Genscreen HIV-1/2 Version 2 1 lemez lemez

Genscreen HIV-1/2 Version 2 1 lemez 96 72278 5 lemez 480 72279 SZŰRŐVIZSGÁLATI TESZTKÉSZLET HIV-1 ÉS HIV-2 ELLENANYAGOK KIMUTATÁSÁRA SZÉRUMBÓL VAGY PLAZMÁBÓL ENZIM-IMMUNASSAY MÓDSZERREL 883666-2014/01 1

TARTALOM 1- KLINIKAI JELENTŐSÉG 2- A Genscreen HIV-1/2 Version 2 ALAPELVE 3- A Genscreen HIV-1/2 Version 2 ÖSSZETEVŐI 4- TÁROLÁSI KÖRÜLMÉNYEK - SZAVATOSSÁGI IDŐ 5- SZÜKSÉGES, DE NEM SZÁLLÍTOTT ANYAGOK ÉS ESZKÖZÖK 6- MINTAVÉTEL ÉS MINTÁK KEZELÉSE 7- KEZELÉSI ELŐÍRÁSOK 8- A REAGENSEK ELKÉSZÍTÉSE 9- HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ 10- AJÁNLÁSOK 11- SZÁMÍTÁSOK ÉS AZ EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSE 12- A MINTA ÉS A KONJUGÁT BEMÉRÉSÉNEK SPEKTROFOTOMETRIÁS ELLENŐRZÉSE 13- TELJESÍTMÉNY 14- AZ ALKALMAZÁS KORLÁTAI 15- HIVATKOZÁSOK 2

1 - KLINIKAI JELENTŐSÉG A szerzett immunhiányos tünetegyüttes (AIDS) vírus okozta fertőző betegség, amelyre az immunrendszer erősen lecsökkent működése jellemző. Két különböző típusú, a Lentivírusok csoportjába tartozó vírust izoláltak az AIDS-ben vagy annak előstádiumában szenvedő betegek fehérvérsejt jéből. Az elsőt, amelyet HIV-1-nek neveztek el, először Franciaországban majd az Egyesült Államokban izolálták. A másodikat, HIV-2-nek nevezünk, két Afrikában élő betegből izolálták, és később ez bizonyult egy új, nyugat-afrikai AIDS-góc kórokozójának. A HIV vírus törzseinek genetikai változékonyságáról szerzett ismereteink minden altípus GAG, POL és ENV génjeinek szekvenálásából származnak. A HIV-1 vírusok 2 csoportba sorolhatók: a 9 altípust (A-tól I-ig) tartalmazó M csoportba, és az O csoportba. A HIV-2 vírusok körébe 5 altípus tartozik. A különböző altípusok földrajzi eloszlását ma már jól ismerjük. Egyes HIV-1 variánsok GAG és POL génjeinek homológiája csak 70%-os a főcsoportéval, az ENV gének átfedése pedig mindössze 50% -os. Ezek a különbségek magyarázhatják, hogy a fertőzést egyes betegekben miért nem sikerül diagnosztizálni. A különféle HIV-2 izolátumok a SIV simian vírussal minden fehérjecsoportban közös antigénekkel rendelkeznek (a burokfehérjéknél és a magfehérjéknél az eltérés 30%-os), de a HIV-1 burokfehérjéivel kevesebb, mint 40%-os átfedést mutatnak. A HIV antigének és ellenanyagok megjelennek és kimutathatók a szerokonverzió és a fertőzés különböző stádiumaiban. A Genscreen HIV 1/2 Version 2 teszttel egyszerre mutathatók ki az anti-hiv-1 és anti-hiv-2 ellenanyagok. 2 - A Genscreen HIV-1/2 Version 2 ALAPELVE A Genscreen HIV-1/2 version 2 a humán szérumban vagy plazmában található, és a HIV-1 és/vagy HIV-2 vírussal kapcsolatos különféle ellenanyagok kimutatására készült kétlépéses szendvicstechnikát alkalmazó enzim-immunassay. A Genscreen HIV-1/2 version 2 tisztított antigénekkel bevont szilárd fázist alkalmaz (az antigének a gp160 és a p25, a HIV-1 rekombináns fehérjéi, és egy, a HIV-2 burokfehérjéjének antigéndeterminánsát utánzó peptid), és egy antigén-peroxidáz konjugátot (a HIV-1 és HIV-2 burkát alkotó glikoproteinek antigéndeterminánsát utánzó peptideket és nukleokapszid rekombináns fehérjét). A vizsgálat a következő reakciólépésekből áll: 1. A vizsgálandó szérummintákat és kontroll szérumokat bepipettázzuk a mikrolemez tesztlyukaiba. Ha van a mintában HIV-1 és/vagy HIV-2 antitest, akkor az hozzákötődik a szilárd fázishoz rögzített antigénekhez. A minta bemérését színváltozás jelzi. A szín bíborból kékre vált (SDP = Sample Deposition Proof). 2. Ezután peroxidázzal jelölt, tisztított HIV-1 és HIV-2 antigéneket mérünk be. Ezek a betegmintából származó, és a szilárd fázishoz kötött IgG-hez, IgM-hez vagy IgA-hoz kapcsolódnak. 3. A komplexekhez kapcsolt enzim jelenlétét a szabadon maradt konjugát eltávolítása után a szubsztráttal történő inkubálással mutatjuk ki. 4. A reakciót leállítjuk, és az abszorbanciát spektrofotométerrel leolvassuk, 450/620-700 nm hullámhosszon. A mért abszorbancia alapján meghatározhatjuk a HIV-1 és/vagy HIV-2 antitest jelenlétét a mintában. 3

3 - A Genscreen HIV-1/2 Version 2 ÖSSZETEVŐI Minden reagens kizárólag in vitro laboratóriumi célokra használható fel. Címke R1 Microplate R2 Concentrated washing solution (20X) R3 Negative control R4 Cut-off control R5 Positive control R6 Sample diluent R7a Conjugate R7b Conjugate diluent R8 Substrate buffer R9 Chromogen: TMB solution (11X) R10 Stopping solution Reagens Mikrolemez 12 db 8-8 tesztlyukat tartalmazó csík, tisztított HIV-1 és HIV-2 antigénnel bevonva. Tömény mosóoldat (20X) Tris NaCl puffer ph 7,4 Tartósítószer: 0,04% ProClin 300 Negatív kontroll szérum (humán) HIV-1 és HIV-2 antitestekre, HCV antitestre és HBs Ag-ra negatív humán szérum. Tartósítószer: 0,1% nátrium-azidot tartalmaz Cut-off kontroll szérum (humán) HBs Ag-ra és HCV antitestekre negatív, HIV antitesteket tartalmazó, hővel inaktivált humán szérum. Tartósítószer: 0,1% nátrium-azidot tartalmaz Pozitív kontroll szérum (humán) HBs Ag-ra és HCV antitestekre negatív, HIV antitesteket tartalmazó, hővel inaktivált humán szérum. Tartósítószer: 0,1% nátrium-azidot tartalmaz Mintahígító Borjú szérum oldat (Tris puffer 0,1% kloroformmal, ProClin 300 és színes indikátorral) Konjugát Liofilizált, peroxidázzal jelölt, tisztított HIV-1 és HIV-2 antigének. Konjugát hígító Sovány tejből készült oldat (Tris puffer 0,1% kloroformmal és ProClin 300) Peroxidáz szubsztrát puffer 0,015% hidrogén-peroxidot és 4% dimetilszulfoxidot (DMSO) tartalmazó, ph 4,0 nátrium-citrát és nátrium-acetát oldat. Kromogén Tetrametil-benzidint (TMB) tartalmazó oldat. Leállító oldat 1 N kénsav oldat. Csomagolás 72278 72279 1 lemez 70 ml 1 ml 2,5 ml 1 ml 14 ml q.s. ad 12,5 ml 12,5 ml 60 ml 5 ml 28 ml 5 lemez 235 ml 1 ml 2,5 ml 1 ml 2 üveg 2 x 10 ml 2 üveg q.s. ad 2 x 30 ml 2 üveg 2 x 30 ml 2 üveg 2 x 60 ml 2 üveg 2 x 5 ml 3 üveg 3 x 28 ml 4

4 - TÁROLÁSI KÖRÜLMÉNYEK SZAVATOSSÁGI IDŐ A kitet +2-8 C között kell tárolni. A Genscreen HIV-1/2 Version 2 tesztkitben található minden, ezen a hőmérsékle ten tárolt reagens felhasználható a csomagoláson feltüntetett szavatossági ideig a felnyitás után is, kivéve a speciális eseteket: R1: A vákuumtasak felnyitásat követően a gondosan lezárt, eredeti tasakokban, +2-8 C hőmérsékleten tárolt csíkok 1 hónapig használhatók fel. R2: A +2-30 C-on tárolt, felhasználáshoz felhígított mosófolyadék 2 hétig felhasználható. A koncentrált mosófolyadék (R2) +2-30 C-on tárolható. R7a + R7b: Feloldás után a +2-8 C-on tárolt reagensek 4 hétig felhasználhatók. R8 + R9: Feloldás után a szobahőmérsékleten (18-30 C-on), sötétben tárolt reagens 6 órán át felhasználható. 5 - SZÜKSÉGES, DE NEM SZÁLLÍTOTT ANYAGOK ÉS ESZKÖZÖK Desztillált víz. Nátrium-hipoklorit (háztartási hypo) és nátrium-bikarbonát. Automata vagy félautomata, állítható vagy fix pipetták vagy többcsatornás pipetták 25, 75, 80 és 200 µl kiméréséhez és adagolásához. 25, 100 és 1000 ml-es osztott mérőhenger. Tartály szennyes hulladék gyűjtéséhez. Termosztáttal vezérelt 37±1 C-os vízfürdő vagy inkubátor (*). Automata, félautomata vagy kézi mikrolemez mosó rendszer (*). Mikrolemez leolvasó 450 nm-es és 620-700 nm-es szűrővel (*). (Monokróm eljárásnál forduljon a műszaki osztályunkhoz.) Szűrőpapír. (*) A javasolt készülékek tárgyában forduljon irodánkhoz részletes felvilágosításért. 6 - MINTAVÉTEL ÉS MINTÁK KEZELÉSE A vérmintákat a rutineljárás szerint vegyük. A vizsgálatot EDTA-val, heparinnal, citráttal, vagy ACD-alapú véralvadásgátlóval vett hígítatlan szérummal, vagy plazmával végezzük. A lehető leghamarabb válasszuk el a szérumot vagy a plazmát az alvadéktól vagy a vörösvérsejtektől, hogy megelőzzük a hemolízist. Az előrehaladott hemolízis befolyásolhatja a teszt eredményét. A szemmel látható részecskéket tartalmazó mintákat a vizsgálat előtt centrifugálással kell megtisztítani. A folyadékban szuszpendált fibrin részecskék vagy aggregátumok hamis pozitív eredményhez vezethetnek. Ne melegítsük a mintákat. Ha a szűrővizsgálatot 7 napon belül elvégezzük, akkor a minták +2-8 C között tárolhatók. Ennél hosszabb tároláshoz fagyasszuk le -20 C-on. A plazmát gyorsan kell felolvasztani oly módon, hogy 40 C-os vízfürdőbe kell meríteni néhány percre (hogy a fibrin ne csapódjék ki). Lehetőleg ne olvasszuk fel sokszor a mintákat. A háromnál többször felolvasztott mintákat nem szabad felhasználni a vizsgálathoz. Ha a mintákat szállítani kell, akkor a kórokozók szállítására vonatkozó hatályos jogszabályoknak megfelelően kell becsomagolni. NE DOLGOZZUNK FEL ELSZENNYEZŐDÖTT, HIPERLIPÉMIÁS VAGY ERŐSEN HEMOLIZÁLT SZÉRUMOKAT VAGY PLAZ MÁKAT. MEGJEGYZÉS: A legfeljebb 90 g/l albumint, 200 mg/l bilirubint, 36 mg/l-rel egyenértékű lipidet tartalmazó lipémiás, és legfeljebb 20 mg/l hemoglo bint tartalmazó hemolizált minták nem befolyásolják az eredményt. 5

7 - KEZELÉSI ELŐÍRÁSOK Az eredmények minősége nagyrészt a GLP ajánlások betartásától függ. A teszt neve, valamint egyedi azonosítószáma a minden mikrotiter lemez keretének oldalán fel van tüntetve. Az azonosítószám az egyes tesztcsíkokon is feltüntetésre került. Genscreen HIV-1/2 Version 2: egyedi azonosítószáma = 05 Felhasználás előtt mindig ellenőrizzük az egyedi azonosítószámot. Ha az azonosítószám hiányzik, vagy eltér az alkalmazni kívánt tesztétől, akkor a tesztcsíkot nem szabad felhasználni. Ne használjunk lejárt szavatosságú reagenseket. Ne keverjünk össze egymással egy futtatáson belül több különböző gyártási sorozatba tartozó reagenseket. Megjegyzés: az alábbi reagensek esetében a kitben levőtől eltérő gyártási számú reagensek is használhatók, de egy vizsgálaton belül azonos gyártási számú terméket kell használni: mosófolyadék (R2, címke felirata: 20X, zöld színű), peroxidáz szubsztrát puffer (R8, címke felirata: TMB puffer, kék színű), kromo gén (R9, címke felirata: TMB 11X, bíbor színű) és leállító oldat (R10, címke felirata: 1 N, piros színű). Ezek a reagensek néhány más Bio-Rad gyártmányú termékhez is használhatók. A mosóoldat (R2, címke felirata: 20X, zöld színű) készítésekor továbbá felhasználhatunk különböző Bio-Rad reagens készletekből származó mosófolyadékokat (R2, címke felirata: 10X, kék színű, vagy 10X, narancs színű), ha azokat megfelelően hígítjuk és egy vizsgálatsorozaton belül azonos keveréket használunk. Részletes felvilágosításért forduljanak műszaki szolgálatunkhoz. Az előhívó oldatnak (szubsztrát puffer + kromogén) rózsaszínűnek kell lennie. Ha a hígítás utáni percekben elszíneződik az oldat, akkor a reagens nem használható, azt ki kell cserélni. Az előhívó oldat elkészítéséhez tiszta egyszerhaszná latos műanyag edényt, vagy olyan üvegedényt használjunk, amelyet előzőleg 1 N sósavval mostunk át és desztillált vízzel alaposan kiöblítettünk, majd megszárítottunk. Ezt az oldatot fénytől védve kell tárolni. Használatba vétel előtt várjunk 10 percet, hogy a reagensek szobahőmérsékletre melegedjenek. Figyelmesen hígítsuk a reagenseket. Ellenőrizzük a pipetták és egyéb berendezések pontosságát és működését. Ne változtassunk az előírásos műveleteken. Mosás: tartsuk be gondosan az utasításokat, hogy a lehető legjobb eredményt kapjuk. Egészségügyi és biztonsági előírások A pozitív és a cut-off kontrollok hővel inaktiváltak. A negatív kontroll készítéséhez felhasznált humán eredetű anyagot bevizsgálták, és negatívnak találták hepatitis B felületi antigénjére (HBs Ag), hepatitis C elleni antitestekre és a humán immunhiányt okozó vírus elleni antitestekre (anti-hiv-1 és anti-hiv-2). A pozitív kontroll és a cut-off szérum készítéséhez felhasznált humán eredetű anyagot bevizsgálták, és negatívnak találták hepatitis B felületi antigénjére (HBs Ag), és hepatitis C elleni antitestekre. Mivel egyetlen ismert módszer sem garantálja tökéletesen, hogy nincsenek fertőző ágensek a reagensekben, ezért azokat, valamint minden betegmintát fertőző betegség terjesztésére képes anyagnak kell tekinteni, és ennek megfelelően kell kezelni. A mintákkal és a humán eredetű reagensekkel közvetlen érintkezésbe került minden eszközt és készüléket, továbbá a mosófolyadékot szennyeződöttnek kell tekinteni, és ennek megfelelően kezelni. A HIV és a HBV inaktiválásának legjobb módszere a legalább 1 órán keresztül tartó, 121 C-on történő autoklávozás. 6

NÁTRIUM-HIPOKLORITOT TARTALMAZÓ OLDATOT NE TEGYÜNK AUTOKLÁVBA. Kérésre megküldjük az anyagok munkavédelmi adatlapját. HIV és HB vírusok inaktiválására megfelelő módszer az is, ha az elszennyeződött folyadékokat és felületeket nátrium-hipoklorittal kezeljük úgy, hogy a végső koncentráció 5%-os legyen a fertőtlenítőszerre nézve. Vigyázzunk, hogy a szubsztrát puffer, a kromogén és a leállító oldat ne kerüljön bőrre és a nyálkahártyákra (mérgezést, irritációt és égési sérüléseket okozhat). A vegyszereket a Helyes Laboratóriumi Gyakorlat (GLP) előírásainak megfelelően kell kezelni és kidobni. A tesztben fellelhető egyes kémiai összetevők kockázati és óvintézkedési ajánlásaihoz tekintse át a címkéken biztosított képjelzést (képjelzéseket) és a használati utasítás végén adott tájékoztatást. A biztonsági adatlap a következő címen érhető el: www.bio-rad.com. 8 - A REAGENSEK ELKÉSZÍTÉSE Megjegyzés: felhasználás előtt hagyjuk a reagenseket szobahőmérsékletre (+18-30 C) melegedni. R1 reagens: Mikrolemez Mindegyik, 12 csíkot tartalmazó tartókeret lezárt alumínium tasakban található. Vágja el a tasakot ollóval vagy szikével 0.5 vagy 1 centiméterrel a hegesztés fölött. Nyissa ki a tasakot, és vegye ki a keretet. A fel nem használt csíkokat tegye vissza a tasalba. Gondosan zárjuk vissza a tasakot, majd tegye vissza a +2-8 C hőmérsékletű tárolóhelyiségbe. R2 reagens: koncentrált mosófolyadék (20X töménységű) Desztillált vízzel 1:20 arányban hígítva kapjuk a felhasználásra kész mosófolyadékot. Egy 12 tesztcsíkos lemezhez 800 ml-t készítsünk. R3 reagens: negatív kontroll szérum (felhasználásra kész) HIV-1 és HIV-2 antitestekre, HCV antitestre és HBs Ag-ra negatív humán szérum. Tartósítószerként 0,1% nátrium-azidot tartalmaz. R4 reagens: cut-off szérum (felhasználásra kész) HBs Ag-ra és HCV antitestekre negatív, HIV antitesteket tartalmazó, hővel inaktivált humán szérum. Tartósítószerként 0,1% nátrium-azidot tartalmaz. R5 reagens: pozitív kontroll szérum (felhasználásra kész) HBs Ag-ra és HCV antitestekre negatív, HIV antitesteket tartalmazó, hővel inaktivált humán szérum. Tartósítószerként 0,1% nátrium-azidot tartalmaz. R6 reagens: mintahígító (felhasználásra kész) Borjú szérum oldat (Tris puffer 0,1% kloroformmal, ProClin 300 és színes indikátorral). R7a reagens: liofilizált konjugát Peroxidázzal jelölt, tisztított HIV-1 és HIV-2 antigének. BSA-t és 0,1% ProClint tartalmaz. Finoman koppantsuk oda az üveg fenekét az asztalra, hogy a gumisapkára feltapadt port eltávolítsuk. Óvatosan vegyük le a gumisapkát, és a konjugát hígító üveg tartalmát öntsük bele a liofilizált konjugát üvegébe. Tegyük vissza a sapkát, hagyjuk 10 percig állni. Időnként finoman rázogassuk és forgassuk át, hogy könnyebben feloldódjék. 7

R7b reagens: konjugát hígító Sovány tejből készült oldat (Tris puffer 0,1% kloroformmal és ProClin 300). R8 reagens: szubsztrát puffer 0,015% hidrogén-peroxidot és 4% dimetil-szulfoxidot (DMSO) tartalmazó, 4,0 ph-jú citromsav és nátri um-acetát oldat, amely előkészítés nélkül, azonnal felhasználható. R9 reagens: tömény kromogén szubsztrát oldat Tetrametil-benzidint (TMB) tartalmazó oldat. Hígítsuk az oldatot 1:11 arányban a szubsztrát pufferrel (például 1 ml R9 + 10 ml R8). Előkészítés után sötétben tárolva 6 órán át megőrzi minőségét. R10 reagens: leállító oldat Azonnal felhasználható 1 N kénsav oldat. 9 - HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ Szigorúan tartsuk magunkat a javasolt tesztprotokollhoz. Tartsuk be az alábbi GLP ajánlásokat: A teszteredmények érvényességéhez minden egyes sorozathoz használjuk a negatív, a pozitív és a cut-off kontrollt. 1. Gondosan készítsük elő a pipettázási listát a betegmintákra. 2. Készítsük el a hígított mosófolyadékot. 3. Vegyük ki a keretet és a tesztcsíkokat (R1) a védőcsomagolásból. 4. A lemez előmosása nélkül közvetlenül, az alábbi sorrendben mérjük be a reagenseket: 25 µl hígítót minden tesztlyukba 75 µl negatív kontroll szérumot (R3) az A1 tesztlyukba 75 µl cut-off kontroll szérumot (R4) a B1, C1 és D1 tesztlyukba 75 µl pozitív kontroll szérumot (R5) az E1 tesztlyukba 75 µl 1. mintát az F1 tesztlyukba 75 µl 2. mintát a G1 tesztlyukba, stb. Az alkalmazott készüléktől függően a kontrollok elhelyezése és a bemérés sorrendje megváltoztatható. Pipettázás után homogenizáljuk az elegyet 75 µl-es pipettával legalább háromszori felszívással, vagy a mikrolemez rázatásával. Az is lehetséges megoldás, hogy 100 µl, előzőleg 3:4 arányban hígított mintát mérünk be (pl. 150 µl szérum + 50 µl hígító). Megjegyzés: A minta bemérés előrehaladását szemmel is jól láthatjuk ennél a lépésnél: a minta bemérése után a hígító színe bíborból kékbe csap át (l. 12. pont: automatikus ellenőrzés: A MINTA ÉS KONJUGÁT BEMÉRÉSÉNEK SPEKTROFOTOMETRIÁS ELLENŐRZÉSE). 5. Ha lehetséges, fedjük le öntapadó fóliával a mikrolemezt, óvatosan rányomva a fóliát az egész felületre, hogy szorosan lezárjon. 6. Inkubáljuk termosztát vízfürdőn vagy mikrolemez inkubátorban 30± 5 percig 37±1 Con. 7. Vegyük le az öntapadó fóliát, szívjuk föl a tesztlyukakból azok tartalmát és ürítsük ki egy (nátrium-hipokloritot tartalmazó) szennyes gyűjtő tartályba. Mérjünk be minden tesztlyukba legalább 370 µl mosófolyadékot. Hagyjunk legalább 30 másodpercnyi áztatási időt. Megint szívjuk föl a folyadékot. Ezt a műveletsort ismételjük meg még legalább kétszer (vagyis összesen legalább háromszor mossunk). A tesztlyukban visszamaradó térfogat nem érheti el a 10 µl-t (ha szükséges, fordítsuk le szűrőpapírra a lemezt és így távolítsuk el a folyadékot a tesztlyukakból). 8

Ha automatamosót használunk, ugyanerre a műveletsorra állítsuk be (l. 10. pont: ajánlások). 8. Gyorsan mérjünk be 100 µl konjugát oldatot minden tesztlyukba. Az oldatot felhasználás előtt finoman rázzuk fel. Megjegyzés: a konjugát oldat bemérését, amely zöld színű, szabad szemmel is ellenőrizhetjük (l. 12. pont: automatikus ellenőrzés: A MINTA ÉS KONJUGÁT BEMÉRÉSÉNEK SPEKTROFOTOMETRIÁS ELLENŐRZÉSE). 9. Ha lehetséges, fedjük le újabb öntapadó fóliával a mikrolemezt. Inkubáljuk 30±5 percig szobahőmérsékleten. 10. Vegyük le az öntapadó fóliát, szívjuk föl a tesztlyukakból azok tartalmát és mossunk legalább ötször a fentiek szerint. A tesztlyukban visszamaradó térfogat nem érheti el a 10 µl-t (ha szükséges, fordítsuk le szűrőpapírra a lemezt és így távolítsuk el a folyadékot a tesztlyukakból). 11. Gyorsan mérjünk be 80 µl frissen előkészített színelőhívó oldatot (R8+R9) mindegyik tesztlyukba. Hagyjuk 30 ± 5 percig sötétben állni szobahőmérsékleten (18 30 C), hogy a reakció végbemehessen. Ennél az inkubálási lépésnél ne használjunk öntapadó fóliát. Megjegyzés: a rózsaszín színkódos előhívó oldat bemérését szabad szemmel is ellenőrizhetjük: jól látható különbség van az üres tesztlyuk, és a rózsaszín szubsztráttal feltöltött tesztlyuk színe között (l. 12. pont, automatikus ellenőrzés: A MINTA- ÉS REAGENS BEMÉRÉS SPEKTROFOTOMETRIÁS ELLENŐRZÉSE). 12. Mérjünk be 100 µl leállító oldatot (R10) minden tesztlyukba. Ugyanabban a sorrendben és adagolási sebességgel dolgoz zunk, mint a szubsztrát oldatnál. Keverjük el az elegyet. Megjegyzés: a színtelen leállító oldat bemérését szabad szemmel is ellenőrizhetjük. Ha már bemértük a leállító oldatot, akkor a szubsztrát rózsaszíne eltűnik (a negatív minták esetében), vagy a korábban már rózsaszínből kékbe váltott szubsztrát oldat színe sárgára változik (a pozitív mintáknál). 13. Óvatosan töröljük le a lemez alját. 450/620-700 nm-en olvassuk le az optikai denzitást egy lemezleolvasó fotométerrel a reakció leállításától számított legalább 4 perc múlva, de legfeljebb 30 percen belül. 14. Az eredmények kiszámítása előtt ellenőrizzük, hogy a leolvasás eredménye egyezik-e a pipettázási sémával. 10 - AJÁNLÁSOK VIGYÁZAT: A MÉRÉS KIVITELEZÉSE SORÁN ÜGYELJÜNK ARRA, HOGY SZENNYEZŐDÉS NE TÖRTÉNJEN (folyadék kiömlése, stb.). A nem savas kémhatású kiömlött anyagot gondosan takarítsuk fel legalább 5%-os nátrium-hipoklorit oldattal. A savas kémhatású kiömlött folyadékkal szennyezett felületet teljesen szárazra kell törölni. Az elszennyeződött felületet legalább 5%-os nátrium-hipoklorittal kell fertőtleníteni. A tisztításhoz felhasznált anyagokat biológiailag veszélyes hulladék gyűjtésére szolgáló tartályba kell dobni, és a hatályos jogszabályok szerint kell ártalmatlanítani (l 7. pont, biztonsági előírások). SOHASE HASZNÁLJUK UGYANAZT A PALACKOT KONJUGÁT OLDAT ÉS SZÍNELŐHÍVÓ OLDAT ADAGOLÁSÁHOZ. ANNYISZOR MOSSUNK, AMENNYIT A TESZTPROTOKOLL ELŐÍR. BEMÉRÉS ELŐTT ELLENŐRIZZÜK A SZÍNELŐHÍVÓ OLDATOT (szubsztrát puffer és kromogén). Színtelennek kell lennie. 9

Ha az előkészítés után néhány percen belül kék színű lesz az oldat, akkor az azt jelentheti, hogy fémionok kerültek bele. Az ilyen reagens nem használható, újat kell készíteni. Javasolt a műanyag palackok és adagoló eszközök, vagy 1 N sósavval előzőleg elmosott, desztillált vízzel alaposan átöblített és megszárított üvegáru használata. Mosás: Pontosan tartsuk be a mosási előírásokat, hogy a lehető legjobb eredményeket kapjuk. 11 - SZÁMÍTÁSOK ÉS AZ EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSE A HIV-1 és/vagy HIV-2 elleni antitestek jelenlétét vagy hiányát a mintában úgy állapítjuk meg, hogy összehasonlítjuk az egyes minták abszorbancia értékét a kiszámított cut-off értékkel. 1. A cut-off kontroll szérum abszorbancia átlagának kiszámítása (ODR4) OD (B1) + OD (C1) + OD (D1) ODR4 = ---------------------------------------- 3 2. Cut-off érték kiszámítása A cut-off értéket az alábbi arány adja meg: ODR4 C.O. = --------- 10 3. Az eredmények érvényességének megállapítása A negatív kontroll szérum abszorbanciájának kisebbnek kell lennie a cut-off érték 70%- ánál: ODR3 < 0,7 X C.O. A cut-off kontroll szérum abszorbancia átlagának nagyobbnak kell lennie 0,80-nál: ODR4 > 0,80 További lehetőség: az ODR5/ODR4 arány legyen nagyobb, vagy egyenlő, mint1,3 (ezt a képletet akkor alkalmazzuk, ha az alkalmazott leolvasó berendezés linearitása 3,000 fölött van). 4. Az eredmények kiértékelése A cut-off értéknél kisebb abszorbanciájú mintákat a Genscreen HIV-1/2 Version 2 teszttel negatívnak kell tekinteni. A cut-off értéknél éppen csak alacsonyabb eredményeket (C.O.-10% < OD < C.O.) azonban körültekintően kell értelmezni (ilyen esetben tanácsos két párhuzamos mintával újabb mérést végezni, ha az alkalmazott rendszer vagy laboratóriumi eljárás lehetővé teszi). A cut-off értéknél nagyobb, vagy azzal egyenlő abszorbanciájú minták a Genscreen HIV-1/2 Version 2 teszttel első mérésre pozitívnak tekintendők. A végeredmény megállapítása előtt két párhuzamos mintával újabb mérést kell végezni. Ha ismételt vizsgálat után mindkét párhuzamos abszorbancia értéke kisebb a cut-off értéknél, akkor az eredeti minta pozitivitása nem megismételhető, és azt a Genscreen HIV-1/2 Version 2 teszttel negatívnak kell tekinteni. A nem reprodukálható pozitív eredmény okai a következők lehetnek: nem megfelelő a lemez mosása, keresztszennyeződés történt: a negatív mintát egy magas titerű minta átszennyezte, 10

a színelőhívó oldat oxidálószerekkel (hypo, fémionok, stb.) szennyeződött, a leállító oldat elszennyeződött. Ha ismétlés után a két párhuzamos közül az egyik abszorbanciája nagyobb, vagy egyenlő, mint a cut-off érték, akkor az első eredmény reprodukálható, és a mintát pozitívnak kell tekinteni a Genscreen HIV-1/2 Version 2 teszttel, figyelembe véve a módszer későbbiekben felsorolt korlátait is. 12 - A MINTA ÉS A KONJUGÁT BEMÉRÉSÉNEK SPEKTROFOTOMETRIÁS ELLENŐRZÉSE A minta bemérésének spektrofotometriás ellenőrzése A mintahígító (R6) és a minták bemérése után spektrofotométerrel, 620 nm-en leolvasva ellenőrizhető, hogy a minta bemérése ténylegesen megtörtént-e: a mintát tartalmazó tesztlyuk optikai denzitása nagyobb, mint 0,150 (ennél kisebb OD a minta elégtelen bemérését jelzi). Konjugát bemérésének ellenőrzése A konjugát (R7a+R7b) bemérése után spektrofotométerrel, 620 nm-en leolvasva ellenőrizhetjük, hogy az oldat bemérése ténylegesen megtörtént-e: a konjugátot tartalmazó tesztlyuk optikai denzitása nagyobb, mint 0,100 (ennél kisebb OD a konjugát elégtelen bemérését jelzi). A színelőhívó oldat bemérésének spektrofotometriás ellenőrzése 490 nm-en automatikusan leolvasva ellenőrizhetjük, hogy a rózsaszín előhívó oldat hogy az oldat bemérése ténylegesen megtörtént-e: a színelőhívó oldatot tartalmazó tesztlyuk optikai denzitása nagyobb, mint 0,100 (ennél kisebb OD az előhívó oldat elégtelen bemérését jelzi). 13 - TELJESÍTMÉNY A Genscreen HIV-1/2 Version 2 érzékenységi vizsgálatait AIDS-ben, vagy AIDS-szel kapcsolatos tünetegyüttesben (ARC) szenvedő betegektől származó pozitív mintákon, és a HIV vírussal frissen fertőződött betegektől származó, bevizsgált mintákból álló érzékenységi panelen vizsgálták. A HIV-1-re 100%-os volt az érzékenység. A vizsgálatot 413 AIDS-, vagy ARC-pozitív, Western blottal konfirmált M csoportú HIV-1 mintán, illetve 31 Western blot HIV-1-gyel konfirmált O csoportú HIV-1 mintán végezték. Az O csoportra vonatkozó érzékenységet szintén vizsgálták 4 Western blottal meghatározatlannak konfirmált O csoportú HIV-1 mintán. Az érzékenységet kielégítőnek tekintették: 3 minta bizonyult pozitívnak. A HIV-2-re 100%-os volt az érzékenység. A vizsgálatot összesen 119 Western blottal konfirmált hígított, vagy hígítatlan mintán végezték. Az M csoportú HIV-1re vonatkozó érzékenységet 29 kereskedelmi szerokonverziós panelen (BBI, NABI, Bioclinical partners), és az INTS érzékenységi panelen vizsgálták. Az eredmények megfeleltek a követelményeknek. Az INTS panelből a 45 szerokonverziós, és a 13 szerokonverzió előtti minta pozitív eredményt adott. 25 további friss pozitív mintát (a vérvételtől számítva 1 napon belül) teszteltek és mindegyik pozitívnak bizonyult. Legalább 42 korai szerokonverziós mintát teszteltek a Genscreen HIV-1/2 Version 2 kittel. Véradókon vizsgálva a teszt specificitása 99,98%-osnak adódott, 5025 minta vizsgálatából. 11

212-ből 3 esetben kaptak pozitív eredményt különféle betegségekben szenvedő, vagy HIV vírussal összefüggésbe nem hozható állapotú betegeknél (terhes asszonyok, rheumatoid faktor, anti-nuclearis IgG, vagy egyéb vírusfertőzés). A Genscreen HIV-1/2 Version 2 mérési pontosságát 4 minta elemzésével állapították meg: 1 negatív mintát (1. minta), 2 alacsony anti-hiv-1 titerű pozitív mintát (2. és 3. minta) és 1 magas anti-hiv-1 titerű pozitív mintát (4. minta) vizsgáltak. A teszten belüli ismételhetőséget úgy mérték, hogy ezt a négy mintát 30-szor mérték egy és ugyanazon futtatáson belül, a tesztek közötti ismételhetőséget pedig a 4 minta 3-szori, két mikrolemezen történő, két független vizsgálatban, 5 napon keresztül történő mindennapi tesztelésével állapítottuk meg. Az eredményeket az alábbi táblázat foglalja össze: 1. táblázat: teszten belüli ismételhetőség n = 30 1. minta 2. minta 3. minta 4. minta arányok* átlaga 0,12 3,34 9,05 19,6 standard 0,04 0,45 0,30 0,73 deviáció (SD) CV (%) arány* 31,5% 13,6% 3,3% 3,7% * Arány = OD/CO 2. táblázat: futtatáson belüli ismételhetőség n = 30 1. minta 2. minta 3. minta 4. minta arányok* átlaga 0,12 3,43 9,27 19,35 standard 0,02 0,41 0,89 1,93 deviáció (SD) CV (%) arány* 19,3% 12,1% 9,65% 10,0% * Arány = OD/CO 14 - AZ ALKALMAZÁS KORLÁTAI A fertőzés első stádiumában nagyon alacsony koncentrációban előforduló ellenanyag nem mutatható ki, vagyis az ekkor kapott negatív eredmény csak azt jelenti, hogy a vizsgált minta nem tartalmaz a Genscreen HIV-1/2 Version 2 teszttel kimutatható anti-hiv ellenanyagot. Ez az eredmény azonban nem zárja ki annak lehetőségét, hogy a beteg HIV-1/HIV-2 fertőzés kockázatának van kitéve. A HIV-1 (M és O csoport) és a HIV-2 vírus változékonysága miatt nem zárható ki a hamis negatív eredmény előfordulása. Egyetlen ismert vizsgálati módszer sem nyújt teljes biztonságot annak tekintetében, hogy a HIV vírus tényleg nincs jelen. A nagy érzékenységű ELISA technika hamis pozitív eredményeket is produkálhat. A reakció specificitásának igazolásához minden, a Genscreen HIV-1/2 Version 2 értékelési kritériumai szerint pozitív ered ményt megfelelő módszerrel konfirmálni kell (Western blot). A minták felmelegítése befolyásolhatja az eredményt. A minták, a konjugát és a színelőhívó oldat bemérésének színkódos igazolása nem jelenti azt, hogy pontos mennyiség lett bemérve. Csak annyit tudhatunk meg belőle, hogy került minta, konjugát és előhívó oldat a tesztlyukba. A téves eredmények gyakorisága szoros összefüggést mutat az alkalmazott berendezések, eszközök pontosságával (ha a bemérések és a leolvasás összegződő variációs koefficiense túllépi a 10%-ot, akkor szignifikánsan csökken a bemérés ellenőrzésének megbízhatósága). Ha a konjugáttal történő inkubálás utáni mosás nem eléggé hatékony, akkor az előhívó oldat bemérésének automatikus ellenőrzése (a tesztlyuk OD-jének leolvasása 490 nm-en) 0,100 OD fölötti eredményt produkálhat akkor is, ha nem került előhívó oldat a tesztlyukba. Ezt a jelenséget mindazonáltal nem észleltük a 939 vizsgált minta kiértékelésekor. 12

15 - HIVATKOZÁSOK 1. BARRE-SINOUSSI F., CHERMANN J.C., REY F. et al Isolation of a T. lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), Science, 1983, 220, 868-871 2. ALIZON M., SONIGO P., BARRE-SINOUSSI F. et al. Molecular cloning of lymphadenopathy associated virus Nature, 1984, 312, 757-760 3. CLAVEL F., GUETARD D., BRUN-VEZINET F. et al. Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS. Science. 1986, 233, 343-346 4. CLAVEL F., GUYADER M., GUETARD D. et al. Molecular cloning and polymorphism of the human immune deficiency virus type 2. Nature, 1986, 324, 691-695 5. BRUN-VEZINET F., ROUZIOUX C., BARRE-SIOUSSI F. et al. Detection of IgG antibodies to lymphadenopathy associated virus (LAV) by ELISA, in patients with acquired immunodeficiency syndrome or lymphadenopathy syndrome. Lancet. 1984, June, 1253-1256 6. MATHIESEN T., CHIODI F., BROLIDEN P.A., et al. Analysis of a subclass restricted HIV-1 gp 41 epitope by omission peptides. Immunology, 1989, 67, 1-7 7. NORRBY E., BIBERFELD G., JOHNSON PR et al. The chemistry of site directed serology for HIV Infections. AIDS Res Human Retroviruses. 1989, 5, 487/493 8. McKEATING J.A., WILLEY R.L. Structure and fonction of the HIV envelope. AIDS, 1989, 3, S35-S41 9. PASQUALI J.L., KIENY M.P., KOLBE H. et al. Immunogenicity and epitope mapping of a recombinant soluble gp 160 of the human immunodeficiency virus type 1 envelop glycoprotein. AIDS Res. Human Retroviruses, 1990, 6, 1107-1113 10. NEURATH A.R., STRICK N., TAYLOR P. et al Search for eptiope specific antibody responses to human immunodeficiency virus (HIV-1) envelope glycoproteins signifying resistance to disease development. AIDS Res. Human Retroviruses, 1990, 6, 1183-1192 11. NAIR B.C., FORD G., KALYANARAMAN V.S. et al. Enzyme immunoassay using native envelope glycoprotein (gp 160) for detection of human immunodeficiency virus type 1 antibodies. J. Clin. Microbio. 1994, 32, 1449-1456 12. ZAAIJER H.L., EXEL-OEHLERS P.V., KRAAIJEVELDT T., et al. Early detection of antibodies to HIV-1 by third generation assays. The Lancet, 1992, 340, 770-772 13. CONSTANTINE N.T., VAN DER GROEN G., BELSEY E.M. et al Sensitivity of HIV antibody assays determined by seroconversion panels AIDS, 1994, 8, 1715-1720 14. ENGELBRECHT S., DE JAGER G.J., VAN RENSBURG E.J. Evaluation of commercially available assays for antibodies to HIV-1 in serum obtained from south african patients infected with HIV-1 subtypes B, C, and D. J. Med. Viroloogy 1994, 44, 223-228 15. COUROUCE A.M. et al. Trousses de dépistage des anticorps anti VIH1 et VIH2. Spectra Biologie, 1994, 6, 43-51 16. DONDERO T.J., HU D.J., GEORGE J.R. HIV-1 variants : yet another challenge to public health. The Lancet 1994, 343, 1376 17. SIMON F., LY T.D., BAILLOU-BEAUFILS A., et al Sensitivity of screening kits for anti HIV-1 subtypes O antibodies. AIDS, 1994, 8, 1628-1629 18. JANSSENS W., HEYNDRICKX L. FRANSEN et al. Genetic and phylogenetic analysis of ENV subtypes G and H in Central Africa AIDS Res. Hum. Retrovirus 1994, 10, 877-879 19. GAOF., YUE L. ROBERTSON D.L. et al. Genetic diversity of human immunodeficiency virus type 2 : evidence for distinct sequence subtypes with differences in virus biology. J. Virol. 1994, 68, 7433-7447 13

14

15

16

17

18