Szedimentáció, elektroforézis BÓDIS Emőke, TALIÁN Csaba Gábor Biofizika előadás 2011 Február 28.
Szedimentáció Általában a cél a részecskék méretének vagy tömegének a meghatározása. A gravitáción alapuló módszerek csak a 2-50 µm részecskemérettartományban hatékonyak Kisebb molekulák esetén az ülepedés a centrifugálásos módszeren alapszik
Ülepedés gravitációs erőtérben F felhajtó = ρ 0 Vg ρ 0 F fr = fv A gravitációs és a felhajtó erők különbsége gyorsítja a részecskét, amíg egyensúlyba kerülnek a súrlódási erővel m, ρ Ezután az ülepedési sebesség állandó (v = konst.) F F = g felhajtó F súrl F g = mg ρvg ρ 0 Vg = fv ρ 0 : a közeg sűrűsége, m: tömeg, ρ: sűrűség, v: a mozgó gömbszerű részecske sebessége
ρvg ρ 0 Vg = fv V = 4 3 r3 π F súrl = 6πη 0 rv Gömbszerű részecskékre A súrlódás Stokes-törvénye (η 0 : a közeg viszkozitása, v: sebesség, r: a részecske sugara) ( ρ ρ ) 4 0 3 r3 πg = 6πη 0 rv mérhető v sed = 2r2 ( ρ ρ 0 )g 9η 0 számolható
Ülepedés centrifugális erőtérben: 1. Szedimentációs sebességi módszer Célja: molekulatömeg meghatározása (r nm) Hogyan számoljuk az erőket? v sebesség ω F súrl = fv m, ρ 0 2 F centrifug = mrω F felhajtó = ρ = F centrifug m ρ 2 0Vg ρ0 rω Archimedes : a kiszorított oldószer súlya F felh F f Centrifugális erő: gyorsuló koordináta rendszer
Meddig gyorsul a részecske? Addig gyorsul, amíg : F súrl = F centrifug F felhajtó m fv = mrω 2 ρ 0 ρ rω 2 = mrω 2 1 ρ 0 ρ Azután v=konst.? A centrifugális erő értéke függ a sugártól (a c = rω 2 ), a tengelytől távolodva növekszik. Ülepedés esetén a részecske sebessége tehát a tengelytől távolodva növekszik (helyfüggő) Nem
A Svedberg S = v rω 2 = m 1 ρ 0 ρ f S = ülepedés iállandó mérhető számolható Egység: 1 Sv = 10-13 s Ülepedési sebesség egységnyi térerőre Theodore Svedberg Svéd vegyész (1884-1971) Nobel-díj 1926-ban Alaki faktor! Összefüggés van az alaki faktor (f) és a diffúziós állandó (D) között: f = kt D = RT ND k a Boltzmann állandó, R az egyetemes gázállandó és N az Avogadro-szám. A tömeg meghatározásához az ülepedési módszert és a diffúziós méréseket kell kombinálni.
Az ülepedés folyamata részecskék koncentráció első derivált
Hogyan detektáljuk az ülepedő molekulákat? Schlieren optikai rendszer Az ülepedési határfelületnél kialakult koncentráció-gradiens egyben törésmutatógradienst is jelent. Ezt tudja a schlieren optika csúcs formájúra alakítani (deriválni). A csúcs elmozdulását videora rögzítve a szedimentációs állandóhoz szükséges adatok kiszámolhatók.
Az ülepedő meniszkusz képe
2. Ülepedési egyensúlyi módszer A részecskék várhatóan elérik a cső alját: itt az átlagos ülepedési sebesség 0. ω Egyensúly alakul ki az ülepedés és a termikus diffúzió között. r 1 A hőmozgás energiája a részecskék egy részét magasabb energiaállapotba hozza. r 2 A cső alja közelében a részecskék egy adott eloszlása jön létre.
A tengelytől mért r 1 és r 2 távolságokra az c 1 és c 2 koncentrációk aránya kiszámolható a Boltzmann-eloszlásból: energia E 2 E 1 c 2 E 1 c 1 kte c 1 c 2 = e 2 Az E 1 és E 2 helyzeti energiák különbsége: E 1 E 2 = m 2 ω 2 1 ρ 0 r 2 2 ρ 2 r 1 ( )
c c 1 2 = e E E 1 kt Helyettesítsük be (E 1 -E 2 )-t és vegyük a logaritmusát: 2 ln c c 2 1 = 2 mω 1 2kT ρ0 ρ ( 2 2 ) r r 2 1 mérhető számolható Az alaki faktorra és a kiegészítő diffúziós mérésekre nincs szükség.
A molekulák sűrűsége (ρ) mérhető a sűrűségi grádiens centrifugálás módszerével. Emlékeztető: F up = (ρ 0 / ρ) m r ω 2 és F c = m r ω 2 ha ρ 0 = ρ, akkor F c = F f és v = 0! Sűrűségi grádiens ω Megkapható, ha nagy sűrűségű kis részecskéket centrifugálunk (e.g. CsCl, CsBr) Ha ilyen közegben centrifugáljuk a mintát, a részecskék a megfelelő sűrűségnél állnak meg.
Példa: fertőzött vörösvértestek grádiens centrifugálása A bal oldalon fertőzött sejtek láthatók, amelyeket növekvő koncentrációjú percoll folytonos grádiensében választottak szét. A parazita eritrocitán belüli életciklusának különböző stádiumai elválnak a grádiens egyes részeiben.
Centrifuga Centrifuga < 10.000 rpm Szupercentrifuga 10.000 20.000 rpm Ultracentrifuga > 20.000 rpm Ultracentrifuga Preparatív UC: molekulák elválasztása méretük és molekulatömegük alapján Analitikai UC: molekulák méretének és moláris tömegének meghatározása
Elektroforézis Az elektroforézis olyan technika, amellyel elektromosan töltött molekulák választhatók szét fizikai tulajdonságaik (mint töltés, tömeg) alapján, amint egy mátrixon kényszerítjük keresztül őket elektromos áram segítségével.
Elektromosan töltött molekula mozgása elektromos térben Mik az erők? F súrl + F v + F Coulomb E
v F s F c F c = QE = ZeE + F E Meddig gyorsul a részecske? Amíg : F c = F f ZeE = fv Coulomb-erő: Súrlódási erő: F f = fv E= elektromos térerősség e= elemi töltés Z= töltésszám v = sebesség f = alaki faktor
Az elektroforetikus mobilitás u el = v E = Ze f Az egységnyi elektromos térerősség hatására elért sebességgel egyenlő. Gömbszerű molekulát feltételezve: ZeE = 6πηrv u el = Ze 6πηr (Stokes-törvény) A molekula sugara számolható
Alkalmazás Az elválasztási technikák alapja az, hogy a különböző sajátságú molekulák eltérően viselkednek. Típusok szabad áramlású (határ-) elektroforézis gélelektroforézis kapilláris elektroforézis Az elektroforézishez szükséges: nagyfeszültség, elektródás, puffer és közeg, amely a puffert tartalmazza A közeg lehet pl. szűrőpapír cellulóz-acetát szalag különféle gélek kapilláris
Szabad elektroforézis Elektroforetizáló edény: makromolekulákat tartalmazó oldattal feltöltik; + Az oldat fölé: puffert rétegeznek; Az elektródákra feszültséget kapcsolnak elektroforézis.
Szabad áramlású elektroforézis: A pozitív töltésű molekulák határa emelkedik a bal ágban + + a mozgó határvonal pozíciója optikai mérésekkel meghatározható (abszorpció) magasság-koncentráció függvény rajzolható számolható sebesség
Az elektroforetikus mobilitás meghatározása mérhető u el = v E = Ze f = Ze 6πηr számolható Az elektromos térerősség számolása Ohm törvényéből: Egy folyadékoszlop ellenállása, ahol x a magasság, A a keresztmetszet, ρ=1/σ a specifikus ellenállás, σ a specifikus vezetőképesség így: R = ρ x A = x σa E = U x = I R x = I x xσa = I σa A x
Gélelektroforézis Az elválasztási komponensek egy gélben vannak: poliakrilamid, agaróz fehérjék óriásfehérjék, DNS, RNS - a futási paraméterek a mintához igazodnak; - a sebesség a fehérjék méretétől függ.
PAGE (poliakrilamid gélelektroforézis, 1959) 3D hálózat pórusok Akrilamid Ammónium-perszulfát: megindítja a polimerizációt TEMED: szabad gyökök, amelyek katalizálják a polimerizációt Bis-akrilamid: keresztköti a szomszédos polimereket és merev gélt képez; koncentrációja meghatározza a pórusok méretét
A molekuláknak ugyanabban az irányban kell haladniuk SDS (sodium-dodecilsulfate) anionos detergens: anionos poláros vég és hosszú apoláros farokrész denaturáló ágens a fehérjék apoláros részeihez kapcsolódhat, elektromos kölcsönhatást létesít a pozitív régiókkal, a negatív régiók szabadon maradnak minden fehérje negatív lesz molekulák szétválasztása egy adott ph-n a méretük alapján (a kicsik gyorsabban, a nagyok lassabbak!) A futás színes markerekkel követhető (pl. brómfenolkék) kis molekulatömeg, elöl fut
SDS-poliakrilamid gél Festés (CoomassieBlue): az egyes fehérjék különálló csíkokban jelennek meg: fotometrálható (Amido-fekete, Fast green) Gyakran ismert molekulatömegű markereket futattunk egy külön sávban a gélen, és az ismeretlen fehérje mérete meghatározható a markerhez viszonyítottan megtett távolság alapján. Ezüst festés : fémes kolloid ezüst lerakódása a gélben a fehérjecsíkok helyén. A kereskedelmi ezüst kitek rendkívül robusztusak és könnyen használhatók. Egy tipikus gélben kevesebb mint 0,5 ng fehérje detektálható,de nagyon tiszta környezetet igényel.
Gradiens gél A futási úthossz mentén változik a gél sűrűsége, amely azt eredményezi, hogy amelyik fehérje nagyon előreszaladna a gélben, azt lefékezi a sűrűség okozta nagyobb ellenállás. Ennek előállítása hasonló a kromatográfiás eljárásokból ismert gradiens elúció kivitelezéséhez; a különböző sűrűségű géleket az adagolópumpa megfelelő módon egymáshoz keveri.
Izoelektromos fókuszálás - a fehérjéket a töltésük szerint választja el, pontosabban a pi alapján; - a fehérjéknek negatívan és pozitívan töltött csoportjaik is vannak; - Ha a ph változik, a nettó töltésük is változik; magas ph-n: negatív; alacsony ph-n: pozitív. -Izoelektromos pont: az a ph érték, ahol a fehérje nettó töltése 0; -Az elektroforézist egy ph-grádiensben végzik: a makromolekulák addig a pontig vándorolnak, ahol a rájuk jellemző pi van, itt elvesztik a nettó töltésüket és megállnak. -Egyensúly alakul ki az elektroforézis és a diffúzió között -A különböző pi értékű komponensek elválaszthatók
The application of the method ph gradient in a thin tube filled with gel; Electrophoresis in this medium; During the running the ph is changed around the protein and the net charge is decreasing. the proteins are running until they reach their corresponding pi point: the net charge becomes zero, the motion stops; equilibrium between electrophoresis and diffusion; the components with different pi values can be separated.
Kétdimenziós elektroforézis Alapelv: kétféle elválasztási módszert alkalmaznak és a minta fehérjéit két különböző sajátság alapján választják el. Merőlegesen fut a két módszer: 1. elválasztás izoelektromos fókuszálással (pi); 2. SDS-PAGE gélelektroforézis (molekulaméret).
Nagyon jó felbontás!
Egy példa a kétdimenziós gélelektroforézisre
2D-PAGE Első lépés: izoelektromos fókuszálás ph 3 ph 10 biotech.szbk.u-szeged.hu/kk_jegyzet/.../5_downstream_1.ppt
biotech.szbk.u-szeged.hu/kk_jegyzet/.../5_downstream_1.ppt