Programozott sejthalál formák és kulcsfehérjéinek kapcsolata - fókuszban a ferroptózis és az autofágia Dr. Szarka András Dr. Kapuy Orsolya V. MedInProt Konferencia 2016. November 19.
Bevezetés
Bevezetés Autofágia nemcsak a tumor-szupresszióban játszhat kulcsszerepet, de ugyancsak indukálhatja a tumorsejtek növekedését azáltal, hogy hipoxiás környezetben tápanyagokat tud biztosítani a sejt számára. A ferroptózist, illetve a ferroptózist kiváltó erasztint és RSL3-at (RSL: RAS-selective lethal) egy RAS mutáns tumor sejtek szelektív letalitását célzó vizsgálat során fedezték fel. A közelmúltban kiderült, hogy a p53 képes ROS indukálta oxidatív stressz esetén mind az apoptózis, mind a ferroptózis folyamatát iniciálni. A ferroptózis az autofágiához hasonlóan egyféle tumor-szupresszornak tekinthető, sőt, az sem kizárt, hogy a két folyamat együttesen vagy egymást követően aktiválódik, mintegy gátolva az apoptózist és a nekroptózist.
Célkitűzések 1. a ROS indukálta programozott sejthalál típusok időbeliségének, és az ezekben szerepet játszó kulcsfehérjék egymásra hatására vizsgálata 2. a ferroptózis szabályozásának és kapcsolatának vizsgálata az egyéb sejthalál mechanizmusokkal (autofágia, apoptózis, nekroptózis) Kapcsolódási pontok MedInProt fókuszpontokhoz 1. Jelátviteli fehérjék szerepe gyulladásos és daganatos megbetegedésekben 2. Szabályozó fehérjék szerepe az öregedési folyamat(ok)ban
Kísérleti módszerek ferroptózis kiváltása RAS onkogén vonalakon (HepG2) erasztinnel, illetve primer hepatocitákon acetaminofennel és erasztinnel a sejtek életképességének folyamatosan nyomon követése CellTiterBlue reagenssel fehérjeminták ellenőrzése autofágia (LC3II, p62, ULK-555P), apoptózis (pro-caspase3, hasított PARP) és nekroptózis markerekre (RIP1,3, JNK) GSH szint mérése
Életképességi vizsgálat erasztin kezelési koncentráció beállítása 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 4 h 6 h 8 h 16 h 18 h 20 h 24 h 0 5 10 mm erasztin
HepG2 sejtek GSH szintjének változása erasztin kezelés hatására
Életképességi vizsgálat primer hepatociták APAP kezelése
Relatív GSH szint [%] APAP és Ferrostatin-1 kezelés hatása primer hepatociták GSH szintjére 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 control APAP (20 mm) APAP (20 mm) + Fer-1 (1 µm) Fer-1 (1 µm)
Kulcsfehérjék szintjének nyomon követése HepG2 sejtekben K 2 4 6 8 10 12 h LC3 II Ulk555-p Ulk T Rip3 procasp3 PARP Hasított PARP 4EBP1-p 4EBP1-T autofágia marker: tranziens aktiválódás, majd lecsengés nekroptózis marker: 8 h után a nekroptózis bekapcsol apoptózis marker: 10 h után az apoptózis bekapcsol mtor marker: mtor inakitváció nem figyelhető meg GapdH housekeeping fehérje AUTOFÁGIA APOPTÓZIS NEKROPTÓZIS
További tervek 1. Kombinált kezeléseket végrehajtása, melynek során ferroptózist váltunk ki RAS onkogén vonalakon (HepG2) erasztinnel, illetve primer hepatocitákon acetaminofennel és erasztinnel. A sejtek kezelését emellett következő ferroptózis gátlószerekkel (ferrostatin- 1, NAC, E-vitamin+C-vitamin), nekroptózis gátlószerekkel (necrostatin-1), autofágia induktorokkal (rapamycin, EGCG, rezveratrol) és autofágia gátlószerekkel (3-metiladenin, Wortmannin) egészítjük ki. 2. Egy egyszerű matematikai modell is készül, amely jól leírja a szabályozási hálózat dinamikai viselkedését ferroptózis esetén, és meg tudja jósolni a közös kutatás további irányát/irányait.
A megvalósításban résztvevő kutatók Holczer Mariann SE OVI Lőrincz Tamás BME ABÉT Nagy Ábel BME ABÉT Jemnitz Katalin MTA TTK Veres Zsuzsa MTA TTK
Köszönjük szépen a Támogatást és a Figyelmet!