AMISAVAK, PEPTIDEK, FEÉJÉK Aminosavak szerkezete, fizikai, kémiai tulajdonságai, biokémiai szerepük. Konvenció szerinti rövidítések. Aminosavak szintézise. A kötés szerkezete. Peptidszintézisek, védőcsoportok, kapcsolási eljárások, a szilárd fázisú technika. A fehérjék primer, szekunder, tercier, illetve kvaterner szerkezete. A amachandram diagram. A fehérjék csoportosítsa és biokémiai szerepük. Aminosavak szerkezete Az aminosavak amino-, illetve karboxilcsoportot egyaránt tartalmazó vegyületek. Az aminocsoport helyzete alapján megkülönböztethetünk α-, β-, γ- -aminosavakat. A köznapi nyelvhasználatban aminosavak alatt általában az α-aminosavakat értjük. 3 C 3 C 3 C -aminovajsav -alanin glicin Az α-aminosavakban egy szénatom választja el egymástól a karboxil-, és az aminocsoportot. A glicint kivéve ezért minden α-aminosav királis. A természetben általában L-térállású aminosavak fordulnak elő. A természetes L-aminosavak a CIP szabály szerint többnyire (S)-térállásúak. Ez alól kivétel az L-cisztein, ami (). Ennek oka, hogy a cisztein királis szénatomjához kapcsolódó C2-S a CIP nomenklatúra szerint magasabb rendű, mint a C. 3 C 3 C C 2 3 C (S) C 2 S 3 C () -L-aminosavak Sav-bázis tulajdonságok L-szerin L-cisztein Az aminosavakban egyszerre van jelen egy savas jellegű (karboxil-), illetve bázikus jellegű (amino-) csoport, tehát sav-bázis tulajdonságaik tekintetében amfoterek. A molekula karboxilcsoport része általában elég erős sav ahhoz, hogy protonálja a molekula bázikus jellegű részét. Tehát a savas csoport pka-ja kisebb a bázikus jellegű csoport pka-jánál. Emiatt az aminosavak jellemzően ikerionos (A )(B + ) formában fordulnak elő. A karboxilcsoport deprotonált, azaz negatív töltésű az aminocsoport pedig protonált, azaz pozitív töltésű. Ez azt jelenti, hogy bár a molekula össztöltése semleges, a benne található két molekularészlet pozitív, illetve negatív töltéssel rendelkezik. Ennek következtében az aminosavak ionrácsban kristályosodnak, illetve magas az olvadáspontjuk. Az aminosavak oldatban is ionos formában vannak jelen, azonban a molekulák protonáltsága p függő. Savas környezetben mindkét funkciós csoport protonált formában van jelen. Így az aminosav össztöltése pozitív lesz, tehát az aminosav kationos (A)(B + ) formában lesz jelen. Bázikus környezetben mindkét csoport deprotonálódik. Az aminosav így negatív, anionos (A )(B) formában lesz jelen. A két véglet között van egy olyan p érték, amelyen az aminosavmolekulák össztöltése semleges. Ez az ikerionos (A )(B + ) formára jellemző p az aminosav izoelektromos pontja (pi). Ez nem feltétlenül p 7-nél van, hiszen függ az aminosavak oldalláncától is. 1
Az aminosavak titrálási görbéjét tekintve a fent leírtak jól látszanak. Alacsony p-n az aminosav 100%-ban (A)(B + ) formában van jelen. Az a p, amelyen 50% a kationos, és 50% az ikerionos forma aránya, megegyezik a (A) csoport pka-értékével. Az izoelektromos pontnak megfelelő p-n az aminosav össztöltése semleges, ikerionos formában van jelen. Az a p, amelyen 50%-ban van jelen az ikerionos és az anionos forma, megegyezik a (B + ) csoport pka értékével. Az alanin titrálási görbéje. Forrás: https://chem.libretexts.org Az aminosav protonáltságának leírása akkor bonyolultabb, ha az aminosav az oldalláncán is protikus csoportot tartalmaz. Példaként az amfoter oldalláncú hisztidint mutatjuk be. + - Stabil aromás kation Biológiai funkciók Stabil aromás anion Biológiai szempontból az α-aminosavaknak van a legnagyobb jelentősége, hiszen eukariótákban ezek alkotják a sejtműködés szempontjából kulcsfontosságú makromolekulákat, a fehérjéket. Az eukarióta szervezetekben a glicinen kívül 19 fehérjeépítő L-α-aminosav fordul elő, melyeket oldalláncuk alapján csoportosíthatunk. emzetközi megállapodás alapján ezen aminosavakat nevükből képzett hárombetűs rövidítéssel jelölhetjük, bonyolultabb esetben egybetűs rövidítés is használható. Mindezt az alábbi ábra foglalja össze. A számunkra szükséges aminosavak egy részét szervezetünk képes előállítani, de vannak olyan aminosavak, melyeket táplálékkal kell bevinnünk. Az aminosavak fehérjeépítő szerepük mellett egyéb fontos funkciókat is elláthatnak. A glutaminsav, illetve a GABA (γ-aminovajsav) például egymással ellentétes hatású ingerület átvivő anyagok, a β-alanin pedig a koenzim-a alkotórésze. 2
3 C Q év Kód pi ldallánc (Q) év Kód pi ldallánc (Q) Poláris aprotikus oldalláncú aminosavak Alifás oldalláncú aminosavak Szerin Ser (S) 5,68 -C 2 Glicin Gly (G) 6,06 - Cisztein Cys (C) 5,05 -C 2 S Alanin Ala (A) 6,11 -C 3 Me Treonin Thr (T) 5,60 3 C Valin Val (V) 6,00 3 C ipr Tirozin Tyr (Y) 5,64 Leucin Leu (L) 6,01 3 C C 3 C 3 ibu Aszparagin Asn() 5,41 Glutamin Gln (Q) 5,65 -C 2 C 2 -C 2 C 2 C 2 Izoleucin Ile (I) 6,05 3 C C 3 sbu Metionin Met (M) 5,74 -C 2 C 2 SC 3 Prolin Pro (P) 6,30 2 C (aminosav képlete) Savas oldalláncú aminosavak Aszparaginsav Asp (D) 2,85 -C 2 C Glutaminsav Glu (E) 3,15 -C 2 C 2 C Aromás apoláris oldalláncú aminosavak Fenilalanin Phe (F) 5,49 Triptofán Trp (W) 5,89 -C 2 Ph Bn Bázikus oldalláncú aminosavak Lizin Lys (K) 9,60 -[C 2 ] 4-2 Arginin Arg () 10,76 -[C 2 ] 3-2 Amfoter oldalláncú aminosavak isztidin is () 7,60 Bázikus Savas Előállítás Az aminosavak kémiai szintézise azért fontos kérdés, mert a fehérjékből történő kinyerésük nem robosztus, viszont számos esetben nagy mennyiségű, tiszta aminosavra lehet szükség (gyógyszeripar, élelmiszeripar, szintézisek ). Az alábbiakban a fontosabb módszereket vesszük át. 1. Aminocsoport beépítése a karbonsav α-helyzetébe A karbonsavból kiindulva formálisan az α-szénatomon lévő -atomot cseréljük le aminocsoportra. Ez közvetlenül nem lehetséges, először halogénatomot kell beépítenünk. Az α-szénatomra történő bróm beépítése például úgy lehetséges, hogy a karbonsavat reagáltatjuk tionil-kloriddal (SCl2 savkloridot előállítva), majd brómmal (α-brómozott savklorid keletkezik), végül hidrolízissel kapjuk meg az α-brómozott savat (lásd: α-helyettesített savak előállítása). 3
A halogénezett savat például ammóniafeleslegben (a), alakíthatjuk tovább. agyon fontos, hogy ez esetben az ikerionos szerkezet keletkezése miatt lesz szelektív a reakció, a primer aminocsoport így nem tud tovább alkileződni. A Gabriel-szintézis alkalmazásakor észterből kell kiindulnunk (a ftálimid-sót protonálná a sav), illetve a ftálimidet vissza kell nyernünk a reakció után, hogy növeljük a reakció atomhatékonyságát. E módszerrel elsősorban olyan aminosavakat tudunk előállítani, amelyekhez a kiindulási karbonsav (pl. ecetsav, propionsav, izovaleriánsav) rendelkezésre áll. ε-kaprolaktámból kindulva az ε- aminocsoportot benzoil-kloriddal védve, ugyancsak a Gabriel-szintézist alkalmazva kaphatjuk a lizint. a) Ammóniafelesleggel lg C 3 felesleg 3 C b) Gabriel-szintézissel (ftálimiddel) K Br CEt DMF Melegítés Gly, Ala, Val CEt + / 2 3 C Gly, Ala, Val 1. 3 2. K C C 1. + / 2 2. PhCCl/ K Bz [C 2] 4 C 1. SCl 2 2. Cl 2 3. Et Bz [C 2] 4 CEt Cl K 3 [C 2] 4 3 C + / 2 Bz [C 2] 4 CEt Ft Lys 2. Szénlánchosszabbítás és aminocsoport beépítés az aktivált ecetsav α-szénatomján Az előbbi módszernek az a hátránya, hogy a megfelelő karbonsav kiindulási anyagnak rendelkezésre kell állnia, amely bonyolultabb oldalláncú aminosavaknál nem triviális. Karbonsavak α-szénatomjára nem tudunk közvetlenül szénatomot kapcsolni, erre alkalmas módszerek a korábban is tanult acetecetészter-, illetve malonészter-szintézisek. 4
a) Acetecetészter szintézis C C C 2 CEt 1. aet 2. Br Ph 2 + Cl - a CEt ibu cc. 2 S 4 CEt C Ph 1. cc.a 2. + 2 /Pd/C CEt Ph 3 C 2 /Pd/C Val, Leu, Ile, Phe C Az acetecetészter-szintézis során elsőként az oldallánc beépítése történik meg, majd ezt követi az aminocsoport kialakítása. Ehhez pozitív töltésű nitrogéntartalmú reagenst kell alkalmazni, ami egyrészt lehet az izobutil-nitritből (ibu) savas közegben képződő (+), vagy másrészt a benzoldiazónium-klorid. A köztitermék nitrozo-, illetve diazenilszármazék az erősen savas, illetve lúgos közegben spontán retro-claisen reakcióval fragmentálódik. A keletkezett karbonsav-α-oximot, illetve -α-fenilhidrazont katalitikus redukcióval alakítjuk a kívánt végtermékké. A malonészter-szintézis során fordított sorrendet alkalmazunk, először történik a védett aminocsoport kialakítása, és ezt követi az oldallánc kiépítése. A savas közegű nitrozálással kialakított oxim katalitikus redukciója során ecetsav-anhidridet alkalmazunk, hogy a keletkező aminocsoportot in situ acetilezéssel védjük. Ezt követően az oldalláncot bázikus közegben alkilezéssel (Br), aldehiddel (C), vagy telítetlen savszármazékkal (pl. akrilnitril) történő reakcióval alakítjuk ki. A végterméket vagy savas hidrolízissel kapjuk, vagy további reakciólépések is szükségesek. Pl.: A nitrilcsoportot katalitikusan redukáljuk, a keletkező amino-észter spontán laktámgyűrűvé záródik. A savas hidrolízissel kapott ornitint ciánamiddal lehet a végtermék argininné alakítani. A malonészter-szintézist kombinálhatjuk a Gabriel-szintézissel is. Ez esetben a brómmalonésztert reagáltatjuk ftálimid-kálium-sóval. Ezt követően az oldalláncot bázikus közegben alkilezéssel (Br), aldehiddel (C), vagy telítetlen savszármazékkal (pl. akrilészter) történő reakcióval alakítjuk ki. A végtermékeket savas hidrolízissel kapjuk. 5
b) Malonészter szintézis C 2 C C 2 1. 2 beépítés nitrozálással EtC CEt a 2 Cl EtC CEt EtC CEt Ac 2 2 /Pt/C EtC CEt Ac aet 3 ornitin C 2 + / 2 2 C Bázis Ac CEt i/ 2 C EtC C CEt Ac C 2 CC C a EtC C C 2Et Ac 1. Br 2. + / 2 3 Arg C 3 C + / 2 EtC C CEt Ac 3 C 2 Ser (=), Thr (=Me) Val, Leu, Ile, Phe 2. 2 beépítés ftálimiddel EtC CEt Br 2 CCl 4 EtC Br CEt K CEt CEt aet + / 2 CEt C CEt CEt 1. C CEt 2. + / 2 CEt C CEt 1. Br 2. + / 2 a 3 C 3 C C Val, Leu, Ile, Phe Glu CEt Ser (=), Thr (=Me) 3 6
3. Addíciós reakciók Telítetlen karbonsavra közvetlenül addícionáltatható az ammónia (lásd: aszparaginsav előállítása). Számos esetben azonban az aminosav-szintézis köztitermékének kialakítását végzik addícióval. C C 3 C C 3 Asp C Br C Br 1. Et/ + 2. Ftálimid-K 3. + / 2 C 3 Thr C MeS MeS C Strecker-Zelinszkij 4 Cl/ KC MeS C 3 4. Strecker-Zelinszkij szintézis: amino- és karboxilcsoport one-pot kiépítése A Strecker Zelinszkij-, vagy rövidebben csak Strecker-szintézis során oxovegyületeket reagáltatunk 4Cl-dal és KC-dal. A reagens valójában az in situ keletkező instabil 4C. Az enyhén savas p (erősen savas p-n C távozna a reakcióelegyből) és az egyensúly eltolása érdekében ammónium-klorid felesleget kell alkalmazni. A köztitermék aminosav-nitril további sav hozzáadására könnyen hidrolizál, kialakítva ezzel az α-aminosav terméket. 4 C 4 Cl, KC in situ: 3 + C X X X Met 2 2 C aminosav-nitril + / 2 Phe, Tyr X=, X 3 C 7
5. Azlakton szintézis: oldallánc beépítése a glicin α-szénatomjára A szintézis során a glicinre, mint a legegyszerűbb aminosavra aldehidek segítségével építjük be a megfelelő oldalláncot. Ehhez a glicin aminocsoportját védeni, az α-helyzetű C2- csoportot aktiválni kell. A védést és aktiválást az aminocsoport benzoilezésével, és az - benzoilglicin (hippursav) ecetsav-anhidriddel, mint vízelvonószerrel történő gyűrűzárásával oldjuk meg. Azolakton gyűrűre kondenzáltathatóak aromás gyűrűt tartalmazó aldehidek. 2 C PhCCl a Bz C Ac 2 aac C aac Ac 2 Phe/ Thr/ Trp/ is 3 + C - 1. a/ g/ K 2. + / 2 vagy 1. 2 /Pt/C 2. + / 2 6. ezolválás A fenti módszerek egyike sem alkalmas enantiomertiszta termékek előállítására. Ehhez a korábban előállított racém vegyületet rezolválni kell. Egy igen gyakori módszer a rezolválásra a diasztereomer sópár-képzés. Ez aminosavak esetén azért problémás, mert egyszerre tartalmaznak savas, illetve bázikus csoportot. Sóképzés előtt ezért védeni kell valamelyik csoportot, ha például az alanin esetén az aminocsoportot acilezéssel védjük, királis bázissal (sztrichnin, brucin) megoldható a rezolválás. 2 D,L-Ala C PhCCl a Bz C sztrichnin brucin Bz C brucin- csapadék (Bz-L-Ala-só oldatban marad) + / 2 / - + 3 C - + / 2 / - Bz C sztrichnin- + 3 C - L-Ala csapadék (Bz-D-Ala-só oldatban marad) D-Ala A rezolválás során a rosszabbul oldódó sót kiszűrjük az oldatból, és az átkristályosított anyagból savas hidrolízissel kapjuk az enantiomer-tiszta terméket. 8
Bevezetés Peptidek, fehérjék A ek 2-50 aminosavegységből felépülő polimerek. Fehérjéknek az 50-nél több építőegységből felépülő polieket (proteinek) és a nemcsak polipetid-típusú alkotórészeket tartalmazó komplex molekula-társulásokat nevezzük. Az aminosavak a karboxil- és az aminocsoportjaik révén kötéssel kapcsolódnak össze. A kötés a C és az csoport között lévő kovalens (savamid) kötés. agyon fontos, hogy a C() szerkezeti rész egy síkban van. Ennek oka az, hogy a nitrogén nemkötő elektronpárja, valamint az oxigén π-elektronjai delokalizálódnak. Az -terminális a szabad aminocsoportja, a C-terminális a szabad karboxilcsoportja. A eket alkotó aminosavakat az -terminálistól kezdve soroljuk fel. Az alkotó aminosavaknak a hárombetűs kódját használjuk, hosszabb ek esetén pedig az egybetűs kódokat. -terminális 3 1 2 C C-terminális Peptidszintézisek kötés C delokalizált elektronrendszer A ek szintézise az alkotó aminosavak kapcsolásával történik. Az aminosavak azonban bifunkciós vegyületek. Két aminosav kapcsolásával tehát több termék is keletkezhet. Ezért a leendő di -terminális, valamint a C-terminális csoportját le kell védenünk, a kapcsolódó karboxil-csoportot pedig aktiválni kell. A védőcsoporttal szemben alapvető elvárás, hogy a mind a kiépítési, mind az eltávolítási reakció minél egyszerűbb legyen, illetve jó termeléssel menjen végbe. Q-Leu Ala-Q Q-Leu-Ala-Q -terminálison védett as. 2-védése C-terminálison védett as. Di Q-Leu-Ala Q Lys ldalláncon is védett as. A következő táblázat összefoglalja az aminocsoport védésére alkalmas reakciókat, illetve a védőcsoportok eltávolítását. Q... 9
év Kiépítés Termék Eltávolítás Benziloxikarbonil-csoport (jele: Z) Cl K 2 C 3 Z Pd/C/ 2 terc-butoxikarbonil-csoport (jele:boc) t BuC 3 / Et 3 vagy ( t BuC) 2 / K Boc + Fluorenilmetoxikarbonil csoport (jele: FMC) Cl Et 3 FMC Me 2 Ftaloil-csoport (jele:ft) Ft Me 2 Tozil-csoport (jele: Tos, vagy Ts) S 2 Cl Piridin Tos a/ 3 C-védése Az alábbi táblázat ábra összefoglalja a karboxilcsoport védésére alkalmas reakciókat, illetve a védőcsoportok eltávolítását. év Kiépítés Termék Eltávolítás Benzil-csoport (jele: Bn) Tos CBn Pd/C/ 2 Metil-csoport (jele: Me) Me SCl 2 CMe ai 10
Uretán-típusú védőcsoportok kiépítése és eltávolítása: Ph Cl 3 C K 2 C 3 Ph C Ph 2 /Pd/C Ph C 3 C 2 2 3 C K 2 C TFA C 2 2 Cl C 3 C Et 3 Me 2 C 2 2 Ftaloil-védőcsoport kiépítése és eltávolítása 3 C C Me 2 Me 2 11
Tozil-védőcsoport kiépítése és eltávolítása S 2 Cl Me S C 3 C Py Me Me S a/ 3 Me S 2 2 Észter-típusú védőcsoportok kiépítése és eltávolítása: S 3 Me S 3 3 C PhC 2 Me 3 CBn Peptid Bn 2 /Pd/C Peptid + PhMe 3 C SCl 2 Me 3 Cl CMe Peptid Me ai Peptid a + MeI Fontos megjegyezni, hogy az észterek aminocsoportjának mindig protonált formában kell lennie (pl.: tozilát-, klorid-só), az önkapcsolás elkerülése miatt. Aktiválás A karboxilcsoportot valamilyen erősebb acilezőszerré (pl.: savklorid, savazid, vegyes anhidrid) alakítjuk. 12
Q CCl Savklorid PCl 5 Q C Me/ SCl 2 Q CMe 2-2 Q C 2 a 2 / Cl Q Cl Kapcsolás Me Me 1. agyományos módon Savanhidrid Savazid Q C 3 Ez esetben a megfelelően védett és aktivált aminosavakat egyesével reagáltatjuk, a köztitermék eket pedig kipreparáljuk, Lineáris szintézis során az alkotó aminosavakat sorban kapcsoljuk hozzá az egy aminosavval rövidebb re. Itt a hátrány, hogyha például egy lépésre 90%-os termelést feltételezünk, akkor az n aminosavból álló re a végső termelés csupán 0,9 n lesz. Konvergens szintézisnél külön-külön szintetizáljuk a ek nagyobb darabjait, majd ezeket kapcsoljuk össze. Ekkor a termelés magasabb lesz. Q 1 A Cl 3 2 Et 3 Q 1 y = 90% 2 Konvergens szintézis Lineáris szintézis A C E G B D F AB CD EF G ABCD EFG ABCDEFG y=0,9 3 A B AB C ABC D ABCD E ABCDE ABCDEFG ABCDEFG G y=0,9 7 F ABCDEF 2. Leuchs-anhidriddel A Leuchs-anhidrid képzése során ugyanazzal a reagenssel a karboxilcsoportot aktiváljuk az aminocsoportot pedig védjük. agy előnye a hagyományos módszerhez képest, hogy a kapcsolás során a védő-aktiváló csoport szén-dioxidként távozik, nem kell tisztítani a köztes termékeket, ezért jobb termelés érhető el. Így kb. 10 aminosav kapcsolható össze lineáris módon, amely 10 tagú fragmenseket konvergens szintézisstratégia alkalmazásával hagyományos úton kapcsoljuk össze hosszabb dé. 13
3 C 2 + Et 3 2 1 C 3 1 Leuchs-anhidrid 3 Cl Me Et 3 2 2 3 C 3 C 3 1 10-tagú ek szintézise 10-tagú ek kapcsolása Lineáris Leuchs-szintézis Konvergens szintézis + C 2 A B BA C CBA D DCBA E EDCBA GFEDCBA GFEDCBA G I IGFEDCBA J JIGFEDCBA F FEDCBA pep1 pep1 pep2 pep3 pep4 pep2-pep1 pep4-pep3 hasonlóképpen pep2, pep3 és pep4 fragmens 3. Szilárd fázisú szintézis A módszer lényege, hogy a C-terminális aminosavat észter-kötéssel szilárd fázisú polimerhez kötjük. A soron következő, aminocsoportján védett aminosavat DCC-vel (diciklohexilkarbodiimid) együtt adagoljuk. A DCC in situ aktiválószerként működik, vegyes anhidridet képez az aminosavval. A kapcsolási lépés után az -védőcsoportot eltávolítjuk, majd a következő aminocsoportján védett aminosavat kapcsoljuk a polimeren növekedő lánchoz. A végén F-dal hasítjuk le a termék et a szilárd fázisról. Cl C DCC BC 2 C 3 1 C Et 3 BC 2 in situ aktiválás 2 2 C 1 2 BC DCU TFA F Termék F... BC 3 C DCC 1 2 2 14
A módszer előnye, hogy folytonos-átfolyásos üzemű csőreaktorban automatizálható; a reagensek feleslege, illetve a melléktermékek az szilárd fázisról könnyen lemoshatóak; illetve a reagensoldat recirkuláltatásával a konverzió nagy reagensfelesleg alkalmazása nélkül is növelhető. Így az egyes kapcsolások során közel 100%-os termelés érhető el. Ezzel az eljárással 100-nál több aminosavból álló lánc is szintetizálható. 4. Bioszintézis Teljes fehérjemolekulák legújabb szintézismódszere az itt részleteiben nem ismertetett bioszintézis. Ehhez először a fehérje aminosav-sorrendjét kódoló m-s-t állítják elő szilárdfázisú szintézis alkalmazásával, majd a kész m-s-t megfelelő baktériumsejtbe juttatva szintetizáltatják a fehérjét. ldalláncok védése Egyes esetekben a szelektivitás megőrzése érdekében szükség lehet az oldalláncon lévő funkciós csoportok védésére is. Az alábbi ábra a védőcsoportok kiépítését, illetve eltávolítását mutatja be. Cisztein Q C S a BnCl Q C S Bn a pep S Bn pep S 3 Szerin / Treonin Q BnCl Q Q 2 /Pd/C Q C BnC BnC tbu C tbu pep tbu TFA vagy F pep Arginin Q C 3 2 3 2 S 4 Q C 2 3 2 pep 3 2 /Pt/C pep 3 2 Lizin 3 C 4 2 CuS 4 2 2 Cu 2 2 4 pep 4 4 Z Bn Cl ac 3 2 /Pd/C Z 2 Cu 2 4 Z pep 4 2 4 2 S 3 C 4 Z 15
Aszparaginsav / Glutaminsav 3 CuS 4 C n=1,2 n C C n 2 Cu 2 C n BnI ac 3 BnC 2 Cu 2 BnC n n 2 S 3 C n CBn pep n CBn 2 /Pd/C pep n C A fehérjék szerkezete A fehérjék primer (elsődleges) szerkezete az aminosav-sorrendjük. A DS a primer szerkezetet kódolja, és az aminosav-sorrend megszabja a fehérje további szerkezeti tulajdonságait is. A primer szerkezet meghatározása hagyományosan a teljes hidrolízisével történhet. A leggyakrabban alkalmazott módszer az itt részletesen nem ismertetett Edman-lebontás. Ennek során az -terminális aminosav felől egyesével lehasítjuk és azonosítjuk az aminosavakat (maximum 50 aminosav-egységig alkalmazható). Az ennél több aminosavból felépülő fehérjéket először rövidebb ekre kell bontani, ehhez az egyes kötéseket szelektíven kell elhasítani kémiai, vagy enzimatikus módszerekkel. Az egyes aminosavak azonosítására hatékonyan használható fel a PLC-MS analitika. Újabban bioinformatikai módszerekkel, a kódoló génszakaszok bázissorrendjéből határozzák meg a fehérjék aminosav-szekvenciáit. A fehérjék szekunder (másodlagos) szerkezetén a fehérjemolekula gerincének, a kötések között létrejövő hidrogénkötések által stabilizált, lokális konformációját értjük. A legfontosabb szekunder szerkezeti elemek a periodikus szerkezetű hélix, és redő, illetve az aperiodikus kanyar és hurok. Az α-hélix egy 18 egységenként ismétlődő jobb- (α) vagy ritkábban balmenetes (αl) spirál alakú szerkezeti rész. A szerkezetet a spirálban egymás felett helyet foglaló kötések közt kialakuló intramolekuláris -hidak stabilizálják. Ugyancsak helikális, de eltérő menetemelkedésű szerkezet a π-hélix. 16
A β-redő két, vagy több egymással párhuzamosan futó (azonos, vagy különböző molekulához tartozó) lánc részvételével létrejövő redőzött lemezszerű szerkezet, amelyet ugyancsak a kötések között létrejövő intra- vagy intermolekuláris -hidak stabilizálnak. β-paralell szerkezet esetén a láncok azonos, míg a β-antiparalell szerkezet esetén ellentétes irányúak. A másodlagos szerkezetet a sík szerkezetű (a karbonil szénatom és az amid nitrogénatom is sp 2 -es hibridállapotú) kötések egymáshoz képesti elfordulásával jellemezhetjük. at-hat atom van egy síkban, mely síkok az sp 3 -as hibridállapotú α-szénatom (Cα) kötései körül elfordulhatnak. A rotáció mindkét irányban megengedett, ellenben a rotációt az oldalláncok korlátozzák. Emiatt minél hosszabb a lánc, annál inkább rögzítettebb a jellemző konformáció. A Cα atom körüli rotációkat a ψ (karbonil C-atom felé) és ϕ (amid -atom felé) torziós szögekkel jellemezhetjük. A fehérjékben jellemzően előforduló torziós szögek ábrázolására alkalmas a amachandram-diagram. Az alábbi ábrán jól látszik, hogy számos konformáció nem előnyös, így a diagramon üres tartományok is találhatóak. Az előzőekben ismertetett periodikus szerkezetek jellemző torziós szögtartományai: α-hélix: ϕ < 0, 60 < ψ < 0 αl-hélix: ϕ > 0, 60 > ψ > 0 π-hélix: ϕ < 0, ψ ~ 60 β-redő: ϕ < 0, ψ > 60 A tercier (harmadlagos) szerkezet a fehérjemolekula oldalláncok helyzetét is tartalmazó tényleges térbeli elrendeződése, melyet az oldalláncok közötti diszulfid- és - hidak, van der Waals kölcsönhatások és Coulomb erők tartanak össze. Megkülönböztetünk globuláris, illetve fibrilláris fehérjéket. A globuláris tercier struktúrájú fehérje (pl: enzimek) minden irányban kb. azonos kiterjedésűek. A fibrilláris fehérjék (pl: α-keratin) a tér egyik irányában nagyobb kiterjedésűek, mint a másik kettő irányban. 17
A kvaterner (negyedleges) szerkezeten több protein és esetleg nem típusú alkotórész (prosztetikus csoport, koenzim) részvételével kialakuló diszulfid- és -hidak, van der Waals kölcsönhatások és Coulomb erők által összetartott komplex szerkezeteket értjük. A hemoglobin pl. négy proteinből és négy hem prosztetikus csoportból létrejövő fehérje. A fehérjék biológiai funkciói, csoportosítása A fehérjék a 20 féle fehérjealkotó α-l-aminosavból felépülő makromolekulák. A fehérjék csoportosítása többek közt történhet funkciójuk szerint, vízoldhatóságuk szerint (pl: az albumin vízoldható), stb. Összetétel szerint megkülönböztetünk proteineket (csak aminosavból épül fel), valamint proteideket (aminosavakon kívül egyéb szerkezeti elemeket is tartalmaz). Számos létfontosságú sejtfunkció köthető fehérjékhez, ezek közül néhányat alább sorolunk fel. Biokatalizátorok: az enzimek szerepe a sejtekben lejátszódó folyamatok aktiválási energiájának csökkentése. Szűk p és hőmérséklettartományban működnek. Szubsztrát-, kemo-, regio- és sztereoszelektivitás jellemző rájuk. Vázanyagok: pl. a miozin az izmokban fordul elő; a kollagén a bőr és a csontok mátrixa; az α-keratin a haj és a gyapjú jellemző fehérjéje. Az immunrendszer működésében vesznek részt: az immunoglobulinok antigének (idegen fehérjék) megjelenésekor termelődnek. Jellegzetes Y alakjuk van. A rövidebb szál felel a felismerésért, a hosszabb szál a makrofágokhoz (nagy falósejt) kapcsolódik, amelyek az idegentestek (vírusok, baktériumok, rákos sejtek, stb.) lebontását végzik. Információ átvitelben vesznek részt: pl: a rodopszin a látás során. A szabályozásban vesznek részt: pl. az agyalapi mirigyben termelt hormonok. Tápanyagforrások: pl. a növényi magvak és a tojások fehérjéi. Anyagtranszportban vesznek részt: pl. a hemoglobin az 2/C2 transzport fehérjéje. A hemoglobinban helyet foglaló négy porfinvázas prosztetikus csoport egy-egy 2/C2 molekula szállítására képes. A porfinvázas hem szerkezete 18