8.1. ÉLİ CSÍRASZÁM MEGHATÁROZÁSI MÓDSZEREK TENYÉSZTÉSES ELJÁRÁSSAL

8.1. ÉLİ CSÍRASZÁM MEGHATÁROZÁSI MÓDSZEREK TENYÉSZTÉSES ELJÁRÁSSAL Az élısejtszám meghatározási módszerek lehetıvé teszik, hogy egy vizsgált közegben (élelmiszer, takarmány, talaj stb.) a számunkra hasznos, vagy káros szaporodni képes mikroorganizmusok számát meghatározzuk. A gyakorlatban legelterjedtebben alkalmazott négy vizsgálati módszer: Határhígítás Telepszámlálásos módszer o Lemezöntés o Szélesztés Membránszőrés A határhígításos módszernél a csíraszámot nem közvetlenül olvassuk le, hanem statisztikai alapon számítjuk ki: a tenyésztést folyékony tápközegben végezzük. A másik három módszernél a tenyésztés szilárdított táptalajon vagy táptalajban történik, a kifejlıdı mikroorganizmus telepek tehát közvetlenül számolhatók. E különbségektıl eltekintve valamennyi élıcsíraszám meghatározási módszer megegyezik abban, hogy a tulajdonképpeni tenyésztés elıtt a vizsgálandó anyagból szuszpenziót készítünk, amit fokozatosan addig hígítunk, amíg az élı sejtek száma, a tenyésztés után, értékelhetıvé válik. DECIMÁLIS HÍGÍTÁSI SOR KÉSZÍTÉSE A vizsgálati mintában (élelmiszer-, víz-, talajminta stb.) a keresett mikroorganizmusok számát mindig a minta 1g-jára, vagy 1 cm 3 -ére vonatkoztatva adjuk meg. A "Mintaelıkészítés" címő fejezetben már szó volt róla, hogy tekintettel a minták mikrobiotájának egyenlıtlen eloszlására a vizsgálati anyagot elıször homogenizálni kell, célszerően kilencszeres mennyiségő hígítóvízzel. Egy steril edénybe vagy steril mőanyag zacskóba mérjük ki a vizsgálati mintát reprezentáló m g tömeget vagy V cm 3 térfogatot. Általában a vizsgálati anyag a minta 10 g-ja, illetve 10 cm 3 -re, egyes esetekben fıleg patogén mikroorganizmusok jelenlétének vizsgálatakor (Salmonella, Listeria monocytogenes) a vizsgálati anyag 25, esetleg 100 g, illetve cm 3 is lehet. Adjunk hozzá 9Xm g-mal vagy 9XV cm 3 -rel egyenlı hígítófolyadék-mennyiséget. A hígítófolyadék steril élettani (fiziológiás) sóoldat (8,5 g NaCl 1000 cm 3 ioncserélt vízben). A homogénezéssel elkészített un. alaphígítás (10-1 ) képezi az alapját az alábbiak szerint elkészítendı, un. decimális hígítási sornak (16. ábra): az

alaposan összerázott alaphígításból steril pipettával 1 cm 3 -t kell 9 cm 3 hígítófolyadékhoz mérni a következı (2-es hígítás, 10-2 ) elkészítéséhez, majd a folyamatot folytatni a szükséges hígítási fokig. Minden hígítás elkészüléséhez új pipettát kell használni. A hígítási fokokat úgy kell megválasztani, hogy telepszámlálásos módszer esetén a várható telepszám 10-300 legyen, míg MPN-módszer esetén az utolsó hígításban feltételezhetıen már ne legyen a vizsgálandó mikroorganizmus. 1 cm 3 1 cm 3 1 cm 3 1 cm 3 1 cm 3 1 cm 3 9-9 cm 3 hígítófolyadék Alaphígítás (10-1 ) 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 Hígítási fok: 1 2 3 4 5 6 7 18. ábra: Decimális hígítási sor készítési módja szilárd mintából Ügyelni kell a pipettázás pontosságára, továbbá az aszeptikus munkára. Könnyen belátható, hogy a hígítás annál pontosabb, minél pontosabbak a pipetták ill. a hígítóoldatok térfogata. Minél nagyobb mérvő a hígítás, tehát minél kisebb a sejtszám, annál fontosabb a fertızıdés megakadályozása. 1000-es csíraszámnál még nem okoz bajt, azonban a cm 3 -ként 1-2 sejtet, vagy esetleg még annyit sem tartalmazó hígításoknál többszáz százalékos hibát eredményezhet. 8.1.1. Mikroorganizmusok számának meghatározása MPNmódszerrel Az MPN (Most Probable Number = legvalószínőbb élı sejtszám) módszer használatakor a mikroorganizmusokat folyékony táptalajban

szaporítjuk el, és a mikrobaszaporodást mutató csövek száma alapján, statisztikai alapon következtetünk a keresett mikroorganizmusok számára. Az MPN-módszer alkalmazhatóságnak alapfeltétele, hogy a sejtek eloszlása az alapszuszpenzióban véletlenszerő legyen, vagyis a sejtek a szuszpenzió bármely részében azonos valószínőséggel legyenek megtalálhatók, és a folyékony táptalajban mikrobaszaporodás legyen tapasztalható már 1 élı sejtet tartalmazó inokulum beoltása esetén is. A határhígításos módszer - a táptalajtól és a tenyésztési technikától függıen egyaránt alkalmazható az összes (aerob mezofil) élı csíraszám és valamely kiválasztott mikrobacsoport vagy mikroorganizmus számának meghatározására. A vizsgálandó anyagból alapszuszpenziót kell készíteni, majd ezt decimális alapon addig hígítani, míg az utolsó hígítás 1 cm 3 -ében már valószínőleg már nem található a keresendı mikroorganizmus egyetlen sejtje sem. Ezért azt a technikát határhígításos módszernek is nevezik. Azt, hogy melyik az a hígítás, amelybıl kioltva már feltehetıleg nem tapasztalunk mikrobaszaporodást a minta jellege, és a keresett mikroorganizmus határozza meg. A hígításokból steril pipettával 1-1 cm 3 -t kioltunk folyékony táptalajt tartalmazó csövekbe. Amennyiben a kioltást a hígabb szuszpenziótól kezdjük, a kioltás végrehajtható egy pipettával is. A sejtszámmeghatározás pontosságának megbízhatósága növelhetı a hígítás léptékének csökkentésével (pl. 2-es alapú hígítás), a hígítási fokokból történı leoltások (párhuzamosok) számának növelésével, és az ismétlések, vagyis az alaphígítások számának növeléséve. A mindennapi gyakorlatban általában a párhuzamosok számának növelésével emelik a megbízhatóságot. A megkívánt pontosságtól függıen 2-5 párhuzamos leoltására van szükség. Leggyakrabban a 3-3 párhuzamos leoltással hajtják végre a legvalószínőbb élıcsíra-szám meghatározását. Az elbírálás elsı lépése az elıírt inkubálás után a kulcsszám meghatározása (17. ábra). A kulcsszám egy háromjegyő szám, amelyet három egymást követı hígítási szinten a mikrobaszaporodást mutató pozitív csövek számából határozunk meg. A kulcsszám elsı tagjának azt az utolsó hígítási szintet kell kijelölni, amelyen a pozitív csövek száma még maximális (ha pl. 3 párhuzamos leoltást végeztünk, akkor lehetıleg 3). A második számjegy az ezután következı hígítási lépcsıben talált pozitív csövek számát adja meg. A harmadik számjegy pedig a következı nagyobb hígítás pozitív csöveinek számára utal. Elıfordulhat az értékelés

során, hogy olyan kulcsszámot kapunk, amelyben a magasabb hígításhoz több pozitív csı tartozik. Ez a mikroorganizmusok egyenlıtlen eloszlására vagy a hígítás hibájára utal! Hígítási szint 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 Pozitív csövek száma: 3 3 2 1 0 Jelmagyarázat: pozítív csı negatív csı aláhúzás: kulcsszám 19. ábra: A kulcsszám meghatározásának módja Ezt követıen az un. Hoskins-féle táblázatból ki kell keresni a kapott kulcsszámhoz tatozó alapértéket, majd ezt meg kell szorozni a kulcsszám elsı tagjához tartozó hígítási fokkal. Az így kapott értéket normál alakba hozva adjuk meg a vizsgálat eredményét CFU/cm 3 -ben vagy CFU/g-ban. CFU=Colony Forming Unit, azaz Telepképzı egység (TKE). 4. táblázat Hoskins-féle táblázat a milliliterenkénti legvalószínőbb élısejtszám megállapításához (hígításonként 3-3 leoltás esetén) (részlet) Kulcsszám Alapérték Kulcsszám Alapérték 000 100 110 111 200 210 211 220 0 0,36 0,73 1,1 0,91 1,5 2,0 2,1 300 310 311 320 321 322 330 331 2,3 4,3 7,5 9,3 15 21 24 46

221 222 2,8 3,5 332 333 110 Tovább higítani! A kulcsszám a példánkban (17.ábra): 3 2 1 (aláhúzott számok). Az ennek megfelelı alapérték (a 4. táblázatból kikeresve): 15. A kulcsszám elsı tagjának hígítási szintje: 10-2. Ezekbıl az adatokból az alapszuszpenzió legvalószínőbb élıcsíraszáma: 13. GYAKORLAT 15x10 2 =1,5x10 3 CFU/cm 3 Mezofil (szulfitredukáló) anaerob spórás baktériumok (vegetatív és spórás alak) számának meghatározása MPN-módszerrel. Mezofil (szulfitredukáló), spóraképzı anaerob baktériumok alatt azokat a Clostridium-ok nemzetségébe tartozó, 30 C hımérsékleten anaerob körülmények között növekvı mikroorganizmusokat értjük, amelyek adott feltételek mellett a szulfitot szulfiddá redukálják. redukció szulfit ( vas) szulfid A vizsgálathoz D-glükóz - nátrium-diszulfit - ammónium- vas(ii)-citrát - B-polimixin tartalmú folyékony szelektív és differenciáló táptalajt (DRCM) használunk. A táptalaj szelektivitását a Bacillus polimixa által termelt polimixin nevő antibiotikum biztosítja, amely gátolja a nem spórásodó mikrobióta szaporodását. A Bacillus nemzetség tagjainak fejlıdését az anaerob; viszonyok akadályozzák. A táptalaj alkalmas a szulfitredukció kimutatására, amelynek alapanyaga a nátrium-szulfit; a keletkezı szulfidionokat a vas-ammónium-citrát "jelzi" oly módon, hogy a vas-ion a szulfid-ionokkal kapcsolódva feketére színezi a tápközeget. Az anaerobiozis ellenırizhetısége érdekében a táptalaj rezazurin nevő redoxindikátort tartalmaz. Az oxigénmentes táptalaj világos vörösesbarna színő, oxigén hatására pedig rózsaszínő. A táptalajból felhasználás elıtt az oxigénnyomokat forralással el kell távolítani. Szükséges anyagok és eszközök: Vízfürdı, steril pipetták, steril hígítóvíz 9 cm 3 -ként csövekbe adagolva, DRCM-leves 10 cm 3 -ként csövekbe adagolva, paraffinolaj Mikroorganizmus: Clostridium butyricum vizes szuszpenziója

A gyakorlat menete: A vizsgálathoz két alapszuszpenziót kell készíteni, és az egyiket vízfürdıben 75 C-on 15 percen át kell hıkezelni a vegetatív alakok inaktiválása céljából. Ezt követıen mindkét alaphígításból decimális hígítási sort kell készíteni, majd a hígításokból 3-3 párhuzamos leoltást végezni DRCM-levest tartalmazó csövekbe. A beoltott csöveket az anaerob körülmények kialakítása érdekében 2-3 mm vastagságban parafinolajjal kell fedni, majd 30 C-on 44 ± 4 órán át inkubálni. Pozitív esetben a beoltott tápközeg fekete elszínezıdést mutat. A hıkezeletlen mintából kapott eredmény adja meg az összes (vegetatív és spórás) mezofil szulfitredukáló klosztridiumok számát, a hıkezelt mintából pedig a spórás alakok számát kapjuk meg. Eredmények: 14. GYAKORLAT Kóliform baktériumok és feltételezetten Escherichia coli számának meghatározása MPN-módszerrel Kóliform baktériumok alatt értjük azokat az Enterobacteriaceae családba tartozó aerob és fakultatív anaerob, G(-), spórát nem képzı baktériumokat, amelyek a laktózt 30 C hımérsékleten 24-48 óra alatt sav- és gáztermelés közben bontják. Ezek a baktériumok MPNmódszerrel szelektív, laktóztartalmú táptalajokban mutathatók ki. A kóliform baktériumok határhígításos módszerrel történı kimutatásához leggyakrabban a lauril-szulfát tartalmú szelektív levestáptalajt (LS) használják. A magas tápanyagtartalom és a foszfát puffer jelenléte gyors növekedést és fokozott gázképzıdést eredményez még a lassú laktózfermentáló kóliform baktériumoknál is. A laktózbontást kísérı gáztermelés a táptalajba szájával lefelé elhelyezett Durham-féle fermentációs csı segítségével vizsgálható. A lauril-szulfát gátolja a kísérıflóra szaporodását. A kóliform baktériumok csoportjába tartozik az egyik legjelentısebb ételmérgezı baktérium, az E. coli. Ennek kimutatása a kóliform baktériumokkal egyidejőleg a táptalajhoz adott "MUG" (4-metilumbelliferil-ß-D-glükuronid) nevő adalékanyag segítségével történik. A MUG az E. coli baktériumok által termelt glükuronidáz enzim egyik lehetséges szubsztrátja. Az enzim a MUG-ról lehasítja a glükuronsavat, a visszamaradó 4-metil-umbelliferon nevő termék UV-fényben fluoreszkál. A fluoreszkálás mértéke néhány csepp 1 mólos nátrium-hidroxid oldattal felerısíthetı.

Szükséges anyagok és eszközök: Steril pipetták, steril hígítóvíz 9 cm 3 -ként csövekbe adagolva, MUG-ot tartalmazó LS-leves 10 cm 3 -ként csövekbe adagolva Mikroorganizmus: Kóliform baktériumok és E. coli vegyes vizes szuszpenziója A gyakorlat menete: A vizsgálathoz alaphígítást, majd abból decimális hígítási sort kell készíteni, és a hígításokból 3-3 párhuzamos leoltást végezni MUG-os BBL-levest tartalmazó, Durham-féle fermentációs csıvel ellátott csövekbe. A beoltott csöveket 30 C-on 24-48 órán át kell inkubálni. Az értékelést a Hoskins-táblázat alapján kell elvégezni. Kóliformokra nézve pozitívnak kell tekinteni minden olyan csövet, amelyben a Durhamcsınek legalább 1/10 részét gázbuborék tölti ki. A kóliform pozitív csövek közül E. coli baktériumot tartalmaznak a fluoreszkáló csövek. Megjegyzés: A címben a feltételezetten E. coli-szám meghatározás arra utal, hogy ez a vizsgálat nem teljes körő, az E. coli jelenlétét a továbbiakban még meg kell erısíteni. (Biokémiai vizsgálatok) 8.1.2. Mikroorganizmusok számának meghatározása telepszámlálásos módszerrel A telepszámlálásos módszerek esetében a tenyésztést szilárd táptalajon végezzük, így - szemben az MPN-módszerrel, ahol a csíraszámot indirekt úton, statisztikai módszerrel határoztuk meg - a kifejlıdött telepek közvetlenül megszámolhatók. A telepszámlálásos módszerek alkalmazhatóságának alapfeltétele, hogy a táptalajokon kinıtt telepek egyetlen sejt szaporodásából származzanak, és a telepek számolhatók legyenek, vagyis a cél olyan lemeztenyészetek elıállítása, amelyen az egyedülálló (soliter) telepek száma 10-300 közötti. Akárcsak az MPN-módszerrıl, a telepszámlálásos módszerekrıl is elmondható, hogy - a táptalajtól és a tenyésztési technikától függıen - alkalmas mind az összcsíraszám; mind pedig valamely tetszıleges mikrobacsoport számának meghatározására.

8.1.2.1 Élısejtszám meghatározás lemezöntéses módszerrel A lemezöntéses módszert fıként kevéssé hıérzékeny, nem obligát aerob mikroorganizmusok tenyésztésére használjuk. Alkalmazható az összcsíraszám, valamint szelektív vagy elektív táptalajok és optimális tenyésztési viszonyok alkalmazásával szőkebb mikrobacsoportok élıcsíra-számának meghatározásához. A vizsgálat elsı lépése - mint miden élıcsíra-szám meghatározást célzó tenyésztéses módszer esetében - a megfelelıen elıkészített mintából decimális hígítási sor készítése. Ezt követıen a hígítási sor tagjaiból 2-2 - egyértelmő jelzéssel (mintaszám, leoltás dátuma, alkalmazott táptalaj rövidített neve, hígítás foka) ellátott - Petri-csészébe 1-1 cm 3 szuszpenziót kell pipettázni steril pipettával a legmagasabb hígítástól kezdve a nagyobb sejtsőrőségő tagok felé haladva (19. ábra). Pipettázáskor nem vesszük le teljesen a csészék fedelét, csupán annyira emeljük fel, hogy a pipettával be tudjunk nyúlni (1) (20.ábra). A sterilezett, 45-50 C hımérséklető, táptalajból kb. 15 cm 3 mennyiséget öntünk a megemelt fedelő Petri-csészékbe (2), majd egyenletes rotáló mozgatással a - még folyékony - táptalajt alaposan elkeverjük a Petricsészében lévı szuszpenzióval (3). Ügyelni kell arra, hogy mozgatás közben a tápközeg ne kerüljön a Petri-csésze falára és tetejére, valamint ne szennyezze a környezetet. Az inokulum szétosztása és a táptalaj öntése közötti idıtartam ne haladja meg a 15 percet. A tápközeg megszilárdulása (4) után a Petri-csészéket meg kell fordítani úgy, hogy a lemez kerüljön felülre (5). Ennek célja egyrészt a képzıdı kondenzvíz visszacsöpögésének, a gyors kiszáradásnak, valamint a telepek elvándorlásának megakadályozása. A lemezeket ezt követıen megfelelı hımérséklető termosztátba kell helyezni, és elıírt ideig tenyészteni.

1-1 cm 3 20. ábra: A lemezöntéses módszer kivitelezésének rajzos vázlata I. O= Petri-csésze 21. ábra: A lemezöntéses módszer kivitelezésének rajzos vázlata II. Kerüljük a termosztátok túlterhelését. A csészeoszlopok között, az oszlopok és termosztát falai, valamint az oszlopok és a polc lapjai között legalább 29 mm hézagot kell hagyni. Egy oszlopban legfeljebb 6 csésze legyen. Az inkubálás lejárta után a lemezeket kivesszük a termosztátból, és a rajtuk kifejlıdött telepeket megszámláljuk. Csak azokat a lemezeket vonjuk be az értékelésbe, amelyeken a telepszám 10-300 (nagymérető telepek esetén 10-150) közötti. A csíraszámot az értékelésbe bevont lemezeken (két egymást követı hígítás) megszámlált telepszámok

súlyozott átlagaként adjuk meg a hígítási fok figyelembe vételével az alábbi képlet alapján: c C = n + 0,1 n ) * V * d ( 1 2 ahol C = telepszám súlyozott középértéke c =a számításba bevont valamennyi lemezen számolt telepek összes száma (az elsı értékelhetı és az azt követı hígítási fokok) n 1=az elsı értékelhetı hígítási fokhoz tartozó lemezek száma n 2 =a második értékelhetı hígítási fokhoz tartozó lemezek száma d =az elsı értékelt hígítási szint hígítási foka (pl. 10-2 ) V =a lemezekre vitt kultúra mennyisége (jelen esetben 1 cm 3 ) A kapott értéket minden esetben normál alakba hozva adjuk meg eredményként. Ennél a vizsgálati módszernél célszerő az alkalmazott táptalajt úgy megválasztani, hogy az tiszta, áttetszı legyen, mert az opálos színő táptalajok zavarhatják a kolóniák felismerhetıségét. 15. GYAKORLAT Pasztırözött tej összcsíraszámának meghatározása lemezöntéses módszerrel Összcsíraszám alatt értjük azoknak az élı mikroorganizmusoknak a számát, amelyek 30 C hımérsékleten aerob körülmények között 48-72 óra alatt telepet képeznek (összes élı, aerob és fakultatív anaerob, mezofil és fakultatív pszichrotróf mikrobák száma). A vizsgálatot szilárd alaptáptalajon kell végezni, mint pl. a triptont, élesztıkivonatot és glükózt tartalmazó Plate-Count agar Szükséges anyagok és eszközök: 90 cm 3 steril hígítóvíz Erlenmeyer-lombikban, 10 cm 3 -es steril pipetta, 5 x 9 cm 3 steril hígítóvíz kémcsıben, 1 cm 3 -es steril pipetta, 6 db steril Petri-csésze, olvasztott Plate-Count agar

Mikroorganizmus: Pasztırözött tej természetes mikroflórája A gyakorlat menete: A pasztırözött tejminta 10 cm 3 -ét bemérjük 90 cm 3 steril hígítóvízbe, majd az így elkészített és alaposan összekevert alaphígításból további decimális hígításokat készítünk 10-5 hígítási fokig. A hígítási sor utolsó három tagjából 1-1 cm 3 t pipettázunk hígításonként 2; azonosítható jelöléssel ellátott steril Petri-csészébe, majd felolvasztott és 45 C-ra visszahőtött Plate-Count agarral lemezt öntünk. Szilárdulás után a lemezeket 48-72 órára 30 C-ra állított termosztátba helyezzük. Az inkubálási idı után a kifejlıdött telepeket megszámoljuk, és a fenti képlet alapján kiszámoljuk a tej 1 cm 3 -ére vonatkoztatott összcsíraszámot. Ha valamely képletrıl szabad szemmel nem tudjuk eldönteni, hogy telep-e, célszerő lupéval is megvizsgálni. Megjegyzés: a módszer alkalmas az aerob spóraszám meghatározására is, ha a mintát vagy a hígítási sor tagjait 80 C-on 10 percen át kezelve a vegetatív alakokat elpusztítjuk. Eredmények: 8.1.2.2 ÉLİSEJTSZÁM MEGHATÁROZÁSA FELÜLETI SZÉLESZTÉSSEL A felületi szélesztés alkalmazható hıérzékeny, obligát aerob mikroorganizmusok tenyésztésére is. Ennél a módszernél alkalmazhatunk opálos színő (általában tojássárga-emulziót tartalmazó) táptalajokat, mivel a mikrobaszaporodás a táptalaj felszínén történik, így a telepek szabad szemmel is jól láthatók. A felületi szélesztéses módszer - akár az MPN, vagy a lemezöntéses eljárás - alkalmazható az összcsíraszám, valamint szelektív vagy elektív táptalajok és optimális tenyésztési viszonyok alkalmazásával szőkebb mikrobacsoportok élıcsíraszámának meghatározásához. A felületi szélesztéses eljárás során a már elıre leöntött és megszilárdított, szikkasztott felülető lemez felületére pipettázunk hígításonként 0,1 cm 3 szuszpenziót (19. ábra). Ha nincs más elıírás a szárítást beoltás elıtt fedı nélkül, lefelé nézı agarfelülettel kell elvégezni egy 50 C-os termosztátban 30 percig. A táptalaj szikkasztására azért van szükség, mert

a nedves felülető lemezen nehéz a szélesztés, és a kifejlıdı telepek szétfutnak. Beoltás után a megfordított lemezeket megfelelı körülmények között meghatározott ideig inkubáljuk. Az inkubációs idı letelte után a kifejlıdött telepeket megszámláljuk. Az értékelésbe csak azokat a lemezeket vonjuk be, amelyeken a telepszám 10-300 (nagy telepek esetén 10-150) közötti. A csíraszám meghatározása súlyozott átlag számításával az elıbb már említett képlet alapján történik: c C = n + 0,1 n ) * V * d ( 1 2 ahol C = telepszám súlyozott középértéke c =a számításba bevont valamennyi lemezen számolt telepek összes száma (az elsı értékelhetı és az azt követı hígítási fokok) n 1=az elsı értékelhetı hígítási fokhoz tartozó lemezek száma n 2 =a második értékelhetı hígítási fokhoz tartozó lemezek száma d =az elsı értékelt hígítási szint hígítási foka (pl. 10-2 ) V =a lemezekre vitt kultúra mennyisége (jelen esetben 0,1 cm 3 ) 0,1-0,1 cm 3 22. ábra: A felületi szélesztéses módszer kivitelezésének rajzos vázlata O= Petri-csésze Látható, hogy a lemezöntéses módszernél a lemezekre vitt inokulum mennyisége 1 cm 3, a felületi szélesztéses módszernél 0,1 cm 3. Az

eredményt minden esetben normál alakba hozva kell megadni CFU/ cm 3 vagy CFU/g mértékegységgel. A fentiekbıl következik, hogy szilárd minták esetében, a vizsgálat érzékenysége legalább 10 2 mikroba/g, folyékony minták esetében pedig; 10 1 mikroba/ cm 3. Elıfordulnak azonban olyan vizsgálati minták, amelyekben a keresendı mikroorganizmus ennél kisebb számban, fordul elı. Ezek kimutatását célozza az un. "három-lemez"-módszer. Ennek lényege, hogy a hígítási sor elsı tagjából - szilárd minták esetében ez az l- es hígítás (alapszuszpenzió), folyékony minták esetében pedig maga a minta (0-s hígítás) - összesen 1 cm 3 mennyiséget három lemez felületén oszlatunk el, majd a megfelelı inkubálás eltelte után a telepeket mindhárom lemezen megszámláljuk, és a kapott értékeket összeadjuk. Ez a szám megmutatja, hogy - szilárd minták esetében - az alapszuszpenzió, illetve - folyékony minták esetében - a minta 1 cm 3 -ében hány mikroba található. 16. GYAKORLAT Pasztırözött tej összes Staphylococcus-, és feltételezhetıen Staphylococcus aureus számának meghatározása felületi szélesztéses módszerrel A Staphylococcus nemzetség tagjai megtalálhatók az ember és az állatok bırén, felsı légutaiban, a húgy és nemi szervek nyálkahártyáin, illetve egyes fajaik a tejben és tejtermékekben is. Élelmiszerhigiéniai szempontból legjelentısebb képviselıjük a Staphylococcus aureus, amely hıtőrı enterotoxin-termelése révén az ételmérgezı mikroorganizmusok közé tartozik. A Staphylococcus-ok szelektív tenyésztésére a szulfamethazin-tojássárgatellurit tartalmú szelektív és differenciáló agarlemezt alkalmazzuk. A szulfamethazin visszaszorítja a kísérı mikroflórát, a tellurit a Staphylococcusok-ra jellemzı tellurit-redukció kimutatását célozza, amelynek eredményeként a telepek fekete vagy grafitszürke színben tőnnek föl. A táptalajon vizsgálható a Staphylococcus aureus-ra jellemzı lipáz-lecitináz aktivitás. A lipáz pozitívak azok a telepek, amelyek felülete a keletkezı zsírsavak miatt gyöngyházfényő. A lecitináz aktivitást az un. Nagler-reakció mutatja. Ennek lényege, hogy a lecitin elbontása miatt a telepek körül - a tojássárga-tartalom miatt - egyébként opálos táptalaj feltisztul. Szükséges anyagok és eszközök:

90 cm 3 steril hígítóvíz Erlenmeyer-lombikban, 10 cm 3 -es steril pipetta, 9 cm 3 steril hígítóvíz kémcsıben, 1 cm 3 -es steril pipetta, 4 db Baird-Parker agarlemez, steril Wassermann-csövek Mikroorganizmus: Pasztırözött tej természetes mikroflórája A gyakorlat menete: A pasztırözött tejminta 10 cm 3 -ét bemérjük 90 cm 3 steril hígítóvízbe, majd az így elkészített és alaposan összekevert alaphígításból további decimális hígítást készítünk 10-2 hígítási fokig. A hígítási sor tagjaiból 0,1 0,1 cm 3 -t pipettázunk hígításonként 2, azonosítható jelöléssel ellátott steril Baird-Parker agarlemezre. A lemezeket 24-48 órára 37 C-ra állított termosztátba helyezzük. Az inkubálási idı után a kifejlıdött fekete vagy grafit szürke telepeket, valamint ezek közül a gyöngyházfényő és Naglerreakciót mutató telepeket megszámoljuk, és a fenti képlet alapján kiszámoljuk a tej 1 cm 3 -ére vonatkoztatott Staphylococcus-, valamint feltételezett Staphylococcus aureus-számot Számolási példa telepszám súlyozott átlagának kiszámítására lemezöntéses módszer esetében Tegyük fel, a lemezeken kinıtt telepek leszámolása után az alábbi eredményeket kaptuk a nyers tej összcsíraszámának vizsgálatakor. Hígítási szint 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 Hígítási fok 1 2 3 4 5 1. párhuzamos lemezein kinıtt sok sok 280 27 3 telepek száma (c) 2. párhuzamos lemezein kinıtt sok sok 235 23 2 telepek száma (c) A kiértékelésbe csak a fekete négyzettel körülvett telepszámokat vonhatjuk be, mert ezek felelnek meg a 10<c<300 elıírásnak. C = = = 3 3 ( n1 + 0,1 n2 ) * V * d ( 2 + 0,1* 2) *1*10 2,2 *10 = 256,82 *10 3 c = 2,57 *10 5 280 + 235 + 27 + 23 CFU cm 3 565 =

2,57*10 5 a nyers tej mintánk összcsíraszáma. Figyelem: 1 1 10-3 =0.001=1/1000, így = 3 10 1 = 1000 = 10 1000 8.1.3. Membránszőréses módszer A membránszőréses módszert alacsony csíraszámú folyadék- és gázminták vizsgálatára alkalmazzuk. A minta meghatározott mennyiségét membránfilteren átszívatva annak pórusain a mikrobák visszamaradnak. A membránfiltert táptalajra helyezve a filteren átdiffundáló tápanyagok révén a telepek magán a filteren alakulnak ki. A membránszőréses módszer alkalmazásáról és technikai kivitelezésérıl részletesen a "Víz összes csíraszámának meghatározása membránszőréses módszerrel" címő gyakorlat keretében lesz szó. 3