Sör etanoltartalmának meghatározása GC-FID módszerrel FIGYELEM! A gyakorlat elvégzéséhez a gázkromatográfia alapjainak (a gázkromatográf részei, ezen részek típusai és funkciói; a minőségi azonosítás és a mennyiségi meghatározás módszerei) ismerete szükséges. Ezekről részletesen A gázkromatográfia alapjai című leírásban olvashattok. 1. A sör A sör malátából, valamint bizonyos pótanyagokból vízzel cefrézett, komlóval, illetve egyéb engedélyezett anyagokkal ízesített, sörélesztővel erjesztett, szén-dioxidban dús, magas tápértékű, általában alkoholtartalmú ital. A sört az emberiség több évezrede ismeri. A sörrel kapcsolatos legkorábbi feljegyzések körülbelül 6000 évvel ezelőtt készültek, i. e. 3000-ben már törvény szabályozta az elkészítésének módját. Ma a sörgyártás hatalmas méretű nemzetközi üzletág, amely főként multinacionális vállalatok kezében van, de sok ezer kisebb cég is foglalkozik sörfőzéssel. A sör készítésének két szakasza van: a malátázás és magának a sörnek a készítése. A sör alapanyaga az árpa, ill. a maláta, a víz és a komló. A malátához felhasznált árpát tisztítják, áztatják és csíráztatják. A csíráztatás terméke a zöld maláta, amit szárítanak. A malátát őrlik, majd 50 C-on cefrézik, ami során a malátában található keményítőt és egyéb makromolekulákat enzimatikus úton hidrolizálják. Szűrés után a sörlét komlóval főzik, amellyel a sörbe került mikroorganizmusokat pusztítják el. Az újból szűrt és lehűtött sörlét ezután anyaélesztővel beoltva az erjesztőpincében 4-5 C-on erjesztik. A 6-12 napig tartó főerjedés után a sör utókezelése következik. Ennek során az erjesztést (ún. ászokolást) 0-2 C hőmérsékletű ászokpincében folytatják 2-5 hónapon keresztül. Ezalatt lezajlik az utóerjedés, a sör megtisztul, szén-dioxiddal telítődik, kialakul habszerkezete és jellegzetes ízharmóniája. A gyártás során a vonatkozó kötelező előírásoknak, nemzeti irányelveknek (Magyar Élelmiszerkönyv), és más minőségbiztosítási rendszereknek (pl. HACCP) is meg kell felelni. A különböző sörfajták vizsgálatára sokféle elemzési módszert használnak. Mérik a sör etanol-, aszkorbinsav-, glükóz-, maltóz-, szén-dioxid-, kén-dioxid-, riboflavin-, N-nitrozodimetilamin tartalmát és sokféle szervetlen ion koncentrációját. Vizsgálják a sör habzását, keserűségét, átlátszóságát, színét és ph-ját. A gyakorlat során az etanoltartalmat fogjuk meghatározni. A Magyar Élelmiszerkönyv 5,5V/V% névleges alkoholtartalomig ±0,5 V/V% eltérést engedélyez, 5,5 V/V% feletti névleges alkoholtartalomnál ±1 V/V%-ot.
2. A lángionizációs detektor működése Az oszlopról eluálódó komponensek a lángionizációs detektorban (FID: Flame Ionization Detector) egy kb. 2000-2500 K hőmérsékletű hidrogén-levegő lángba jutnak. A lángban a C-H kötéseket tartalmazó molekulák, azaz a szerves vegyületek fragmentálódnak és egy részük ionizálódik. A képződött ionok a jet és a kollektor közötti potenciálkülönbség hatására a kollektorra jutva a detektorba eluálódó anyagmennyiséggel arányos ionáramot eredményeznek. Lángionizációs detektor vázlata A detektor jelének intenzitása az egyes összetevők mennyisége mellett függ a molekulában lévő C atom H atom aránytól, pontosabban a lángban képződő CH gyökök számától. A keletkező CH gyökök száma pedig jelentősen függ a heteroatomok számától, minőségétől, molekulán belüli helyzetétől, kötéstípusától. A különböző szerkezetű molekulákban lévő szénatomok tehát eltérő módon járulnak hozzá a CH-gyökök, ill. az ionok képződéséhez. Az égés során víz képződik, ezért üzemben levő detektor sosem hűlhet 100 C alá. Ekkor ugyanis a víz a kollektorban kondenzálna, így a detektor korrodálódna, élettartama csökkenne. A make-up gáz kapilláris oszlopok esetén használatos a jelintenzitás növelésére, a leggyakrabban nitrogént használnak erre a célra. 3. Validálás Egy analitikai módszer validálása az a tevékenység, amely rendszerezett vizsgálatok segítségével bizonyítja, hogy a módszer teljesítményjellemzői kielégítik az analitikai módszerrel szemben támasztott követelményeket. A módszer validálása során olyan teljesítőképességi paramétereket határoznak meg, mint pl. a torzítatlanság (accuracy), precizitás (precision), linearitás, szelektivitás, kimutatási határ. A gyakorlat során az időkorlát miatt az első két paraméter kerül meghatározásra. Torzítatlanság A torzítatlanság a rendszeres hiba kimutatására szolgál, mely ugyanazon alkotók ismételt mérése során állandó vagy kiszámítható módon változó hibaelem. Torzítatlanság vizsgálatakor a mintához ismert mennyiségű vizsgálni kívánt komponenst adalékolunk,
végrehajtjuk a minta-előkészítést, és megmérjük az így kapott oldatokat. A torzítatlanságot a kapott mérési eredmények és az adalékolás alapján várt eredmények hányadosával jellemezzük. Precizitás A mérési gyakorlatban a véletlen hiba mérőszáma a precizitás, mely a kölcsönösen független megismételt vizsgálatok eredményei közötti egyezés mértéke a becsült tapasztalati szórással (standard deviáció, SD), vagy a százalékos szórással (relatív standard deviáció, RSD) kifejezve. 4. Mérési feladat A gyakorlat célja sörminták etanol-tartalmának meghatározása két különböző módszerrel, ill. a két módszer bizonyos teljesítményjellemzőinek meghatározása. A minőségi azonosítás a retenciós idők alapján, a standard oldatokról és egy sörmintáról felvett kromatogram összehasonlításával, a mennyiségi meghatározás pedig a kalibrációs egyenesek alapján történik. 4.1 Kromatográfiás körülmények Agilent 6890 gázkromatográf Agilent automata mintaadagoló Agilent 7683 Split/Splitless injektor, hőmérséklete: 200 C, split injektálás 50:1 split arány Injektált mennyiség 1 μl HP Innowax oszlop (poláris, polietilén-glikol (PEG) állófázis, 15 m x 0,25 mm x 0,25 m) Vivőgáz: hidrogén (5.0), 50 cm/s lineáris áramlási sebesség Elválasztás a következő program szerint: 50 C (3 perc) 50 C/perc 200 C (2 perc) Lángionizációs detektor (FID), hőmérséklete: 225 C Make-up gáz: nitrogén (5.0)
4.2 Kalibráció A gyakorlat során hárompontos, belső standard kalibrációt használunk, belső standardunk az n-propanol. A kalibrációs pontok koncentrációja 2; 5; 8 v/v % etanoltartalom - sörre nézve. Kalibráló oldatok készítése: 10 ml es mérőlombikot félig töltünk desztillált vízzel, hozzáadunk 40 μl n-propanolt, majd a különböző pontoknak megfelelően 40, 100, illetve 160 μl etanolt, végül jelig töltjük desztillált vízzel. 4.3 Sörminták mérése A módszer közvetlen mérés Az etanoltartalom közvetlenül, minta-előkészítés nélkül is meghatározható a mintából. A magas szárazanyag-tartalom azonban szennyezi a készüléket, csökkentve egyes részek élettartamát, ezért a mintákat ötszörös hígítás után injektáljuk. Ennek megfelelően 20 ml sört 15 percig ultrahang segítségével buborékmentesítünk, majd négy darab 10 ml es mérőlombikot félig töltünk desztillált vízzel, hozzáadunk 2 ml sörmintát és 40 μl n-propanolt. A precizitás megállapításához 3, azaz három párhuzamos mintára van szükség, ezeket ezután jelig töltjük desztillált vízzel. A negyedik mintát a torzítatlanság meghatározására használjuk fel. Mivel nem áll rendelkezésre olyan mátrix, ami a sörmintával megegyezik, és nem tartalmaz etanolt, ezért az adott mintát kell felhasználni. Ezért a negyedik mintához jelre töltés előtt ismert mennyiségű, jelen esetben 40 μl etil-alkoholt adunk, majd ezután töltjük jelre a lombikot. A mérés eredménye a hozzáadott és az ismeretlen alkoholtartalom összege. Az ismeretlen alkoholtartalmat a három párhuzamos mérésével meghatározzuk, ezt az értéket kivonva az eredmény a hozzáadott etanol mért értéke. A mért és a valós érték hányadosa a torzítatlanságot jellemző szám, melyet %-ban szoktak megadni. B módszer közvetett mérés Sörminták etanoltartalma meghatározható etil-acetátos extrakcióval is, bár ezen módszer időés oldószerigénye jelentősen nagyobb. Az A módszernél elkészített kalibráló oldatokat használjuk ebben a pontban is. Ebben az esetben is három párhuzamos mintát és egy adalékoltat készítünk. 2 ml sörmintát fiolába mérünk, 40 μl n-propanolt és az adalékolt esetén 40 μl etanolt adunk hozzá, majd 5 ml etil-acetátot és a gyorsabb fázisszeparáció érdekében 150 mg NaCl-t mérünk hozzá, majd alaposan összerázzuk. A fázisok szétválása után a felső etil-acetátos fázist lepipettázzuk és egy 40 ml-es kupakos fiolába öntjük. Az extrakciót újabb 5 ml etil-acetáttal megismételjük és az előzőleg gyűjtött extraktummal egyesítjük. Vízelvonószerként 5 g Na 2 SO 4 t adunk hozzá.
4.4 Jegyzőkönyv A gyakorlat során a következő kromatogramokat kell felvenni: A és B módszerrel előkészített kalibrációs pontok (3-3 db) A és B módszerrel előkészített sörminta 3-3 párhuzamos mérése (Σ 6 db) A és B módszerrel előkészített adalékolt minta A jegyzőkönyvben szerepeljenek (a minden gyakorlatra érvényes követelményeken kívül): a gyakorlaton végzett munka összefoglalása kb. 10 mondatban a kromatográfiás körülmények a kapott csúcsterületek a kalibrációs egyenesek a sörminta etanol koncentrációja V/V%-ban megadva a módszerek precizitása RSD%-kal jellemezve a módszerek torzítatlansága %-ban kifejezve a módszerek rövid szöveges összehasonlítása Gyakorlatvezetők: Nyiri Zoltán (zoltan.nyiri@ekol.chem.elte.hu) A jegyzőkönyvet a gyakorlatot tartó gyakorlatvezetőnek kell elküldeni a fenti e-mail címre a követelményrendszernek megfelelő időkeretben. Kezdés: a 602-es laborban 13 óra 15 perckor UI.: sört hozzatok magatokkal!