Tartalomjegyzék PÉCS TUDOMÁNYEGYETEM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNY KAR A fény; Abszorpciós spektroszkópia Elektromágneses hullám kölcsönhatása anyaggal; (Nyitrai Miklós; 2016 március 1.) Az abszorpció mérése; Az abszorpció definíciója; Alkalmazások; Speciális problémák, esetek. Emlékeztetõ Emlékeztetõ Elektromágneses hullámok terjedése növekvõ energia távoli vörös vörös 760nm narancs 647nm sárga 586nm 535nm zöld kék 492nm ibolya 422nm UV 390nm Hogyan függ össze a frekvencia, hullámhossz és energia? A fény transzverzális elektromágneses hullám. Spektroszkópia Fényelnyelés híg oldatokban energia (ev)* hullámhossz (nm) frekvencia (Hz) - transzmittancia - abszorpció hullámhossz tart. sp.-i módszer *1eV = 1,602 x 10-19 J = 3,83 x 10-20 cal 1
Transzmittancia 0 fényforrás Abszorpció vagy fényabszorpció detektor anyag T = / 0 Általában százalékban (%) adjuk meg Megj.: hasonló a radioaktív bomlás egyenletéhez! Abszorpció 0 Minta (homogén) = 0 exp (-kx) vagy Exponenciális = 0 e-kx függvény!!! fény intenzitás N = N0 exp (-λt) vagy N = N0 e-λt távolság Megj.: eltérõ ábrázolások minta Mi áll a megfigyelések hátterében? Ez is exponenciális! intenzitás 0 A Born-Oppenheimer közelítés: Mag mozgás vs. elektron mozgás. ln(távolság) 2
Az energia felbontása Például vízmolekula rezgései Eösszes = Eelektron + Evibrációs + Erotációs Az egyes energia típusok megváltozása független. A megváltozás írható mint: Eösszes = Eelektron + Evibrációs + Erotációs http://www1.lsbu.ac.uk/water/vibrat.html Energia séma: sávos spektrum Az energia felbontása Az energia típusok nagyságrendje: Eelektron ~ 1,000 * Evibrációs ~ 1,000,000 * Erotációs Szingulett és triplett állapotok A spinállapothoz rendelt mágneses momentumnak a mágneses tér irányához képest lehetséges orientációs állapotainak a száma (multiplicitás): Az abszorpció értelmezése Gerjesztett-állapot Vibrációs relaxáció (10-12s) S1 S1 T1: rendszerek közötti átmenet (10-10 10-8 s) M = 2S+1 T1 Szingulett S=0; M = 1 gerjesztett szingulett állapot gerjesztés (10-15s) gerjesztett triplett állapot Triplett S=1; M = 3 S0 S 1 hν S0 szingulett alapállapot T1 S0 (10-3 10-1s ) 5 4 3 2 1 0 vibrációs szintek Alap-állapot 3
A távolságfüggés más formában Az abszorpció definíciója 0 minta intenzitás A cél: - legyen könnyen érthetõ - legyen jól mérhetõ - legyen additív távolság = 0 10-ε(λ) c x Megj.: a transzmittancia (T = / 0) nem additív: ha az egyik komponens átenged 50%-ot, a másik 60%-ot, akkor a kettõ együtt NEM 110%-ot fog átengedni! Paraméterek definíciója! Miért ε(λ) és nemcsak ε? Miért ε(λ) és nem csak ε? Az abszorpció definíciója abszorpció 0 anyag OD = A = - log ( / 0) = ε (λ) c x λ (nm) Röv.: optical density Az ε értéke λ függõ! = 0 10-ε(λ) c x Fotometriai mérések megvalósítása Hogyan mérjük az abszorpciót? Egy fotométer egyszer; sémája. fotometriai = abszorpciós spektroszkópiai fényforrás monokromátor minta detektor 4
Spektrofotométer Fõ komponensek: 1. Fényforrás UV fényforrás (~180-350nm): Deutérium lámpa Látható fény forrása (~350-800nm): Wolfram-izzó Hogyan m;ködik a prizma? 2. Monokromátor: egyedi hullámhosszak kiválasztása. 3. Mintatartó: a minta és a referencia behelyezése a fényforrás és a detektor közé (küvetta: kismérets, fényáteresztõ mintatároló egység) 4. fotodetektor: PMT, dióda 5. Egyebek: lencsék, szsrõk, rések. A törésmutató hullámhosszfüggése Hogyan m;ködik a prizma? n λ λ A törésmutató hullámhosszfüggése Monokromatikus fény Egy és két-utas fotométerek Miért használunk referencia mintát? Fehér fény piros sárga lila 5
A fehérjék abszorpciója A fehérjék abszorpciója Alkalmazás: fehérjekoncentráció meghatározása A fehérjék abszorpciójának értelmezése A mért abszorpció: A Szükség van egy referencia számra (kalibráció): extinkciós koefficiens: ε ε szokásos egységei: M-1cm-1, vagy (mg/ml)-1cm-1 Ha A = 0.55 és ε = 1.1 (mg/ml)-1cm-1 c = (A/ ε) mg/ml-ben; c = 0.5 mg/ml Példa egy másik alkalmazásra: elektroforézis kiértékelése Miért jó az additivitás? (példa) 0.8 fluoreszcens próba 0.6 fehérje S abszorpció 1.0 0.4 0.2 0.0 λ (nm) 0 5 10 15 [mdia3-fh2] (µm) 20 6
A lényeg Köszönöm a figyelmet! - az abszorpció jelensége, értelmezése; - az abszorpció definíciója; - az abszorpció mérése; - az abszorpció alkalmazásai. 7