFR+
EGFR, HER2 knock out daganattenyészetek alkalmazása Új gyógyszerek screenelése Szignál-átviteli utak felderítése Gyógyszerkombinációk preklinikai vizsgálata (tirozin kináz gátlók, aromatáz gátlók, antiestrogének, sugárterápia, CisPt. etc.)
Célzott terápia rezisztencia faktorai 1. 1 Alternatív növekedési szignál átviteli utak aktiválása 2. 2 Mutációk kialakulása szignál átvitelben részt vevő génekben (K-ras, PI3K mutációk) 3. 3 Sejtproliferációt gátló gének inaktiválása (PTEN LOH, Herceptin rezisztencia)
Resistance mechanisms originating from EGFR downstream effectors EGFR/EGFR EGFR/ErbB3 Src STAT5b STAT3 Raf Grb2 Sos Ras PIP 2 P21 PI3K PTEN PIP 3 AKT MEK P27 mtor BAD Erk cycd1 CCND1........... M G1 G2 S Apoptosis CDKN1B Myc VEGF BCL-XL
PTEN allélvesztés emlő daganatokban M539 N M539 N Kontroll Kontroll M539 T HER2 pozitív M539 T Triple negatív D10s2491 LOH D10s541 LOH
P3 kináz és PTEN mutáció emlő daganatokban M632 T c.42_48del Deléció a PTEN 1. exonban M531 T A>C (Q546P) Pontmutáció a PIK3CA 9. exonban
Szerérzékenységet meghatározó genomikai változások emlő daganatokban 80 70 Triple negatív HER2 pozitív 60 50 40 30 20 10 0 PTEN LOH 43,5 % 69,6 % BRCA1 LOH PTEN PTEN LOH PIK3CA mut mut 6,5 % 12,2% 20 % BRCA1 LOH PIK3CA mut 29,2 % 25 % PTEN mut 1 %
Célzott terápiával szembeni rezisztencia megszüntetése 1. Target molekula mutációja Új TK inhibítor alkalmazása Pl.: Imatinib helyett Nilotinib, Sorafenib alkalmazása 2. Alternatív szignál átviteli út aktiválása Multikináz inhibítorok alkalmazása 3. Alacsony klinikai válasz célzott terápiára Kombinációs terápia alkalmazása
Genomikai vizsgálatok jelentősége a daganatterápiában 1. 2. 3. 4. 5. Genomikai markerek alkalmazása molekuláris stagingre Terápiás target azonosítása mutációinak azonosítása Rezisztencia faktorok vizsgálata A daganat farmako-kinetikai jellemzése génpolimorfizmusokkal Daganattípusra jellemző szignálutak felderítése 6. Individualizált terápiás protokollok kialakítása