Korszerű Salmonella kimutatási módszerek tapasztalatai a magyarorsági élelmiszerellenőrzésben Tabajdiné dr. Pintér Vera FoodMicroKft. Budapest 1
We ling 2
Élelmiszerekkel szemben támasztott követelmények Egészségre ártalmatlan Jó minőség (érzékszervi tulajdonság, beltartalom) hosszú minőségmegőrzési időtartam tömeges termelés feldolgozottsági fok növelése nemzetközi kereskedelem új táplálkozási szokások Gazdaságos Preventív, gyártásközi technológiába beépülő szabályozási rendszer (HACCP) 3
A Salmonella vizsgálati módszerek csoportosítása Klasszikus vizsgálatok gyorsítása egyszerűsítése Kromogén táptalajok Dúsítás kombinálása műszeres méréssel pl. konduktancia Molekuláris biológiai módszerek (PCR, DNS hibridizáció) Immunológiai vizsgálatok (FIA, RIA, ELISA, ELFA) Sejtkoncentrálás 4
Salmonella táptalajok 5
Mikrobaszaporodás detektálása (hő, turbititás, szín, konduktancia, beütésszám, redoxpotenciál) 6
IMS 7
A Salmonella vizsgálatok idődiagramja Élelmiszer 24-48 óra IMS, ICS Fizikai mérés MSRV, Diassalm PCR célirányos Elődúsítás 6-24 óra 48-52 óra ELFA, ELISA, FIA Enzimreakciók Latex agglutináció Gene próba Célirányos (pl.utódúsítás) Szelektív dúsítás 24-48 óra 72-96 óra API MICRO ID Enterotube II SM ID, Rambach Kromogén táptalajok Szelektív agar 24-48 óra Biokémiai reakciók 24-48 óra Szerológiai vizsgálat 8
ELŐDÚSÍTÁS Cél:a sérült sejtek reszuszcitációja INKUBÁLÁSI IDŐTARTAM Az elődúsítást követö módszer és a kisérö mikroflóra mennyiségének függvénye Rázatva, nem rázatva Klasszikus tenyésztéses 16-24 óra Motilitási elven alapuló 16-20 óra Immunszelektív dúsítás 6-8 óra PCR 6-16 óra Konduktometriás 16-24 ó ELISA kevés kísérő mikroflora 16-24 óra sok kísérő mikroflora 6-8 óra 9
ELŐDÚSÍTÓ AOAC Laktózleves* tojás, tej, hús, gyümölcs hal Triptikáz szója leves* tojás, tojáslé, fűszerek, élesztö Brillantzöld oldat tejpor ISO 6579 TSB + 0,5 % K 2 SO 3 Steril sovány tej LB + Tergitol vagy Triton* BPW Pufferolt peptonvíz BPW +5% kazein, vagy 10 % tejpor BPW +1/100 higítású minta BPW+0,1-1% Tween80 BPW+ ph kontrol fokhagymapor, vöröshagymapor csokoládé termékek kókuszreszelék, húsipari melléktermékek, hal-, csont- húslisztek legtöbb élelmiszer, nyers hús kakaó és kakaó alapű termékek gyógynövények, füszerek, nagy zsírtartalmű termékek( 20%) savak és savas termékek 10
Tojásfehérje 10 8 8,7 8,3 8,4 6,9 6,7 7,5 8,8 7,6 6 5,4 4,8 5,2 5,6 4 3,6 2,8 2,8 2 0 Kontrol 1 % élesztõ 0,1 % élesztõvas-amm.citrát Humet R Elõdúsítás idõtartama 8óra 6 óra 3 óra 11
Salmonella kimutatás hőkezelt tejből Kimutatási határ eléréséhez szükséges idő 25 20 15 10 18,7 16,1 12,4 13,1 13,2 11,7 9,4 10 10 10,4 8,8 9,3 9,5 7,8 7,8 5 0 Induló sérült sejt 90/ml Kontrol 1 % élesztõ 0,1 % élesztõ vas-amm.citrát Humet R Elõdúsítás idõtartama 8óra 6 óra 3 óra 12
Dúsító tápoldatban Tetrationátos Szelenit-cisztin Rappaport V. Szelektív differenciáló táptalaj a dúsítást követő azonosítási módszer függvénye DNS hibridizáció Félfolyékony dúsítóban MSRV Diassalm Szelektív és differenciáló táptalaj SZELEKTÍV DÚSÍTÁS Impedimetriás mérő készülékben Rappaport V. TMO-s táptalaj Latex agglutináció DNS hibridizáció ELISA Utódúsítás M-levesben Immunszelektív dúsítás IMS Dipstick PCR Molekuláris biológiai módszerrel Szelektív differenciáló táptalaj 13
Salmonella táptalajok 14
Reveal Salmonella Test Élelmiszer 25 g 1 fiola táptalaj + 200 ml 42 C-os steril víz oldás Homogenizálás Stomacher 2 perc Elődúsítás (36 1 C) 2-4 óra 1 fiola táptalaj (d-rv) + 200 ml 37 C-os steril víz oldás Szelektív dúsítás (42 1 C) 18-24óra Reveal teszt 15 perc 15
REVEAL 16
17
Követelmények Gyors, vagy gyorsított Nemzetközi szabványoknak való megfelelőség Akkreditálási követelményeknek való megfelelőség Jártasság igazolása körvizsgálatokban való részvétellel Minőségbiztosítási rendszereknek való megfelelés 18
A vizsgáló és kalibráló laboratóriumok alkalmasságának általános követelményei MSZ EN ISO 17025:2001 5.4 VIZSGÁLÓ MÓDSZEREK: Elsősorban nemzetközi, regionális és nemzeti szabványokat kell alkalmazni. Laboratóriumban kifejlesztett, vagy átvett módszert a használatba vétel előtt validálni kell. Validálni kell: Nem szabványos módszereket Saját kifejlesztésű módszereket Működési területen kívül eső szabványos módszereket Szabványos módszerek kiegészítéseit, módosításait 19
MIKROBIOLÓGIAI VIZSGÁLATI LÉPÉSEI: MÓDSZEREK VALIDÁLÁSA EN ISO 16140:2000 Alternatív és referencia módszer laboratóriumon belüli összehasonlítása Körvizsgálat 20
Jellemző paraméterek Relatív pontosság: 100 (p+n) / N % Relatív specitikusság: 100 n / (n+fp) % Relatív érzékenység: 100 p / (p+fn) % Referencia + Referencia - Alternatív + p f p Alternatív - f n n 21
Mi határozza meg, hogy melyik módszert válasszuk? a vizsgálat célja biztonsági szint mintavételi terv validálás érzékenység specifikusság pontosság élelmiszer összetétele vizsgálati idő automatizálás lehetősége adattárolás, adatelemzés szervíz és céginformációk vizsgálati költség 22
Élelmiszer 24-48 óra IMS, ICS Fizikai mérés MSRV, Diassalm PCR célirányos Elődúsítás 6-24 óra 48-52 óra ELFA, ELISA, FIA Enzimreakciók Latex agglutináció Gene próba Célirányos (pl.utódúsítás) Szelektív dúsítás 24-48 óra 72-96 óra API MICRO ID Enterotube II SM ID, Rambach Kromogén táptalajok Szelektív agar 24-48 óra Biokémiai reakciók 24-48 óra Szerológiai vizsgálat 23
24
BIOLINE ELISA 25
BIOLINE ELISA előnyei Széleskörű felhasználási terület (élelmiszerek, takarmányok, környezeti minták) Egyszerű, felhasználóbarát (akár napi 600 minta ) Flexibilis (igény szerint csíkokra szétszedhető kit) Stabil, felhasználásra kész reagensek (12 hónap) Detektálási limit (106-6 106 cfu/ml RV) Analóg a referencia módszerrel Érzékenység: 99% Specifikusság: 97% Csak az ELISA pozitív mintákat kell megerősíteni. A reprodukálhatósági vizsgálatok során a variációs koefficiens 7% (12-szeri ismétlés esetén) Keresztreakció: E.coli, Proteus, E.cloaceae, Klebsiella negatív E.aerogenes, C.freundii előfordul Élelmiszerelőállítóknál biztonságos vizsgálat (hőkezelés miatt) AOAC certificate: No.960901 AFNOR, DANVAL 26
40 30 33 31 29 30 31 31 20 10 10 10 14 14 14 10 13 12 10 0 tojáspor hig.minta1 hig.minta2 baromfi takarmány ISO+ ELISA+ Salmonella + 27
20 % BAROMFIIPAR 18 16 16 14 13,6 14,1 12 10 8 6 4 6,6 4,9 7 3,9 8,7 3,9 4,7 3,3 4,1 2,3 9,9 4,8 6,2 6,6 6,2 2 0 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 Összes Kórokozó 28
HÚSIPAR % 16 14 12 10 8 6 4 2 0 6,6 4,2 4,2 4,1 4,4 3,9 4,6 4,4 4,7 2,5 2,8 0,9 0,9 0,9 1,4 0,8 0,8 1,2 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 Összes Kórokozó 29
% ÉLELMISZERIPAR 16 14 12 10 8 6 4 2 0 5,8 7,6 6,5 6,3 6,7 5,5 5,6 5,6 4,6 1,1 2,7 3 1,1 1,1 1,1 1,5 1,5 1 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 Összes Kórokozó 30
Állatfaj Szarvasmarha Sertés Tyúk Kacsa, liba Pulyka Szerotípus reservoar S.Enteritidis, S.Typhimurium S.Derby, S.Typhimurium, S.Choleraesuis S.Enteritidis S.Typhimurium S.Saintpaul, S,Enteritidis, S.Infantis 31
Élelmiszer Szerotípus hordozó Marhahús Sertéshús Tyúk hús Kacsa, liba Pulyka hús Húsipari termék Tojás, sz.tészta S.Enteritidis, S.Typhimurium S.Derby, S.Typhimurium S.Enteritidis S.Infantis S.Typhimurium S.Brockley, S,Virchow, S.Hadar S.Derby S.Enteritidis 32
Konduktancia mérés 33
Salmonella kimutatás Malthus eljárással 34
HAGYOMÁNYOS MÓDSZEREK GYORSÍTÁSA, AUTOMATIZÁLÁSA TÁPTALAJOK (KÉSZ POR, REDY TO USE) GRAVIMETRIÁS ADAGOLÁS, HIGÍTÁS DIP SLIDE MÓDSZEREK SPIRÁL LEMEZ MÓDSZER PETRIFILM HIDROFÓB HÁLÓZATOS MEMBRÁNFILTEREK (HGMF) ÚJ SZELEKTÍV TÁPTALAJOK IDENTIFIKÁLÁS (API, CRISTAL, MINI TUBE:..) EGYSZER HASZNÁLATOS ESZKÖZÖK TELEPSZÁMLÁLÁS AUTOMATIZÁLÁSA 35
36