Invazív mintavételi módszerek valamint a szövettani vizsgálat és bakteriológiai technikák szerepe a tüdo és pleura tuberkulózis gyors diagnosztikájában Doktori (Ph.D.) értekezés Dr.Lantos Ákos Témavezeto: Dr. Somoskövi Ákos Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar Budapest Pulmonológiai Klinika Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, Budapest, 2004 1
1. Tartalomjegyzék 1. TARTALOMJEGYZÉK 2 2. RÖVIDÍTÉSEK 6 3. BEVEZETÉS 7 3.1. Általános bevezetés 7 3.1.1. A Mycobacterium tuberculosis complex és a tuberkulózis 7 3.1.2. A tuberkulózis epidemiológiája 9 3.1.3. A mintavétel 11 3.1.3.1.Noninvazív mintavétel tüdo tbc-ben 11 3.1.3.2.Invazív mintavételi módszerek. 11 3.1.4. A tuberkulózis laboratóriumi diagnosztikájának alapjai 13 3.1.4.1.Mikroszkópos vizsgálat 14 3.1.4.2.Tenyésztés 15 3.1.4.3.Hagyományos és molekuláris identifikálás 16 3.2. Invazív mintavételi módszerek 17 3.2.1. Bronchoszkópos mintavételi módszerek 17 3.2.2. Mintavétel a pleurából 18 3.3. Mycobacterium tuberculosis izolálás az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszeren, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és Löwenstein-Jensen táptalajjal 20 2
3.4. Molekuláris módszerek alkalmazása a Mycobacterium tuberculosis complexen belüli gyors identifikálásra és differenciálásra 21 4. CÉLKITUZÉSEK 26 5. MÓDSZEREK ÉS ESZKÖZÖK: 27 5.1. Invazív mintavételi eszközök és módszerek tüdo és pleura tuberkulózisban 27 5.1.1. Bronchoszkópos mintavételi módszek 27 5.1.2. Pleurapunkció és biopszia 28 5.1.3. Diagnosztikus pleuroszkópia 29 5.1.4. Szövettani feldolgozás 31 5.2. M tuberculosis izolálása az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszeren, összehasonlítva BACTEC 460 TB rendszerrel és Löwenstein- Jensen táptalajjal 31 5.2.1. Betegek és minták 31 5.2.2. Minta elokészítés 32 5.2.3. Leoltás 32 5.2.4. Kontrollok 32 5.2.5. Statisztika 33 5.3. Molekuláris módszerek alkalmazása a Mycobacterium tuberculosis complexen belüli gyors identifikálásra és differenciálásra 33 5.3.1. Esetismertetés ( Szibériai tigrisbol M bovis subsp. caprae) 33 3
6. EREDMÉNYEK 35 6.1.1. Bronchoszkópos mintavétel 35 6.1.2. Mintavételek a pleurából 37 6.2. A M tuberculosis izolálása automatizált BACTEC MGIT 960 rendszeren, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és Löwenstein- Jensen táptalajjal 39 6.3. Molekuláris módszerek alkalmazása a Mycobacterium tuberculosis complexen belüli gyors identifikálásra és differenciálásra 40 7. MEGBESZÉLÉS 42 7.1.1. Pulmonális tuberculosisban alkalmazott bronchoszkópos mintavételi technikák szerepe 42 7.1.2. Invazív mintavétel pleuritis exsudativa tuberculosa esetén 46 7.2. A M tuberculosis izolálása az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszeren, összevetve a BACTEC 460 TB rendszerrel és Löwenstein- Jensen táptalajjal 52 7.3. Molekuláris módszerek alkalmazása a Mycobacterium tuberculosis complexen belüli gyors identifikálásra és differenciálásra 56 8. ZÁRÓ KÖVETKEZTETÉSEK 58 8.1. Az invazív mintavétel szerepe 58 4
8.2. A folyékony és szilárd táptalajon való tenyésztés jelentosége 60 8.3. A Mycobacterium tuberculosis complexen belüli rutin differenciálás jelentosége 61 9. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 62 10. IRODALOMJEGYZÉK: 63 11. AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE 77 12. SAJÁT EGYÉB KÖZLEMÉNYEK ÉS KÖNYVRÉSZLETEK JEGYZÉKE 78 13. ÖSSZEFOGLALÁS 84 14. SUMMARY 85 5
2. Rövidítések: BCG BAL BSC BSCa DNS EMB HIV INH IUATLD LJ M MDR MGIT MTBC NAT PCR PPD PZA RMP RNS SM tbc TCH TNM ZN Bacillus Calmette-Guerin bronchoalvolarais lavage bronchofiberoszkóp bronchofiberoszkópia dezoxiribonukleinsav ethambutol humán immundeficientia vírus isoniacid International Union Against Tuberculosis and Lung Disease Löwenstein-Jensen Mycobacterium multidrog rezisztens tuberkulózis Mycobacterium Growth Indicator Tube Mycobacterium tuberculosis complex nukleinsav amplifikációs technikák polymerase chain reaction, polimeráz láncreakció Purified Proteine Derivate pirazinamid rifampicin ribonukleinsav streptomycin tuberkulózis tiophen-2-carboxil sav hidrazid tuberkulózist nem okozó mycobacteriumok Ziehl-Neelsen 6
3. Bevezetés 3. 1. Általános bevezetés 3.1.1. A Mycobacterium tuberculosis complex és a tuberkulózis Szervesanyag bontó képességük folytán, a Mycobacterium genus legtöbb tagja a talaj és a felszíni vizek hasznos lakója. Néhány mycobacterium faj azonban az evolúció során kórokozóvá vált. Ezek közül is a Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) vált a legjelentosebbé. A komplex tagjai (M tuberculosis, M bovis, M bovis bacilus Calmette- Guerin {BCG}, M africanum, M microti, M canettii, M pinnipedii, M bovis subsp. caprae) között virulenciájukat, pathogenitásukat és a gazdaszervezetet tekintve jelentos különbségek észlelhetok (74, 110). Foleg humán pathogén (23, 56, 124) a M tuberculosis, M africanum és a M canettii, a M microti (128) elsosorban rágcsálók megbetegedését okozza, bár néhány humán esetet is leírtak. A M bovis (9, 48, 81) humán és állati (szarvasmarha, kecske, elefánt, szarvas, nagymacskák, fóka stb.) megbetegedést is okoz. A bacilus Calmette-Guerin epe tartalmú táptalajon 213 átültetéssel attenuált vakcina törzs, amely azonban az immunrendszer meggyengülése esetén betegséget okozhat (22). A komplexen belüli virulencia különbség leginkább a M tuberculosis és a M bovis összehasonlításakor látható. A M bovis okozta humán fertozések száma jóval kisebb a M tuberculosis eredetu megbetegedésekhez képest. Az is megfigyelheto, hogy a M bovis-sal fertozötteknél a közeli kontaktok között jóval kevesebb a megbetegedések száma, mint M tuberculosis esetében (45). Bár a komplex egyes tagjai között mintegy 99, 9%-os, a dezoxiribonukleinsav (DNS) azonosság, fenotípus szintjén kevesebb, mint 65%-os a hasonlóság (19, 20, 84). Ezért ezeket a baktériumokat inkább alfajoknak, mint egymástól önálló specieseknek tartják. A tuberkulózist (tbc) a MTBC fertozés okozza. Valamennyi szerv tbc-s betegsége elofordulhat, de a leggyakoribb kórformában a tüdo tbc. Itt különféle mediátorokat termelo alveoláris makrofágok és lymphocyták felszaporodása és aktivációja, és ennek 7
következményeként T helper lymphocyta/makrofág alveolitis kialakulása figyelheto meg a fertozés helyén (34, 98, 99, 108, 109). A tbc a tünetmentes fertozéstol kezdve (latens tbc fertozés) a gyorsan progrediáló fatális megbetegedés formáját is öltheti (12). A klinikai megjelenés széles spektruma azt is jelzi, hogy a tbc-ben az immunválasz nemcsak a fertozés leküzdéséhez, hanem szöveti károsodás kialakulásához is vezethet (34, 98, 99). A pleuritis tuberculosa a leggyakoribb extrapulmonalis tbc-s betegség, mely a tbc primer és postprimer stádiumában, ill. a tüdo tbc endogén exacerbációban is kialakulhat. A XX. század közepéig, gyakorisága miatt, a pleuritis tuberculosa a pleuritis exsudativa szinonimájaként szerepelt (58, 64). Az exsudativ pleuritisek tbc-s eredete a nyugati államokban 0,1-0,2 %, míg a fejlodo országokban 30-86 % (33). A fejlett világban tbc-s pleuritis kialakulása egyre idosebb korra tolódik, a betegek harmada 60 év feletti (33). A pleura tbc az epidémia által sújtott harmadik világban foleg a fiatalok betegsége. Ma a diagnosztikus problémát jelento, tüdo röntgen elváltozás nélkül mellkasi folyadék formájában jelentkezo tbc-s pleuritis foleg korai postprimer szervi tbc-nek tartható. Ez a M szenzitált szervezetben M fehérje indukálta hiperszenzitív immunreakció révén alakul ki (63, 94). A pleuritis tuberculosa leggyorsabb, 24 órán belüli eredményt adó, diagnosztikus módszere, a pleurabiopszia és a szövettani vizsgálat (32, 33, 64). A pleura minta legegyszerubben tubiopsziával vagy a nagyobb beavatkozást jelento pleuroszkópiával nyerheto (32, 33, 64, 66-69). Bár a szövettani vizsgálat gyorsasága és érzékenysége kiváló, a M rezisztenciáról nem nyújt információt, ami pedig a korrekt terápiához elengedhetetlen (32, 33). A tbc-s pleuritis spontán gyógyhajlama jó, de antituberkulotikus kezelés nélkül 5 éven belül a betegek több mint 60%- 8
ában pulmonalis vagy más szervi tbc alakul ki, vagyis a tbc pleuritis gyógyszeres kezelése más szervi tbc-s kórformákhoz hasonlóan elengedhetetlen (32, 33, 58, 68). 3.1.2. A tuberkulózis epidemiológiája A tbc továbbra is jelentos népegészségügyi gondot jelent a Föld nagy részén. Világszerte évente mintegy 8 millió ember betegszik meg újonnan és 2 millió ember hal meg csak tbc következtében. A Föld lakosságának egyharmada M tuberculosis-sal fertozött (6, 7, 12). A tbc okozza az elvileg elkerülheto felnottkori halálokok 25%-át. A megbetegedettek 80%-a gyermek ill. a 15-59 éves korosztályhoz tartozik (6, 7, 12). Az Egészségügyi Világszervezet elorejelzése alapján 2000 és 2020 között közel 1 milliárd ember válik újonnan fertozötté és közülük 200 millió betegszik meg. A 200 millió betegbol 35 millió meghal, ha a tbc elleni védekezés nem erosödik számottevoen (6, 7). A M tuberculosis-sal fertozötteknél az élet során kb. 10%-ban biztosan kialakul tbcs megbetegedés. A humán immundeficientia vírussal (HIV) fertozöttek 10%-ában várható tbc megbetegedés kialakulása, mégpedig az M expozíciót követo egy éven belül (6, 7, 12, 98, 99, 101). A tbc ismételt fellángolásában elsosorban gazdasági és szociális tényezok, a HIV vírus és a tbc közötti szinergizmus (világszerte az AIDS betegek 15%-a hal meg tbc-ben), és a XX. század végén újabb komoly fenyegetésként megjelent rezisztens és multidrog rezisztens tbc (MDR) - vagyis rezisztencia legalább isoniazidra és rifampicinre - terjedése játszik kiemelkedo szerepet. Az Egészségügyi Világszervezet adatai szerint 1995-ben mintegy 50 millió ember volt fertozött rezisztens M tuberculosis törzzsel (25, 101). Magyarországon a tbc incidenciája az 1950-es (490 per 100.000 lakos) évektol kezdve 1990-ig (34 per 100.000 lakos) fokozatos csökkenést mutatott, mintegy évi 11,1%- os átlagos ütemben. 1991 és 1996 között azonban, egy évi átlagos 1,3%-os átmeneti emelkedés volt észleheto (1996-ban 42 per 100.000 lakos). Ezt követoen ismét az incidencia 9
csökkenése volt jellemzo, de az 1990-es szintet csak 2000-ben sikerült ismét elérni (3). 2000-ben a tbc incidenciája 35,82 per 100.000 lakos 2002-ben 29.54 volt. Érdekesség, hogy az egyes megyék incidenciája kifejezett területi eloszlásbeli különbséget mutat. A legnagyobb incidencia Budapesten, Pest megyében illetve két észak-keleti és két dél-nyugati megyében volt észlelheto. Az ország lakosságának csaknem a fele, (4,6 millió lakos), él ezeken a területeken. A jelzett területek magasabb incidenciájának oka a szomszédos, ugyancsak magas incidenciájú országokból (pl. Románia) érkezo fekete munkások, illetve az itt lakók rosszabb gazdasági-szociális helyzete lehet (keleti országrész). Budapesten a magasabb incidencia egyik oka a hajléktalanság lehet. Az egyik legfontosabb és legtöbb gondot jelzo tény az új esetek mycobacteriológiai (ill. szövettani) verifikációjának alacsony aránya (41,4 %), valamint betegek izolátumaiból végzett kis számú rezisztencia vizsgálat. A csekély bakteriológiai pozitivitásnak számos oka lehet, így az új és érzékenyebb tenyésztési módszerek (folyékony táptalaj alapú rendszerek) valamint eljárások (nukleinsav amplifikációs módszerek) rutinszeru alkalmazásának hiánya is (105, 106). Az összbetegszámra vetített rezisztens betegek aránya 2002-ben 15,4 % Magyarországon, de into jelnek tartható, hogy a már korábban kezelésben részesült betegcsoporton belül a betegek több mint egy negyede (27,3 %) legalább egy antituberkulotikummal szemben rezisztens volt. A MDR esetek aránya 2002-ben, a korábban még nem kezelt betegeknél 3,2 %, a már kezelt betegcsoportban 9,9 % volt, vagyis 2000-hez képest nott. Ez arra utal, hogy a MDR tbc Magyarországon problémává válhat. Mivel az INH rezisztencia elofordulási gyakorisága a még kezeletlen betegcsoportban nagyobb, mint 4 % (5,9 %), az antituberkulotikus kezelést az isoniazid (INH), rifampicin (RMP), pyrazinamid (PZA) és ethambutol (EMB) négyes kombinációjával kell kezdeni, a hazai és nemzetközi ajánlásoknak megfeleloen (2, 13). 10
3.1.3. A mintavétel 3.1.3.1. Noninvazív mintavétel tüdo tbc-ben A laboratóriumi lelet minoségének meghatározó tényezoje, a mintavétel minosége (41). A leggyakoribb tbc-s megbetegedés a tüdo tbc, ahol a légúti váladék mycobacteriológia vizsgálata diagnosztikus jelentoségu (10, 31, 59, 73). Tüdo tbc gyanúja esetén a betegtol 3-5 különbözo napon, (az antituberkulotikum kezelés megkezdése elott), reggel, vízzel való szájöblítést követoen nyert, 2-10 ml-nyi alsólégúti köpetmintát kell steril edényben, minél rövidebb idon belül a laborba küldeni. A mintavétel ideje 1 óránál ne legyen hosszabb, a 24 órás gyujtött köpet nem jó vizsgálati anyag. A köpetminták késobbi, laboratóriumi dekontaminálása nem teszi feleslegessé a steril mintavételi muanyag csövek használatát. A minták lehetoség szerint 24 órán belül feldolgozandók. Ha erre nincs mód, az anyagot 4?C-on kell tárolni. A minták több napos tárolása így is kerülendo, mert rontja a tenyésztés szenzitivitását. Ha a tüdo tbc gyanúval vizsgált beteg köpetet nem tud adni, indukált köpet vizsgálata is szóba jön. Itt 10-15%-os, hipertóniás só aeroszoljának belégzésével provokálják a légúti váladék-ürítést (41, 52, 73, 75). Gyakorlati tapasztalat, hogy az asthma diagnosztikában aspecifikus provokációként használt, különbözo hypertoniás sóoldat inhalációk eros váladékozást és köhögést okoznak. Ez a módszer a mintavevo helyiség levegojének kifejezett, fertozésveszélyes kontaminációjával jár, mely speciális védointézkedéseket tesz szükségessé, különben az ott dolgozókat jelentosen veszélyezteti (41, 52, 73, 75). 3.1.3.2. Invazív mintavételi módszerek Pulmonalis tbc gyanújánál invazív mintavételi módszerek alkalmazása akkor indokolt, ha a beteg nem tud köpetet adni, vagy a köpet mikroszkópos vizsgálattal negatív. Hatékony, orvost nem igénylo mintavételi eljárás a gyomorszivadék, vagy gyomormosó folyadék vétele mycobacteriológiai vizsgálatra. Itt 3 különbözo napon reggel vett éhomi gyomornedv képezi a 11
mintát. (A gyomorban apatogén Mycobacterium gastri lehet, vagyis a direkt mikroszkópos vizsgálat eredménye önmagában nem kórjelzo saválló pozitivitás esetén (52). A klinikai képpel egybevetve azonban értékelheto a gyomornedv ZN pozitivitás tbc bizonyítékaként is). A módszer hatékonysága 50% körüli lehet precíz metodika használata mellett. Az irodalom szerint különösen gyermekeknél hasznos (31, 59). Intézetünkben felnotteknél is használható módszernek bizonyult, bár, talán a technikából adódóan, szerényebb érzékenységgel. A környezetet kevésbé terheli, mint az indukált köpetvétel. További mintavételi eljárás a gégetampon, mely kiment a gyakorlatból (31). Mélylégúti mintát nem köhögo, köpetet adni nem tudó betegnél, bronchofiberoszkópiával nyerhetünk, mely különösen akkor kézenfekvo, ha egyéb betegség, többnyire bronchus tumor gyanúja miatt különben is felmerül a bronchoszkópia indikációja. A bronchofiberoszkópia általában helyi érzéstelenítésben, ambulánsan is végezheto vizsgálat (87). A trachea mosást, mely az egyik, jelen munkában felhasznált cikkünkben szerepel, csak kényszerbol, megfelelo hosszúságú muszer hiánya miatt használtuk (200 kg-os tigrisnél történt a beavatkozás bronchofiberoszkóppal. A muszer markolati része már az altatott állat szájában volt, a trachea bifurcatio mégis csak a távolban látszott.). A trachea punkciót (76), mely a merev bronchoszkópia alternatívája volt bacteriológiai mintavételre, invazivitása miatt, ma már nem használják. Bronchoszkópos mintaként használható a bronchus szivadék is (31), de hatékonyabb a kóros területrol végzett bronchoalveolaris lavage (BAL) (88). Parenchymás vagy disszeminált tüdoelváltozásnál a bronchoszkópos parenchyma biopszia a választandó eljárás, mely a mosással egy beavatkozás során elvégezheto. Az említett módon nyert valamennyi váladék ill. szövetminta, valamennyire a szájgarat flórával szennyezett, és valamelyes dekontaminációt igényel, ennek szükséges intenzitása azonban a szennyezettség függvénye (73). A drasztikus dekontamináció rontja a M-k kitenyészthetoségét. 12
Sterilen vett folyadék- és szövetminták dekontaminálást nem igényelnek. Ilyen minták nyerhetok, a leggyakoribb extrapulmonalis tbc-s betegség, a pleuritis tuberculosa esetén (32, 33, 64, 66, 67). A pleuritis serosa tuberculosánál a punkcióval nyerheto lymphocytás exsudatum mikroszkópos vizsgálata mindig negatív, ezért a ZN festés felesleges (32, 33, 64, 66). A pleuralis folyadék M tenyésztési pozitivitása akkor is csekély, ha a primer pleuralis és parapulmonalis tbc-s pleuritiszes kórformát együtt nézzük. A diagnózis leggyakrabban és leggyorsabban a jellegzetes szövettani kép alapján hisztológiai vizsgálattal igazolható (II, IV) (33, 64, 67-70). A mintavétel legegyszerubb módja a costalis fali pleura tubiopsziája (II, IV) (33, 54, 64, 66, 68-70). Ennél jóval nagyobb beavatkozás a diagnosztikus pleruroszkópia, mely valamennyi pleura felszínrol, vizuális ellenorzéssel, célzott mintavételt és nagyobb szövet mennyiséget biztosít, szövettani és mycobacteriológiai vizsgálatokra, de tbc diagnosztikához általában a tubiopszia is elégséges (33, 64, 69). 3.1.4. A tuberkulózis laboratóriumi diagnosztikájának alapjai: A klinikai mycobacteriológia alapveto szerepet játszik a tbc elleni védekezésben, hiszen a tbc definitív diagnózisának felállításához nélkülözhetetlen feltétel a kórokozó baktérium izolálása és identifikálása. Önmagában a klinikum, valamint a radiomorfológiai kép a mycobacteriológiai vizsgálatok hiányában nem eléggé specifikus a tbc-re, hiszen hasonló panaszok és radiológiai eltérések más tüdobetegségben is elofordulhatnak (117), sot a röntgenkép alapján gyakran az aktív tbc és egy korábban lezajlott folyamat maradványai között sem lehet különbséget tenni (117). A mycobacteriológiai vizsgálatok a kezelés 13
hatásosságának monitorozásához is elengedhetetlen információkat szolgáltatnak, részben a kórokozó kimutatásával, másrészt az izolálást követo rezisztencia vizsgálatok eredményével. A korrekt bakteriológiai diagnózis feltétele, a megfelelo minoségu minta. Az adekvát mintavételt a legmodernebb laboratóriumi technikák sem tudják pótolni. A mintavételnél, az anyag minoségén túl, a minta mennyisége, és a minták és mintavételi napok száma fontos (32, 54, 64). 3.1.4.1. Mikroszkópos vizsgálat A mikroszkópia a mycobacteriológiai vizsgálatok legolcsóbb, legegyszerubb és leggyorsabb módszere. A kenetkészítést követoen a festés vagy Ziehl-Neelsen (ZN) szerinti karbol fukszin alapú vagy auramin alapú fluoreszcein eljárásokkal történhet (40, 53, 79, 96, 104, 133). A mikroszkópia legnagyobb hátránya, hogy nem kelloen érzékeny és a negatív eredmény kiadásához minimum 100-300 látótér áttekintése szükséges, ami meglehetosen munkaigényes (52, 103, 104, 110). A mikroszkópia érzékenysége, az adott beteg populáción belül, a kiterjedt tbc-ben szenvedo betegek hányadától, a vizsgált minta típusától, a mintagyujtés minoségétol, a mycobacteriumok mintán belüli számától, az alkalmazott dekontaminálási és centrifugálási módszertol függ (5, 103, 104). Míg a pozitív mikroszkópos eredmény a tbc diagnózisa mellett szól, addig a negatív eredmény, az alacsony érzékenység miatt, nem zárja ki annak lehetoségét. Legalább 10.000 M milliliterenkénti jelenléte szükséges ahhoz, hogy egy kenet teljes átvizsgálását követoen, legalább néhány saválló pálca megfigyelheto legyen (52, 103, 110). A mikroszkóposan pozitív betegek megkülönböztetett figyelmet igényelnek, mert ezek a betegek a legfertozobbek. Azért, hogy a szükséges beteg izoláció idoben megtörténhessen, a mikroszkópos vizsgálat eredményét a laboratóriumnak 24 órán belül jelezni kell (41, 52, 103, 107). Fontos tény, hogy a mikroszkópia nem tud különbséget tenni élo és elpusztult mycobacterium között, ezért egy megfeleloen kezelt beteg esetében, a mikroszkópos 14
negatívvá válást követo, esetleges pozitivitás, nem feltétlenül a klinikai romlás jele. A mikroszkópos vizsgálat nem képes differenciálni a MTBC és a tbc-t nem okozó mycobacteriumok (TNM) között (107, 110), vagyis a kenet pozitivitást atípusos mycobacterium is okozhatja, amely nem biztos, hogy kórokozó (107, 110). 3.1.4.2. Tenyésztés A mycobacteriológiai vizsgálatok következo lépése a tenyésztés, amely továbbra is nélkülözhetetlen a következo okok miatt: 1) a tenyésztés érzékenysége nagyságrendekkel nagyobb, mint a mikroszkópiáé, 2) a M tuberculosis complexen belüli differenciáláshoz, a különbözo TNM azonosításához, a molekuláris epidemiológiai vizsgálatok (DNS ujjlenyomat vizsgálat), kello nagyságú biomasszát igényelnek, amelynek létrehozásához tenyésztés szükséges, 3) a rezisztencia vizsgálatok elvégzéséhez élo kórokozót ugyancsak a tenyésztés biztosít (107). A mycobacteriumok izolálására használt legismertebb táptalaj a tojás alapú, szilárd Löwenstein-Jensen (LJ) táptalaj. Az agar alapú táptalajoknál, mint amilyen a Middlebrook 7H10 vagy 7H11 agar, a LJ táptalajhoz képest kissé rövidebb a tenyésztési ido, és e táptalajok transzparenciája miatt, egyszerubb a kolónia morfológia vizsgálat (52, 96, 107, 110). Ezeken a hagyományos szilárd táptalajokon, a kis csíraszámú mintáknál a MTBC telepei általában 6-8 hét után jelennek meg. Az izolálást követo identifikálás, majd rezisztencia meghatározás további 3-6 héttel növelheti ezt, az amúgy sem rövid idot (52, 96, 107, 110). Mindemellett vizsgálatok bizonyítják, hogy csak szilárd táptalajon tenyésztve, a klinikailag egyértelmuen tbc-ként diagnosztizált esetek mintegy 20-30%-ban nem sikerült a M tuberculosis izolálása (17, 95, 105, 106, 119). Ez az adat jelzi, hogy a szilárd táptalajon való tenyésztés érzékenysége, bár lényegesen jobb, mint a mikroszkópiáé, mégsem több mint 70-80%. Folyékony táptalajon a tenyésztési ido, a minta mycobacterium tartalmától függoen, 1-3 hétre rövidítheto, emellett a folyékony táptalajok szenzitivitása 90% feletti. Hátrányuk, hogy 15
jóval hajlamosabbak a befertozodésre (17, 95, 105, 106, 119). Jelenleg a legjobbnak a folyékony táptalaj alapú a BACTEC 460 TB rendszert tartják (Becton-Dickinson Diagnostic Instrument Systems, Sparks, Md., U.S.A.). Önmagában sem a szilárd, sem a folyékony táptalaj érzékenysége nem éri el a 100%-ot, azaz mindkét fajta táptalajnál elofordulhatnak olyan törzsek, amelyek, vagy csak az egyiken, vagy csak a másikon tudnak növekedni. Ezért jelenleg, a nemzetközi ajánlások a mycobacteriumok izolálására, legalább egy szilárd és egy folyékony táptalajt javasolnak a kórokozó detektálása, valamint a rezisztencia vizsgálatok minél gyorsabb elvégezhetosége érdekében (96, 115, 118). Ha növekedés nem észlelheto a beoltott szilárd vagy folyékony táptalajokon, akkor a negatív tenyésztési eredmény 8 illetve 6 hetes inkubálást követoen adható ki (105, 106). Mindezek miatt a kórokozó hatékonyabb, gyorsabb és kevésbé munkaigényes kimutatását biztosító újabb táptalajok, valamint a kórokozó direkt detektálását célzó egyéb módszerek (pl. direkt nukleinsav amplifikációs módszerek) kifejlesztése és a rutin klinikai diagnosztikába való bevezetése vált szükségessé. 3.1.4.3 Hagyományos és molekuláris identifikálás A nukleinsav amplifikációs technikáknak (NAT) a mycobacteriológiában való alkalmazása, a lassan tenyésztheto M tuberculosis, és a bizonyos speciális feltételeket igénylo, ezért nehezen izolálható TNM-ok direkt (közvetlenül a klinikai mintából) detektálásának gyors, 24 órán belüli lehetoségét teremtette meg (24, 30, 65, 107, 110-112). A NAT-k elméletileg akár egyetlen mycobacterium DNS tartalmát is képesek néhány órán belül több milliószorosára, azaz immár kimutatható mennyiséguvé sokszorozni. A mycobacteriumok direkt kimutatása mellett, a NAT és egyéb molekuláris biológiai módszerek (DNS hibridizáció, DNS szekvenálás stb.), napjainkra nélkülözhetetlenekké váltak, a MTBC és a Mycobacterium genus több mint 100 egyéb tagjának identifikálásában (számos faj csak NAT segítségével azonosítható), az antituberkulotikum rezisztenciával összefüggésbe hozható genetikai eltérések gyors detektálásában (RMP, PZA), valamint az epidemiológiai, illetve 16
immár molekuláris epidemiológiai vizsgálatok (spoligotyping, DNS ujjlenyomat vizsgálat) elvégzésében (107). 3.2.Invazív mintavételi módszerek 3.2.1.Bronchoszkópos mintavételi módszerek Nem köhögo vagy, köpetet adni nem tudó betegnél mélylégúti mintát legcélszerubben, bronchofiberoszkópiával (BSCa) nyerhetünk, mely általában helyi érzéstelenítésben történik. A BSCa a bakteriológiai mintavételen túl, egyúttal az endobronchialis makroszkópos diagnózis és szükséges biopszia lehetoségét is biztosítja, hiszen többnyire nem az egyszeru, klasszikus röntgen elváltozással járó, köpetet üríto tbc-s betegek kerülnek endoszkópos vizsgálatra. Bakteriológiai célra használható a kóros területrol szívott váladék (31, 32, 73, 88), de hatékonyabb a BAL, amikor is, a muszer végét a tüdoelváltozásnak megfelelo szegment hörgobe ékelve, 100-140 ml, testmeleg, fiziológiás sóoldatot, 20-25 ml-es dózisokban befecskendeznek és ezt enyhe szívással a bronchoalveolaris-térbol visszanyerik. Ez a folyadék, heparinizálás és szurés után cytológiai vizsgálatra, valamint mikroszkópos M vizsgálatra, ill. M tenyésztésre alkalmas (31, 88). A BSC-pal nyert minta kevésbé szennyezett a köpetnél, így NAT technikákra is alkalmasabb, és kevésbé intenzív elokészítést igényel, mely javíthatja a mycobacterium tenyésztés szenzitivitását (73, 110). További mintavételi lehetoség, a kóros területbe vezetett, bronchus keférol lemosott anyag BAL folyadékhoz hasonló feldolgozása (29). Új adatok szerint M avium-intracellulare complex okozta ZN negatív infekcióknál (N:16) a BAL 50%-ban ZN pozitív volt, a PCR 67%-ban, a tenyésztés 94%-ban igazolta a diagnózist. Ugyanakkor a kefebiopszia tenyésztés csak 36%-os pozitivitást adott, a kisszámú tüdobiopsziából pedig 40%-os volt a pozitív tenyésztés (116). 17
Parenchymás infiltratum, vagy disszeminált tüdoelváltozás esetén, bronchoszkópos parenchyma biopszia a választandó eljárás, mely a mosással egy ülésben végezheto. Ilyenkor, többnyire helyi érzéstelenítésben, ritkán altatásban, röntgen képerosíto alatt, a fiberoszkópon át a kóros tüdoterületbe bevezetett flexibilis excisorral több minta veendo a tüdo parenchymából. A szövetdarabok általában hisztológiai vizsgálatra kerülnek, de szövethomogenizálás után mycobacterium tenyésztés céljára is használhatók. Ezeket a szövetmintákat nem tartják sterilnek, vagyis bakteriális kontamináció lehetoségének megfeleloen kell a laborban feldolgozni. A szövettanra szánt minta formalinban fixálandó, ezzel szemben a tenyésztésre kerülo anyag fiziológiás sóban óvandó meg a kiszáradástól (41). 3.2.2. Mintavétel a pleurából A pleura biopszia fo indikációja, az ismeretlen eredetu, citológiailag tumorsejtmentes mellkasi exsudatum diagnosztikája. Az ismeretlen eredetu pleuralis folyadék leggyakoribb oka, a metasztatikus pleuritis carcinomatosa. A pleuritis tuberculosa viszonylag ritka, de ez a betegség az elozovel szemben gyógyítható, és a fertozo tüdo tbc vagy más szervi tbc megelozo stádiumaként fogható fel (I, II, IV) (31, 33, 58, 76). A pleuritis exsudativa leggyakoribb oka postprimer haematogén szórás. A tbc-s epidemiológiai helyzet függvényében ez lehet a fiatalkori mellkasi folyadékgyülemek leggyakoribb oka. Magyarországon a pleuritis tuberculosa incidenciája 2000-ben 1,3 százezrelék, 2001-ben 1,16 százezrelék volt (4). Európában a 40 év alattiaknál még ma is tbc a pleuralis folyadékgyülem leggyakoribb oka (64). A korai postprimer szórásból származó tbc-s pleuritis magától is meggyógyul (31, 59), antituberkulotikus kezelés nélkül azonban a pleuritis gyógyulását 5 éven belül, az esetek több mint 60 %-ában szervi tuberkulózis követi, mely leggyakrabban fertozo tüdo tbc (32, 33). 18
Mellkaspunctióval többnyire serosus, nem buzös, nem viszkózus, igen ritkán sanguinolens folyadék nyerheto (I, IV) (32, 33, 64, 69). A serosus tbc-s folyadék exsudatum biokémiai paraméterei közül az adenozin deamináz /ADA/ enzim koncentrációja emelkedik a folyadékban (IV) (32, 33, 64, 122). A cytológiai eltérésék a folyamat lymphocytás, fibrines gyulladás jellegébol fakadnak. A fehérvérsejtek több mint 80 %-a lymphocyta, számuk 2000/ml vagy több, a T-lymphocyta arány 90 % feletti (I) (32, 33, 64, 69). Bár a 80% feletti lymphocytát tartalmazó pleuritis tbc lehetoségét veti fel, valamennyi krónikus gyulladás, ill. a pleuritis carcinomatosa lymhocytás folyadékgyülemmel jár, így a lymphocytosis önmagában nem zárja ki a malignus eredetu folyadékot. A serosus folyadék centrifugátumának ZN kenete negatív. A M tenyésztés pozitivitása irodalmi adatok szerint 25% alatti (32, 33, 64). A pleuralis folyadék MTBC kimutatására használt NAT technikák eddig közölt szenzitivitása 20 és 80% közötti, a specificitás csaknem 100% (32, 90). Mivel a tbc-s pleuritis többnyire diffúz elváltozás; a zsigeri és fali pleurát is érinti, a pleura tubiopszia általában eredményes. A pleuritis tuberculosa diagnózisa a jellegzetes szövettani kép (lymphocytás, fibrines gyulladás, epitheloid sejtes, és Langhans sejtes necrotizáló, elsajtosodó, ill. el nem sajtosodó gümok) alapján adható ki. (II, IV) (78). A M ZN festéssel történo kimutatása tbc-s fali pleuramintában alig fordul elo. Differenciáldiagnosztikai szempontból granulomatosus pleuritisek jönnek szóba, így a sarcoidosis (mely pleurában nagyon ritka, inkább a visceralis pleura érintett, elsajtosodással nem jár és ezüstözheto perigranularis rostokat tartalmaz), rheumatoid pleuritis, elvileg idegentest granulomák (pl. talkum pleurodesist követoen) (78). Ha a pleura biopszia sem tbc-t, sem tumort nem igazol, diagnosztikus pleuroszkópia végzendo. Tbc-s pleuritisnél sok a fibrines adhézió (fibrin vitorlák), az oedemás, gyulladt pleurán, esetleg, olykor apró gümok láthatók. A beavatkozás során nem csak a costalis, 19
hanem a rekeszi és mediastinalis pleurából is lehet, vizuális ellenorzés mellett, szövetmintát venni. A fibrinvitorlákból is nagy mennyiség távolítható el, és ezt célszeru M tenyésztésre küldeni. A pleuroszkópiánál a bakteriológia és a hisztológia együttes szenzitivitása irodalmi adatok szerint 95% feletti (II) (33, 64, 66-70, 76). Bár a tubiopsziás szövettani minta hisztológiai vizsgálata gyorsan ad diagnózist, a korrekt kezeléshez szükséges M rezisztencia vizsgálatokhoz nem biztosít anyagot, ezért törekedni kell M tenyésztésre. 3.3. Mycobacterium tuberculosis izolálás az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszeren, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és Löwenstein-Jensen táptalajjal A Center for Disease Control and Prevention álláspontja szerint a MTBC izolálásának, identifikálásának, valamint az ezt követo rezisztencia vizsgálatoknak, lehetoleg a mintavétel idopontjától számított 2-3 (izolálás, identifikálás), illetve 2-5 (rezisztencia meghatározás) héten belül meg kell történni (1). Ahhoz, hogy ez a gyakorlatban is megvalósuljon, így a klinikusnak a tbc definitív diagnózisa, és a szükséges rezisztencia vizsgálatok eredménye mihamarabb rendelkezésre álljon, nélkülözhetetlen az újabb, folyékony táptalaj alapú rendszerek rutinszeru alkalmazása. A radiometriás BACTEC 460 TB folyékony táptalaj alapú rendszer (Becton Dickinson Diagnostic Instrument Systems, Sparks, Md.) alkalmazása jelentosen javította a mycobacterium tenyésztés érzékenységét, és megrövidítette a detektálás idejét. Ugyanakkor a tenyésztés még ezzel a módszerrel is munkaigényes és a radioizotóp használata miatt a speciális biztonsági eloírások és rendszabályok betartása szükséges (96). Korábbi felmérések szerint a 4-ml-es Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT; BBL Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Md.) és az MB Redox (Biotest AG, Dreieich, Germany) folyékony táptalajok a BACTEC 460 TB rendszer hatékony radioizotóp nélküli 20
alternatívái lehetnek (85, 86, 106). Ezek az eszközök azonban sok emberi munkát igénylo, nem automatizált rendszerek, amelyek leginkább azokban a laboratóriumokban használhatók, ahol nincs mód az automatizált módszerek bevezetésére, vagy kevés a feldolgozandó minta. A sok mintát tenyészto laboratóriumoknak az automatizálás igen fontos kérdés. Bár a közelmúltban kifejlesztett MB/BacT (Organon Teknika, Turnhout, Belgium) és ESP II (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) tenyésztési rendszerek teljesen automatizáltak, mindkét módszernél csekély a muszerek kapacitása (MB/BacT 240 cso gépenként; ESP II 384 cso gépenként) (17, 93, 119, 132). Nagyobb mintaszám esetén több muszerre is szükség lehet, ami jelentos költség. A BACTEC MGIT 960 rendszer nagy kapacitású, teljesen automatizált, a tenyésztést folyamatosan monitorozó, nem radiometriás rendszer, mely 960 darab 7 ml-es MGIT csövet képes egyszerre befogadni (42, 120). A tenyésztéshez használt MGIT csövek egy fluoreszcens szenzort tartalmaznak, mely a táptalaj oxigénkoncentrációjának csökkenésére reagál. A muszer fotodetektora minden csoben 60 percenként méri a fluoreszcenciát. A fluoreszcencia szintje megfelel a táptalajra leoltott mintákban lévo mikroorganizmusok által felhasznált oxigénszint csökkenés mértékének, ezáltal az osztódó baktériumok számának. Ha a fluoreszcencia mértéke egy határértéket elér, a szerkezet a csoben levo mintát pozitívnak értékeli, és jelzi ezt. Jelen tanulmány célja a MGIT rendszer szenzitivitásának és átlagos tenyésztési idejének a meghatározása volt a referencia BACTEC 12B és LJ szilárd táptalajjal összevetve, a MGIT rendszer rutin diagnosztikai alkalmazhatóságát értékelése céljából. 3.4. Molekuláris módszerek alkalmazása a MTBC-n belüli gyors identifikálásra és differenciálásra A MTBC az egymással igen közeli rokonsági fokban álló M tuberculosis, M bovis, M bovis BCG, és a ritkábban eloforduló M microti, M canettii, M pinnipedii és M caprae altípusokat foglalja magában (20, 121). A MTBC-en belüli differenciálás, azaz, az egyes 21
altípusok pontos identifikálása, elengedhetetlen a beteg gyógykezelésének optimalizálásához (a természetes PZA rezisztenciát mutató M bovis és M bovis BCG megbetegedéseknél nincs szükség PZA adásával terhelni a beteget), az egyes altípusok epidemiológiájának részletesebb megismeréséhez, legfoképpen azokon a helyeken, ahol jelenleg a tbc epidémia a legsúlyosabb, illetve ahol a M bovis állatról vagy állati termékekrol emberre való terjedése probléma. Ugyancsak fontos a M bovis BCG okozta megbetegedések azonosítása, hiszen ezt a törzset széles körben alkalmazzák daganatos betegek (elsosorban húgyhólyag rák) immunomoduláns kezelésére, akiknél differenciál diagnosztikai problémaként merülhet fel, hogy egy esetlegesen kialakult tbc, a kezelés szövodményeként jelentkezo fertozés, vagy a daganatos leromlás miatt a betegben már évek, évtizedek óta perzisztáló M tuberculosis fertozés endogén fellángolásának a következménye. Bár a MTBC hagyományos módszereken alapuló differenciálása nem bizonyult teljesen megbízhatónak és rutinszeruen alkalmazhatónak, mégis, ezen módszerek közül némelyik ma is hasznos lehet (121). Ezek a glicerines vagy piruvát tartalmú LJ táptalajon való növekedési preferencia, az ún. oxigén preferencia teszt (mikroaerofil vagy aerofil növekedés), a niacin és nitrát reduktáz tesztek, a kolónia morfológia vizsgálata, és a tiophen-2-carboxil sav hidraziddal (TCH) és PZA-dal szembeni rezisztencia vizsgálatok (38, 52, 91, 127). Fontos azonban megjegyezni, hogy a jelzett hagyományos vizsgálatok legtöbbjének elvégzése igen idoigényes (több hét) és az eredmények értékelése sok esetben meglehetosen szubjektív (leszámítva a rezisztencia vizsgálatokat) (52). A TCH rezisztencia vizsgálat a maga szintjén az egyik legmegbízhatóbban alkalmazható hagyományos differenciálási módszer. Az ún. klasszikus M tuberculosis törzsek TCH rezisztenciát mutatnak függetlenül az INH-val szemben mutatott érzékenységüktol (27). Az ún. ázsiai M tuberculosis törzsek és a MTBC összes többi tagja viszont TCH érzékeny (37). Emellett azt is megfigyelték, hogy az INH rezisztens M bovis törzsekben kereszt-rezisztencia alakul ki a TCH-val szemben (L. M Parsons még nem publikált megfigyelése). Bár a MDR 22
vagy polirezisztens M törzsek PZA ra is rezisztensek lehetnek, a PZA monorezisztencia szinte kizárólag csak M bovis és M bovis BCG törzsekben figyelheto meg (természetes rezisztencia) (38, 127). Mivel a M africanum fenotípusa mintegy köztes altípusként a M tuberculosis és a M bovis jegyeit is magán hordozza, a MTBC ezen tagját, korábban, M bovis afro-ázsiai variánsnak nevezték (72). Azonban, a M africanum pontos definiálása komplikáltabbá vált, amikor felismerésre kerültek bizonyos földrajzi területekhez kötheto variánsok (I variáns: M bovis-szeru nitrát negatív Nyugat-Afrikából származó típus; II variáns: M tuberculosis-szeru nitrát pozitív Kelet-Afrikából származó típus) (26). A rokonsági fok megállapításra alkalmazott egyik standard molekuláris biológiai módszer, a DNS-DNS hibridizációs vizsgálat során a MTBC négy tagját (M tuberculosis, M africanum, M bovis, M bovis BCG) vizsgálták és 85-100% DNS-DNS azonosságot észleltek (44). A 16S rdns szekvencia valamint a 16S-23S rdns spacer szekvenciák vizsgálata ugyancsak közel 100%-os homológiát igazolt (55). Emellett, 26 struktur gén, valamint 24 a gazda szervezet immunrendszerének célfehérjéjeként ismert proteint kódoló gén szekvencia analízise sem észlelt számottevo különbséget a MTBC tagjai között (77, 114). Ez a magas fokú szekvenciabeli azonosság azonban a mycobacteriológiai vizsgálatokat is megnehezíti, mivel a jelenleg alkalmazott DNS hibridizáción alapuló identifikálási tesztek, valamint a direkt nukleinsav amplifikációs tesztek többsége a 16S rdns szekvencián alapul. Így a MTBC egyes tagjai, ezen módszerek segítségével, nem differenciálhatóak. További gondként merült fel, hogy a MTBC három új, nemrégiben leírt altípussal (M canettii, M caprae, és M pinnipedii) is kiegészült, amelyek szintén nem különíthetoek el, sem egymástól, sem a MTBC többi tagjától, a fent jelzett molekuláris módszerekkel (9, 124, 134). Mindezeknek a nehézségeknek ellenére a M tuberculosis genom feltérképezésével számos új lehetoség nyílott a MTBC tagjainak differenciálását illetoen. Ezek a módszerek bizonyos géneken (gyra, gyrb, oxyr, katg) megfigyelheto jellegzetes allélek (mutációk), repetitív régiók megléte, vagy hiánya, DNS ujjlenyomat mintázat (ún. spoligotyping), valamint egyes 23
gyógyszerekkel (PZA) szembeni rezisztenciához társuló mutációk kimutatásán alapulnak (47, 49, 82, 100, 113, 125, 126) (3.4.1. táblázat). A jelzett módszerekbol egy olyan rutin diagnosztikai panelt állítottunk össze, amelynek humán és állatorvosi diagnosztikai valamint közegészségtani szerepét és hasznosságát egy, a budapesti Fovárosi Állat- és Növénykertben, egy szibériai tigris megbetegedése kapcsán értékeltük. 3.4.1. táblázat. A M tuberculosis complex-en (MTBC) belüli genetikai különbségek Variábilis allélek: oxyr nukleotid 285: A a M bovis-ban G a MTBC egyéb tagjaiban pnca nukleotid 169: G az M bovis-ban és az M bovis BCG-ben C in a MTBC egyéb tagjaiban Grp1 Grp2 Grp3 katg kodon 463 CTG Leu CGG Arg CGG Arg gyra kodon 95 ACC Thr ACC Thr AGC Ser [Grp 1 a M tuberculosis, M africanum, M microti és M bovis-ban] [Grp 2 és Grp 3 csak a M tuberculosis-ban] gyrb a szekvencia különbözo a MTBC egyes tagjai esetében gyrb nukleotid 1311: G a M caprae-ban, T a MTBC egyéb tagjaiban 24
Spoligotyping variábilis spacer szekvenciák a direkt ismétlodések között: A M tuberculosis nem hibridizál a spacer 33-36-hoz (vs. BCG) A M bovis és BCG nem hibridizál a spacer 39-43-hoz (vs. M tuberculosis) A M caprae nem hibridizál a spacer. 3-16 és 3-43-hoz A M microti esetében a DR régió nagyon rövid, A legtöbb törzs csak a spacer 37 & 38-hoz hibridizál A M africanum nem hibridizál a spacer 8, 9 és 39-hez 25
4. Célkituzések 4.1. Invazív mintavételi módszerekkel (bronchoszkópia, pleura biopszia, torakoszkópia) nyert bakteriológiai és szövettani minták szerepének és hatékonyságának, és korlátainak vizsgálata a pulmonalis- és pleura tbc diagnosztikájában. 4.2. A folyékony táptalaj alapú BACTEC MGIT 960 tenyészto rendszer magyarországi bevezetése a mycobacteriumok primer izolálására, valamint a rendszer rutin diagnosztikai alkalmazhatóságának értékelése. 4.3. Molekulárbiológiai és hagyományos tenyésztéses és biokémiai módszerek alkalmazásával történo gyors identifikálás és differenciálás a MTBC-n belül. Mycobacterium bovis subsp. caprae izolálása állatkerti szibériai tigrisbol (Felis tigris mongolica). 26
5. Módszerek és eszközök 5.1. Invazív mintavételi eszközök és módszerek tüdo- és pleura tuberkulózisban 5.1.1. Bronchoszkópos mintavételi módszerek A bronchofiberoszkópos légúti mintavételek, különbözo típusú, Olympus gyártmányú, felnottek vizsgálatára készült bronchofiberoszkópokkal, többnyire lokális anesztéziában történtek. A vizsgálat elott nem adtunk rutinszeruen atropint. A beteg orrjáratait, garatját és gégéjét 10%-os lidocain spray-vel ill. 2%-os lidocain injekciós oldattal instilláltuk. A vizsgálat alatti eros köhögés esetén, a fibroszkópon át is adtunk, többször 2 ml 2 %-os Lidocain oldatot, max. 400 mg összmennyiségben. Az általában nem adtunk szedatív premedikációt, néhány betegnél a beavatkozást a helyi érzéstelenítésen túl 3-5 mg iv. midazolam szedációban, elvétve altatásban (midazolam + propofol) végeztük. Utóbbi eljárás használatának oka vagy a beteg kooperációs képtelensége, vagy kifejezett kívánsága volt. A bronchoalveolaris mosást 100-140 ml testmeleg fiziológiás konyhasóoldattal, általában ülo vagy fekvo helyzetben, a röntgenkép szerint kóros területrol végeztük. A folyadékot 20 ml-es adagonként adtunk be fecskendovel a muszer manipulációs csatornájába, és ezen át szívtuk ki. Az anyagot heparinizáltuk, egy részét cytológiai vizsgálatra küldtük, 30-50 ml-t pedig 10 percen belül az intézet mycobacteriológiai laboratóriumába juttattunk. 1999 és 2003 között, 5 év alatt 381 parenchymás tüdoinfiltratummal vizsgált betegnél történt bronchofiberoszkópos parenchyma biopszia a kóros tüdoelváltozásból, vagy disszeminált tüdoelváltozás esetén a bal tüdo 8, 9 szegmentumának subpleuralis részébol. A betegeknek elozoleg 3-6 mikroszkópos vizsgálattal ZN negatív köpete volt, vagy nem tudtak köpetet adni. 27
A beavatkozás során a betegek oxigént kaptak, pulzusoximetria, esetenként EKG monitorozás történt. A vizsgálatok túlnyomó része helyi érzéstelenítésben, kb. 7 %-a intravénás szedációval (midazolam+propfol) történt. A transnasalis intubációt preferáltuk. Az esetleges altatást aneszteziológus végezte. A vizsgálat elott mellkas röntgen ill. CT felvételek, valamint serum kreatinin, prothrombin, INR, thrombocyta, és vércsoport meghatározás történt. Antikoagulált beteget kis molekulasúlyú heparinra állítottuk át, és azt az elozo este kapta utoljára. Ilyenkor nasalisan nem intubáltunk. Mubillentyus, vagy víciumos betegeknél antibiotikum profilaxist alkalmaztunk. Az elobbiekben leírt elokészületek után, fekvo helyzetben röntgen C ív alatt, a kóros területbe vezetett, 1,8-2,4 mm átméroju, többnyire szintén Olympus gyártmányú excisorokkal általában 5, ritkán 7 szövetmintát vettünk, melybol 5 hisztológiai vizsgálatra, 2 pedig néhány esetben M tenyésztésre került. A biopszia során olykor fellépo vérzés esetén a muszert a vérzo hörgobe ékelve és a szívószelepet aktiválva a vérzo hörgo kollapszusát idéztük elo, míg a vérzés meg nem állt. A vizsgálat után panaszos betegnél azonnal, egyébként 4-6 óra múlva történt mellkas rtg vizsgálat ptx kizárására. PTX-nél mellkas drenálásra csak nehézlégzés esetén került sor. A biopszia elott BAL is történt a fentebb leírt módon. 5.1.2. Pleurapunkció és -biopszia 1999 és 2003 között, öt év alatt, 422 esetben történt ismeretlen eredetu, cytológiailag tumorsejt negatív exsudatum miatt pleura tubiopszia. A mellkasi folyadék gyülemeknél, a mellkas punkció a mellkasfal G 23-as standard méretu tuvel történo Lidocain infiltrációja után, esetenként G 20 as méretu 70 mm hosszú tuvel (Braun MT) történt. Nagy mennyiségu folyadékot a vastag pleura biopsziás tun keresztül engedtünk le. 28
A biopsziát többnyire a 2,5 mm külso átméroju Ramel tuvel végeztük, mely a Cope tu német változata, attól csak a beépített csapok különböztetik meg, mely a használatot a folyadékcsorgás szempontjából könnyíti, de a mintavétel elve és technikája ugyanaz. A Ramel tu egy trokár, melynek tore egy tompa horgolótuszeru, oldalhorog alakú kimarással ellátott csobetéttel cserélheto ki. Ez a horog akad be a fali pleurába, és azt az éles hüvely a csobetétbe belevágja. Néhány esetben a 2 mm átméroju Silverman-Hauser tut is használtuk, mely szintén trokár elvu vágótu, csak ennek kígyónyelvszeruen szétágazó végu, befelé fogazott betétje van és eredetileg transcután tüdobiopsziára készült. Ez, bár intézetünkben pleura biopsziára régebben standard eszköz volt, kevésbé tunt hatékonynak vékony fali pleura biopsziájára és nagyobb volt a tüdosérülés veszélye is, vékony mellkasi folyadék esetén. A biopszia során, elozetes vékony tuvel történt próbapunkció után, az érzéstelenített borön 3 mm-es metszést ejtettünk eldobható szikepengével, ezen a seben át vezettük a Ramel tut a mellkasfalba, majd a fali pleurát átszúrva a pleraurbe. A hüvelybol a tort kihúzva többnyire csorgott a folyadék a hüvelybol. Ezután a horgas biopsziás betétet toltuk a hüvelybe és ugyanabból a bormetszésbol, a betéttel, a hüvely teljes eltávolítása nélkül az irodalomban javasolt, legalább 3 anyag helyett 8-10 db, 2x2 mm nagyságú mintát vágtunk ki, a fali pleura costalis részének egy kb.1-2 cm sugarú érzéstelenített területébol. A beavatkozás alatt a betét metszo horga, vagy az alsó borda felé, vagy erre merolegesen, mindkét irányba tekintett. Felfelé nézo horoggal, érsérülés veszély miatt, nem szabad biopsziát venni. A biopsziás anyagok szövettani vizsgálatra, néhány esetben M tenyésztésre kerültek. 5.1.3. Diagnosztikus pleuroszkópia 1999 és 2003 között 46 betegnél végeztünk diagnosztikus pleuroszkópiát ismeretlen eredetu mellkasi folyadéknál, ismételten negatív pleura tubiopsziák után. 29
A beavatkozás éhgyomorra, atropin premedikációval, aneszteziológus közremuködésével intravénás midazolam + nubain szedációval történt. A betegnél elozoleg perifériás vénát biztosítottunk, nazális oxigént kapott és pulzus oximéterrel monitoroztuk. A pleuralis folyadékot vizsgálat elott közvetlenül a Ramel tun v. G 12 méretu L braunüle MT (Braun) nagyvéna kanüllel leengedtük és a tun keresztül levegot aspiráltattunk a pleuraurbe. Ezután, mutoasztalon, oldalfekvo helyzetben, röntgen C- ívvel ellenoriztük a ptx helyét és nagyságát, a borön megjelölve a behatolási pontot. A pleuroszkópia feltétele a szabad pleuraur, a gyakorlatban legalább 4 cm vastag parciális vagy szélesebb köpeny ptx-nél végeztük el a pleuroszkópiát. Fertotlenítést és izolálást követoen, a behatolási helyet, a punkciónál szokásos módon, 10-20 ml 1%-os lidocainnal érzéstelenítettük, és 2 cm-es bormetszésen át, 9 mm-es trokárt vezettünk a pleuraurbe. Storz ill. Olympus márkájú 3 mm átméroju merev torakoszkóp optikákat, ill. erre ráhúzható excisorokat használtunk. A képet Olympus márkájú, merev endoszkópokhoz használatos kamera segítségével, monitoron láttuk. Mivel, a trokár behatolási helyével ellentétben, a fali pleura excíziós helyei lokálisan nem érzésteleníthetok, ezek kiválasztása után a biopszia elott közvetlenül adtuk még iv. a midazolamot és nubaint. A beavatkozás során, a fali pleura kórosnak tuno costalis, diaphragmalis, ritkán mediastinalis részébol vettünk 8-10 db 3-4 x 4-5 mm-es szövet darabot. A visceralis pleurát, a tartós légáteresztés veszélyével járó tüdosérülés lehetosége miatt, általában kerültük. A ritkán látott fibrines gyulladás esetén, a fibrin vitorlákból is vettünk anyagot. A beavatkozás végén, a trokár hüvelyen át, a mellkasba 6-7 mm átméroju Nelaton katétert helyeztünk, azt matracöltéssel rögzítettük, és a beteget, a szövettani vizsgálat eredményéig (másnapig), szívtuk. Malignus pleura folyamat esetén ezután a mellkasi drénen át sclerotizáló szer befecskendezésével pleurodesist végeztünk (IV.). 30
5.1.4. Szövettani feldolgozás A minták egy részét, 4 %-os pufferolt formaldehidben, intézetünk szövettani laboratóriumába vittük, ahol a minták gyorsbeágyazásra kerültek (6-8 óra fixálás formalinban, 0,5 óra izopropil alkohol, 1 óra 65 C paraffin) ezt követoen történt a sorozat metszés, felhúzás, deparaffinálás, haematoxilin-eosin festés és fedés. Huszonnégy órán belül a szövettani vizsgálat lelete rendelkezésre állt. A tbc diagnózisát lymhocytás, epitheloid és Langhans sejtes gyulladás melletti nekrotizáló, elsajtosodó granulomák esetén mondtuk ki. A ZN festést minden esetben elvégeztük, ez pleurából soha nem volt pozitív, így a szövettani lelet a klinikai képpel, és többi lelettel egyeztetve, beleértve a késobbi therápiás effektust is, került értékelésre. (Szövet homogenizációs nehézségek miatt, csak 12 esetben történt szövethomogenizátumból párhuzamos M tenyésztés.) 5.2. M tuberculosis izolálás az automatizált BACTEC MGIT 960 rendszeren, összehasonlítva a BACTEC 460 TB rendszerrel és Löwenstein-Jensen táptalajjal 5.2.1. Betegek és minták: A 243 betegbol származó, 377 klinikai minta (288 köpet, 51 bronchoalveolaris lavage vagy bronchialis váladék aspirátum, 32 gyomormosó folyadék, és 6 pleuralis fluidum) 1999. március 29. és 1999. május 31. között került levételre. Valamennyi beteg HIV negatív volt. A vizsgálatok a Semmelweis Egyetem Pulmonológiai Klinikájának mycobacteriológiai laboratóriumában történtek 31
5.2.2. Minta elokészítés: Minden klinikai minta a Kent- és Kubica-féle (52) N-acetyl-L-cystein-NaOH-os emésztésen és dúsításon esett át. 4 %-os induló koncentrációjú NaOH-t használtunk. A dekontaminációt és dúsítást követoen, mikroszkópos vizsgálatra, a minták koncentrált üledékébol keneteket készítettünk, melyeket ZN szerint festettünk meg. A visszamaradó üledéket 1,5 ml steril foszfát puffer sóoldatban (ph 6,8) oldottuk fel. A minták leoltása elott a BACTEC MGIT 960 és a BACTEC 12B csöveket a gyártó eloírásának megfelelo adalékkal (Polymyxin, Amphotericin, Nalidixin sav, Trimethoprim, Azlocillin; PANTA) készítettük elo leoltáshoz. 5.2.3. Leoltás: A feldolgozott mintából 0,5 ml-t injektáltunk a BACTEC MGIT 960 csobe, 0,5 ml-t a BACTEC 12B palackba, és 0,2-0,2 ml-t 2 LJ táptalajra. Minden táptalajt 37 0 C-on inkubáltunk. A BACTEC MGIT 960 csöveket a használati utasítás szerint helyeztük el a BACTEC MGIT 960 automatába, és teszteltük mindaddig, amíg pozitívnak nem mutatkozott, vagy pedig 6 hétig, ezután negatívként adtuk ki az eredményt. A BACTEC 12B csöveket, az elso két héten hetente kétszer mértük le, BACTEC 460 TB muszerrel, majd további 4 héten át hetente egy alkalommal. Amikor a BACTEC 12B cso növekedési indexe elérte a? 10 mértéket, a csövet naponta ellenoriztük mindaddig, amíg a növekedési index el nem érte a? 100 értéket, ekkor a mintát pozitívnak tekintettük. Amennyiben 6 hét elteltével sem sikerült 14 CO 2 termelést kimutatni, a BACTEC 12B csoben levo mintát negatívnak tartottuk. 5.2.4. Kontrollok: A LJ táptalajt, 8 héten át, hetente vizsgáltuk, mycobacterium telepeket keresve. Mind a folyékony, mind a szilárd táptalajon észlelt M növekedés esetén, a további párhuzamos táptalajokon, naponta végeztünk leolvasást. A detektálás napján minden pozitív folyékony, 32