Ciklodextrinek alkalmazása folyadékkromatográfiás módszerekben Dr. Szemán Julianna Cyclolab Ciklodextrin Kutató-Fejlesztő Laboratórium Kft. 197. Budapest, Illatos u. 7. cyclolab@cyclolab.hu www.cyclolab.hu
A ciklodextrinek szerepe Befolyásolja a szelektivitást Királis felismerőképesség Ciklodextrinek alkalmazása az eluensben Ciklodextrin tartalmú folyadékkromatográfiás állófázisok
Ciklodextrinek alkalmazása az eluensben A ciklodextrin kiválasztása ldhatóság alap CD-nél probléma Elválasztandó anyag molekulaméret, funkciós csoportok Single isomer vagy statisztikusan szubsztituált Ár Statisztikusan szubsztituált származékok A homológok/izomerek száma rendkívül nagy Jellemzők: szubsztitució fok (DS) és a szubsztituensek eloszlása A batch-to-batch reprodukálhatóság rendkívül fontos. CMBCD batch-to-batch reprodukálhatósága 25 Group A 3 Batch 1 25 Group A 3 Batch 2 25 Group A 3 Batch 3 2 15 1 5 1 2 4 Group B Group C 2 15 1 5 1 2 4 5 Group B Group C 2 15 1 5 2 1 4 Group B 5 Group C 25 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25
Ciklodextrinek alkalmazása az eluensben Az állófázis kiválasztása Fordított fázisú töltet, vizes eluens Függ az elválasztandó anyagtól k: 1-15 MeH-víz < 5% RP állófázisok: C18, C8, C4, CN Töltet típustól is függ (C tartalom, end-cap) P. Zarzycki et al. J. Chromatogr. A 955 (22) 71-78 J. Szemán et al. J. Chromatogr. A 728 (1996) 423
Ciklodextrinek alkalmazása az eluensben Az eluens összetételének szerepe ph Puffer hatása ionerösség puffer kation-anion ionpárképzés és komplexképzés Szerves oldószer hatása MeH, EtH, IPA, ACN, (THF) a komplex stabilitási állandóra solute - állófázis kölcsönhatásra Norgestrel elválasztás, szelektivitás változás a szennyezőkre is! M. Gazdag et al. J. Chromatogr. 45 (1988) 145
Ciklodextrinek alkalmazása az eluensben CD koncentráció hatása 12 1 k, Rs 8 6 4 2 k Rs 2.5 5 1 2 CMBCD [mg/ml] Aminoetil-benzodioxán származék elválasztása karboximetil-bcd-vel
Ciklodextrinek alkalmazása az eluensben A szubsztitúciós fok hatása Rs k R s 1.6 1.4 1.2 1.8.6.4.2 2 4 6 8 1 DS k 25 2 15 1 5 2 4 6 8 1 DS Aminoetil-benzodioxán származék elválasztása karboximetil-bcd-vel J. Szemán et al. J. Chromatogr. A 728 (1996) 423
Ciklodextrinek alkalmazása az eluensben CD keverékek használata Különböző szelektivitású CD származékok együttes használata (CE-ben elterjedt) HPLC: barbiturát enantiomerek elválasztása αcd és permetilezett-bcd (TRIMEB) keverékkel TRIMEB szerepe az állófázis módosítása: csökken a retenció, kevesebb oldószer kell, ezért jobb az enantiomer elválasztás R. Nowakovski et al. J. Chromatogr. A, 782, 1-11, 1997
Ciklodextrinek alkalmazása az eluensben Szelektivitás növelése nem királis anyagoknál 24.351 15.821 22.99 5 mg/ml DIMEB 5.175 51.11 FLN: Flunisolide BRFLN: Bromoflunisolide FLNAL: Flunisolide alcohol 6.853 8.46 1.313 11.652 17 mg/ml HPGCD DS: Desonide 22.974 CLDS: Chlorodesonide
Ciklodextrinek alkalmazása az eluensben Gyógyszerkönyvi példa Pharmeuropa 2.1 (28. január) Iloprost, Polar related substances Mobile phase: mix 33 ml of acetonitrile R1 and 67 ml of a 12 g/l solution of β-cyclodextrin R adjusted to ph 2. with phosphoric acid R. pálos eluens, kiválás
Ciklodextrinek alkalmazása az eluensben Előnyök A szelektor minősége és koncentrációja könnyen változtatható lcsó oszlopok ill. olcsó adalékok használhatók Hátrányok A szelektor zavarhatja a detektálást (UV, MS) A szelektor igény viszonylag nagy (A szelektor minősége változó lehet)
Ciklodextrin tartalmú állófázisok Ciklodextrin tartalmú állófázisok a kereskedelemben az irodalomban leírt Ajánlott irodalom: Chiral Separations, Methods and Protocols; G. Gübitz és M.G. Schmid CYCLBND handbook http://www.sigmaaldrich.com/analyticalchromatography/hplc/columns/chiral/cyclobond.html www.cyclodextrin.net (Armstrong cikkek)
Ciklodextrin tartalmú állófázisok Fordított fázisú elválasztás - ugyanazok az optimálási paraméterek érvényesek, mint az eluensben használt (oldószer, puffer, ph, ionerősség, hőmérséklet) Polar-organikus mód - Acetonitril/metanol/ecetsav/trietilamin mozgófázis Normál fázisú elválasztás - Hexan/Ipa, EtH
Saját fejlesztésű királis állófázisok (Natursep) Az állófázis előállítás szempontjai - a szelektor minősége - a szilikagélhez kötés módja - a szilikagél minősége - a szabad szilanolok mennyisége Mono-szubsztituált CD-származék immobilizálásának előnyei: A jól definiált, izomertiszta származékolószerrel - homogén felület - monomer borítottság (víz kizárásával történik) érhető el
Az állófázis előállítása A CD származék reakciója trietoxi-szilil-propil-izocianát Vizmentes közegben kötés a szilikagélhez Szabad szilanolok: trimetil szilil endcap Az állófázis minőségének ellenőrzése (NMR)
mau 6 5 4 3 2 1 DA D1 A, Sig=25,4 Ref=55,1 (D:\DC\KIRÁLI~1\HPLC3_~1\ENA NTI~1\ENA1215\WRFE11.D) 2 4 6 8 1 12 min A szilikagél minőségének hatása Királis teszt - warfarin Metanol : TEAPbuffer (ph3) = 35:65 ill *54,5% MeH Hypersil mau Exsil DAD1A, Sig=2,4Ref=36,1(L:\HPLC3\HPLC3 28\ENANTIMER\ENA226\28-2-262\WRF2.D) mau Fuji kis boritottság!! DAD1A, Sig=2,4Ref=55,1(L:\HPLC3\HPLC3 28\ENANTIMER\ENA99\28-9-94\WRF2.D) 4 8 3 6 2 4 1 2-2 2.5 5 7.5 1 12.5 15 17.5 2 22.5 min 2.5 5 7.5 1 12.5 15 17.5 2 min MN DAD1 A, Sig=25,4 Ref=55,1 (D:\DC\KIRÁLI~1\HPLC3_~2\ENANTI~1\ENA326\WRF5.D) mau 17.5 15 12.5 Hypersil t R 9,2 Rs 3,7 α 1,19 N 3 1 7.5 5 2.5 Exsil Fuji 17,8 15,2 2,4 1,3 1,14 1,6 21 28 2.5 5 7.5 1 12.5 15 17.5 2 min Macherey-N. 15,7* 1,7 1,15 11
Analitikai elválasztások PMMBCD oszlopon Warfarin.1% R szennyezés Clopidogrel.5% R szennyezés S N Cl CH 3 H CH 3 Cl Cl Permetrinsav H 3 C CH 3 H Naproxen CH 3 Rs: 1R-cis/1S-cis: 2.2 1S-cis/1R-trans: 2.4 1R-trans/1S-trans: 4.4 1R-cis 1S-cis 1R-trans 1S-trans H 3 C H
Permetilezett és hidroxipropilezett BCD-s állófázisok összehasonlítása Tropa sav H H mau 12 1 DAD1 A, Sig=2,4 Ref=36,1 (:\ENA113\TRP2.D) DAD1 A, Sig=2,4 Ref=36,1 (Z:\DATA\ENA113\TRPASAV_ELU11.D) Permetilezett BCD oszlop Rs: 2,6 8 6 4 Hidroxipropilezett BCD oszlop Rs: 4,93 2 5 1 15 2 25 3 min
Különböző CD-s állófázisok elválaszt lasztóképességének összehasonlításasa KUMARINK Anyag BCD HPBCD PMBCD CMBCD N Acenokumarol.75.83 2.14.62 H CH 3 Fenprokumon 1.13 1.4.78 1.61 H CH 3 Warfarin H.46 1.47 2.94.5 CH 3.1 % TEA-foszfát puffer, ph: 3,5 metanol,,7 ml/perc, 25 ºC
Különböző CD-s állófázisok elválaszt lasztóképességének összehasonlításasa Anyag Képlet BCD HPBCD PMBCD CMBCD Cl H 3 C H Cl Fenoprop.. 2.37. Cl H 3 C H 2,4-DP Cl.87.63.5. Cl H 3 C H Cl Mecoprop 1.9.48 1.4. CH 3.1 % TEA-foszfát puffer, ph: 3,5 metanol,,7 ml/perc, 25 ºC
Különböző CD-s állófázisok elválaszt lasztóképességének összehasonlításasa Anyag Képlet BCD HPBCD PMBCD CMBCD Cl Cl Cisz-permetrinsav. 1.21 2.33. Transz-permetrinsav 1.21.76 4.66. H 3 C CH 3 H H Tropasav.61 4.18 2.6 n.a. H H CH Terbutalin H 3 3 C 1.78 2.54. 1.9 H H NH CH 3 F Fluoxetin 1.39 1.8 2.33 n.a. F F NH CH3.1 % TEA-foszfát puffer, ph: 3,5 metanol,,7 ml/perc, 25 ºC
Különböző CD-s állófázisok elválaszt lasztóképességének összehasonlításasa Phenprocoumon enantiomerek (R>S) forditott elúciója BCD és PMBCD oszlopokon, UV és polarimetriás detektálással. H CH 3
Szemipreparativ elválasztás Warfarin 1 mg WRF (mg/ml).14.12.1.8.6.4.2 -.2 1 2 3 4 5 6 Time (min) 1R :.52 mg Purity: 95.2% 1S :.42 mg Purity: 95.2%