Szabadgyök-reakciók és az antioxidáns rendszer gasztroenterológiai betegségekben és diabetes mellitusban dr. Szaleczky Erika Programvezető: Prof. Dr. Fehér János Témavezető: Dr. Prónai László Ph.D. Dr. Somogyi Anikó Ph.D. Budapest, Semmelweis Egyetem Doktori Iskola A hepatológia szabadgyökös és immunológiai vonatkozásai 2000 1
Évtizedek óta ismert és vizsgált a természetben és az emberi szervezetben előforduló párosítatlan elektronokkal rendelkező, nagy reakcióképességű molekulák, az ún. szabadgyökök szerepe. Számos vizsgálat kutatta és kutatja ma is, hogy részt vesznek-e az egyes betegségek patogenezisében, vagy felszaporodásuk csak következményként kíséri-e a kórképeket. Munkánk során a szabadgyökös reakciók egyes résztvevőinek vizsgálatát tűztük ki célul a populáció jelentős hányadát érintő két betegségcsoportban. Kiváncsiak voltunk, vajon a szabadgyökök felszaporodását kísérő oxidatív stressz, valamint az azt egyensúlyban tartó antioxidáns védelem hogyan alakul olyan gasztroenterológiai betegségekben, mint a peptikus fekély, a colitis ulcerosa és különösen a vastagbélrák, és milyen eltéréseket találunk 1. és 2. típusú cukorbetegség fennállása esetén. Kutatásunk tárgya gasztroenterológiai betegségeket (A), valamint a cukorbetegséget (B) jellemző prooxidáns-antioxidáns egyensúly. Klinikai vizsgálatokban mértünk egyes szabadgyökös paramétereket és az oxidatív stressz elleni védelemben felsorakozó tényezőket. (A) A prooxidáns oldal jellemzésére a nitrogén központú szabadgyökök jelenlétét indirekt módon vizsgáltuk, mérve a nitrát/nitrit szinteket, valamint megkíséreltük a nitrotirozin, mint az in vivo peroxinitrit képződés bizonyítékának kimutatását. A védekező rendszer tagjai közül számos antioxidáns enzim és kis molekulasúlyú vegyület koncentrációját határoztuk meg. Mértünk a rendszerre jellemző összetett paramétereket is, mint az elektron spin rezonanciával meghatározott szuperoxid gyökfogó aktivitás és a kemilumineszcencia módszerét alkalmazó összscavanger kapacitás. Különböző betegségekben mért értékeinket összevetve, az egészségesektől való eltéresek betegség-specifikus voltát vizsgáltuk. Mindösszesen 80 felső gasztrointesztinalis tünetekkel rendelkező, 20 colitis ulcerosában és 98 colorectalis carcinomában szenvedő beteg adatait elemeztük. (B) A cukorbetegség mindkét típusában kerestük az antioxidáns rendszer egészségesektől eltérő jellegzetességeit. Egyaránt meghatároztuk az antioxidáns enzimek és a kis molekulasúlyú antioxidáns tulajdonságú vegyületek, valamint 2
antioxidáns tulajdonságú vitaminok koncentrációját, a zsíroldékony vitaminok szintjét a lipidfrakciókban is. Új összefüggéseket is kerestünk a diabetes típusa, súlyossága, klinikai időtartama, kezelése és a mért paraméterek között. Megvizsgáltuk az antioxidáns aszkorbinsav kezelés hatását a szénhidrát anyagcsere zavarának mértékét jelző HbA1c szintekre. Vizsgálatainkba 36 1. típusú és 131 2. típusú cukorbeteget vontunk be. Megállapításaink: (A) 1. A plazma nitrát/nitrit szint magasabb peptikus fekélybetegségben és/vagy krónikus gastritisben - az emelkedés független a Helicobacter pylori státusztól vagy az eradikációtól. 2. A nitrogén-oxid koncentráció magasabb és az oxigén szabadgyök-scavengerek mennyisége alacsonyabb Helicobacter pylori pozitiv peptikus fekélybetegekből nyert gyomorszövetben. 3. Mind gyulladásos bélbetegekben (colitis ulcerosa), mind colorectalis rákbetegekben a plazmában növekedett nitrát/nitrit szintet találtunk. A plazma nitrát szint növekedése a daganatos betegekben a monocyták fokozott endogén nitrogén oxid (NO) termeléséből származhat. Azt is kimutattuk, hogy az emelkedett NO képződés nem specifikus a tumoros folyamatra. 4. A colorectalis tumor jelenlétének időtartama a szervezetben megemeli a plazma nitrát/nitrit szinteket. 5. A kemoterápia okozta nagymennyiségű daganatsejt pusztulás által okozott gyulladás és következményes nitrogén oxid szintézis indukció magasabb plazma nitrát/nitrit szinteket eredményez. 6. A csökkent plazma szuperoxid gyökfogó aktivitás (SSA) és szulfhidril (SH) szintek fokozott oxigén-szabadgyök reakciókra utalnak mind olyan gyulladásos állapotban, mint a colitis ulcerosa, mind a tumor keletkezése során. Ez a csökkenés azonban másodlagos és tumoros betegekre nem specifikus. 7. A tumorszövetben mért alacsonyabb SH koncentráció, a szignifikánsan magasabb SSA változatlan nitrát/nitrit szintekkel, emelkedett szuperoxid és változatlan nitrogén oxid koncentrációt sugall vastagbél daganatos betegekben. A plazmában mért értékekkel 3
szembeni ellentmondás magyarázatára a következő két lehetőség merül fel: 1) A plazma nitrát/nitrit szint emelkedés nem/vagy nemcsak a tumoros szövetből származik; 2) Az általunk alkalmazott mérési módszerrel mért nitrát/nitrit szöveti szint maghatározása nem alkalmas a szövetek endogén NO szintáz aktivitásának mérésére. 8. Elsőként sikerült kimutatnunk colorectalis tumorszövetekben nitrotirozin jelentlétét, ami az in vivo peroxinitrit képződésre utal. 9. A colorectalis daganatban szenvedő betegek gyengébb plazma antioxidáns védelemmel rendelkeznek, melynek mértéke függ a betegség súlyosságától a stádiumnak megfelelően. 10. A szisztémás antioxidáns aktivitás vizsgálatakor, a plazma össz-scavenger kapacitásának mérése új, értékes módszernek bizonyult a természetes szisztémás antioxidáns rendszer tanulmányozására. Tükrözni látszik a daganat súlyosságát és fennállási idejét colorectalis carcinomás betegekben. Összefoglalva, a fokozott plazma nitrát/nitrit szint, a csökkent antioxidáns védelem és a peroxinitrit in vivo képződése direkt bizonyíték arra, hogy nitrogén- és oxigén-szabadgyökök fokozott mennyiségben szabadulnak fel colorectalis carcinomában és további adatot nyújtanak a nitrátok/nitrózaminok toxicitására és a karcinogenezisben kifejtett lehetséges szerepükre vonatkozóan. Az a tény, hogy hasonló oxidatív károsodások figyelhetőek meg colitis ulcerosás betegekben azt jelzi, hogy a találtak nem specifikusak a tumorok keletkezésére, hanem megfigyelhetőek más, gyulladásos betegségekben is. (B) 1. Jó glikémiás mutatókkal rendelkező IDDM betegekben nem találtuk súlyos jelét az antioxidáns emzimrendszer kiegyensúlyozatlanságának. Feltételezzük, hogy az 1. típusú cukorbetegséget azon esetekben, amikor a vércukor szigorú kontrollja intenzifikált inzulin terápiával megvalósul, nem vagy csak részlegesen kísérik a prooxidáns - antioxidáns egyensúly változásai. 2. Tíz évnél rövidebb időn belül az egyensúlyban tartott diabetes, nem változtatja meg az antioxidáns státuszt, de hosszabb időszakot követően még a jól kontrollált cukorbetegségnek is szignifikáns hatása van az antioxidánsok szintjére. A szuperoxid 4
dizmutáz (SOD) aktivitása és a "teljes antioxidáns státusz" szignifikánsan csökken, tehát a hosszabb klinikai fennállású cukorbetegség rosszabb funkciójú antioxidáns védelemmel társul. 3. A vörösvérsejtek SOD aktivitása negatív asszociációt mutat a rövid és a hosszútávú cukoranyagcserét jellemző értékekkel. 4. 2. típusú, inzulinnal kezelt, elfogadható anyagcsere-egyensúlyú cukorbetegek plazma redukált glutation szintje szignifikánsan csökkent. 5. Cukorbetegekben a HbA1c érték és a plazma C-vitamin szintje között negatív korrelációt találtunk. 6. Az A- és az E-vitamin szintje szignifikáns összefüggést mutat a lipid paraméterekkel. A zsíroldékony antioxidáns vitaminok - diabetesben észlelhető - magasabb plazmakoncentrációja az emelkedett lipidszintek miatt csak látszólag jelent fokozott antioxidáns védelmet. A fokozott membránvédő hatás nem valószínűsíthető, mert nem abszolút, hanem a lipoproteinekre vonatkoztatott koncentrációjuk magasabb. 7. A C-vitamin koncentráció jól kezelt, kiegyensúlyozott diétájú 2. típusú cukorbetegekben nem különbözik szignifikánsan az egészséges, vegyes táplálkozású egyénekétől. 8. Jól kezelt 2. típusú cukorbetegekben a vizsgált kis molekulasúlyú plazma antioxidánsok koncentrációja megegyezik a nem cukorbetegekével, kivéve a húgysav szintet, amely az inzulinnal kezelt cukorbetegekben alacsonyabb. 9. Cukorbetegekben - ellentétben a nem cukorbetegekkel - a VLDL+LDL frakcióban mért, koleszterin szintre vonatkoztatott, antioxidáns E-vitamin koncentráció hiperlipémiás betegekben nem alacsonyabb, mint normolipémiásokban. 10. Hiperlipémia esetén mind a kontrollokban, mind a cukorbetegekben az össz-plazma A vitamin/koleszterin arány alacsonyabb volt, mint a normolipémiás csoportokban, ami csökkent antioxidáns védelemre utal. 11. A hosszútávú, nagy dózisú aszkorbinsav pótlás csökkenti a glikált haemoglobin szintet és emeli a plazma GSH koncentrációt egészséges és cukorbeteg személyekben egyaránt. 5
Összefoglalva, a cukorbetegség mindkét típusát kísérő, az antioxidáns rendszerben észlelhető változások jellegzetességeit és mértékét jelentősen befolyásolja a szénhidrát- és zsír-anyagcsere helyzet súlyossága, fennállásának időtartama. A diabetes jó kontrollja a prooxidáns-antioxidáns egyensúly fenntartásával is hozzájárulhat a késői szövődmények megjelenésének késleltetéséhez. Az értekezés témájában megjelent saját közlemények I. Prónai László, Szaleczky Erika, Fehér János. Nitrogén-oxid. Alapkutatás és lehetséges klinikai alkalmazás Orvosi Hetilap, 137 (31), 1699-1704, 1996 II. Pusztai Péter, Prechl József, Somogyi Anikó, Szaleczky Erika, Fehér János. Kísérleti modellek a diabetes mellitus patomechanizmusának megismerésében Orvosi Hetilap, 137 (34), 1865-1870, 1996 III. Anikó Somogyi, Magdolna Herold, Anna Blázovics, Erika Szaleczky, Péter Pusztai, András Rosta. Vitamin A and E determination in blood plasma by isocratic high pressure liquid cromatography ACH Models in Chemistry, 133 (5-6), 545-551, 1996 IF: 0,197 IV. Erika Szaleczky, József Prechl, Péter Pusztai, András Rosta, János Fehér, Anikó Somogyi. Antioxidant status of patients with well controlled type I diabetes Medical Science Monitor, 3 (2), 163-166, 1997 V. József Prechl, Erika Szaleczky, Péter Pusztai, Ibolya Kocsis, Zsolt Tulassay, Anikó Somogyi. Effect of clinical duration of diabetes mellitus on various antioxidants in blood Medical Science Monitor, 3 (2), 167-170, 1997 VI. Molnár Béla, Szaleczky Erika, Prónai László, Papik Kornél, Zágoni Tamás, Tulassay Zsolt. Kefebiopsziás gyomorkenetek kvantitatív citológiai vizsgálata Magyar Belorvosi Archivum, 50, 153-157, 1997 6
VII. Somogyi Anikó, Szaleczky Erika, Pusztai Péter, Braun László, Sármán Beatrix. A plazma antioxidánsai II. típusú cukorbetegekben Magyar Belorvosi Archivum, 50, 187-192, 1997 VIII. Szaleczky Erika, Prónai László, Rosta András, Molnár Béla, Nakazawa Hiroe, Tulassay Zsolt. Megnövekedett plazma nitrát/nitrit szint és csökkent antioxidáns védelem colorectalis carcinomában - in vivo peroxinitrit képzõdés Magyar Belorvosi Archivum, 50, 197-201, 1997 IX. Erika Szaleczky, József Prechl, Éva Ruzicska, János Fehér, László Braun, Gábor Bánhegyi, Miklós Csala, József Mandl, Anikó Somogyi. Reduction of glycated hemoglobin levels by long term, high dose ascorbic acid supplementation in healthy and diabetic patients Medical Science Monitor, 4 (2), 241-244, 1998 X. Erika Szaleczky, József Prechl, János Fehér, Anikó Somogyi. Alterations in enzymatic antioxidant defence in diabetes mellitus - a rational approach The Postgraduate Medical Journal, 75, 13-17, 1999 IF: 0,402 XI. Anikó Somogyi, Erika Szaleczky, József Prechl. Inhibation of advanced glycated end products (válaszlevél) The Postgraduate Medical Journal, 75, 446, 1999 IF: 0,402 XII. Erika Szaleczky, András Rosta, Hiroe Nakazawa, János Fehér, Zsolt Tulassay, László Prónai. Plasma nitrate/nitrite levels in patients with colorectal carcinoma Medical Science Monitor, 5 (6), 1098-1100, 1999 XIII. Erika Szaleczky, László Prónai, Hiroe Nakazawa, Zsolt Tulassay. Evidence for in vivo peroxynitrite formation in patients with colorectal carcinoma - higher plasma nitrate/nitrite levels and lower protection against free oxygen radicals Journal of Clinical Gastroenterology, 30 (1), 47-51, 2000 IF: 0,916 (1999) 7
XIV. Farkas Klára, Szaleczky Erika, Sármán Beatrix, Kocsis Ibolya, Jermendy György, Somogyi Anikó: A nitrit/nitrát plazmaszintek és az antioxidáns status vizsgálata 1-es típusú cukorbetegségben szenvedőkben Diabetologica Hungarica, 8 (1), 13-18, 2000 XV. Béla Molnár, Erika Szaleczky, László Prónai, Kornél Papik, Tamás Zágoni, Zsolt Tulassay. Quantitative DNA and morphometric analysis of gastroscopic brush smears by TV image analysis European Journal of Gastroenterology and Hepatology, 12 (1), 103-109, 2000 IF: 1,583 (1999) XVI. Erika Szaleczky, László Prónai, Béla Molnár, Lajos Berczi, János Fehér, Zsolt Tulassay: Increased cell proliferation in chronic Helicobacter pylori positive gastritis and gastric carcinoma - Correlation between immuno-histochemistry and Tv image cytometry Analytical Cellular Pathology, 20, 131-139, 2000 IF: 0,986 (1999) 8