2.6.21. Nukleinsav-amplifikációs módszerek Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.8. - 1 2.6.21. NUKLEINSAV-AMPLIFIKÁCIÓS MÓDSZEREK 07/2010:20621 1. BEVEZETÉS A nukleinsav-amplifikációs módszerek két különböző elven alapulnak: 1. valamely cél-nukleinsavszekvencia amplifikációján, például polimeráz láncreakció (PCR), ligáz láncreakció (LCR) vagy izoterm ribonukleinsav-(rns)-amplifikáció alkalmazásával, 2. valamely hibridizációs szignál amplifikációján, például dezoxiribonukleinsav (DNS) esetében az elágazó DNS (bdns) módszer alkalmazásával. Ebben az esetben a szignálamplifikációt anélkül érjük el, hogy a nukleinsavat ismétlődő amplifikációs ciklusoknak vetnénk alá. Ez az általános fejezet a PCR-módszert írja elő referenciamódszerként. Egyéb módszerek is alkalmazhatók, amennyiben megfelelnek az alábbiakban előírt minőségi követelményeknek. 2. ALKALMAZÁSI TERÜLET Ez a fejezet rögzíti a minta előkészítésére, a DNS-szekvenciák in vitro amplifikációjára és a specifikus PCR-termék kimutatására vonatkozó követelményeket. A PCR segítségével meghatározott DNS-szekvenciák mutathatók ki. RNS-szekvenciák is kimutathatók, ha a ribonukleinsavat fordított átírással (reverz transzkripcióval) átalakítjuk a komplementer DNS-sé (cdns), és ezt követően amplifikáljuk. 3. A MÓDSZER ELVI ALAPJAI A PCR olyan eljárás, amely lehetővé teszi DNS-szakaszok és RNS-szakaszok specifikus in vitro amplifikációját, utóbbiakét cdns-sé történt fordított átírásukat követően. A kettősszálú DNS egyszálúvá történő denaturálása után két ellentétes polaritású, szintetikus oligonukleotid primert (indító molekulát) kapcsolunk az amplifikálandó DNS megfelelő komplementer szekvenciáira. A primerek és a komplementer DNS-szekvencia közti specifikus bázispárképződés eredményeként kialakult rövid kettősszálú szakaszok behatárolják az amplifikálandó DNS-szakaszt, és kiindulási pontokat kínálnak egy hőstabil DNS-polimeráz segítségével végzett in vitro DNS-szintézishez. A DNS-amplifikáció a következő szakaszokban (ciklusokban) megy végbe: a nukleinsav (célszekvencia) hővel végzett denaturálása két szállá, a primerek specifikus rákapcsolása a célszekvenciára, megfelelő körülmények között; a mindkét szálra kapcsolt primerek DNS-polimeráz közreműködésével történő meghosszabbítása, megfelelő hőmérsékleten (DNS-szintézis). A hő-denaturálás, a primerek rákapcsolása és a DNS-szintézis ismételt ciklusai a primerek által behatárolt DNS-szakaszok exponenciális amplifikációját eredményezik.
2.6.21. Nukleinsav-amplifikációs módszerek Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.8. - 2 A specifikus PCR-termék az ún. amplikon számos megfelelő specificitású és érzékenységű módszerrel detektálható. A multiplex PCR-meghatározások során több olyan primerpárt használnak, amelyeket a különböző célszekvenciák egyidejű, egyetlen reakcióban lezajló amplifikációjához terveztek. 4. VIZSGÁLATI ANYAG A PCR rendkívüli érzékenysége miatt a mintákat óvni kell attól, hogy idegen célszekvenciákkal szennyeződjenek. A vizsgálandó anyag mintavételéhez, eltartásához és szállításához olyan körülményeket kell biztosítani, amelyek a célszekvencia bomlásának lehetőségét minimálisra csökkentik. RNS-célszekvenciák esetében speciális óvintézkedésekre van szükség, mert az RNS rendkívül érzékeny a ribonukleázok lebontó hatásával szemben. Tekintettel arra, hogy egyes hozzáadott reagensek pl. antikoagulánsok, tartósítószerek némelyike szintén zavarhatja a vizsgálat menetét, megfelelő gondossággal kell eljárni. 5. VIZSGÁLATI MÓDSZER 5.1. A szennyeződés megelőzése A szennyeződés kockázata indokolja, hogy a munkaterületeket az alkalmazott anyagtól és technológiától függően szigorúan elkülönítsük egymástól. Figyelembe kell venni a személyzet mozgását, a munkaruházatot, az anyagáramlást, a szellőzőrendszert, valamint a szennyezések eltávolítására alkalmazott eljárásokat. A rendszert munkaterületekre (zónákra) kell osztani, ilyenek pl. master-mix zóna (az a terület, ahol kizárólag templátmentes anyagokkal, pl. primerekkel, tompítóoldatokkal stb. dolgoznak), PCR előtti zóna (az a terület, ahol a vegyszerekkel, mintákkal és kontrollokkal dolgoznak), PCR-amplifikációs zóna (az amplifikált anyagot zárt rendszerben kezelik), PCR-t követő detektálási zóna (az egyetlen terület, ahol az amplifikált anyagot nyitott rendszerben kezelik). 5.2. A minta előkészítése A minta előkészítése során az amplifikálandó célszekvenciát hatékony eljárással, reprodukálható módon kell kivonni, ill. felszabadítani a vizsgálandó anyagból, mégpedig úgy, hogy az amplifikáció a választott reakciókörülmények között kivitelezhető legyen. E célra számos fizikai-kémiai kivonó eljárás és/vagy dúsítási eljárás alkalmazható. A vizsgálandó anyagban jelen lévő adalékanyagok zavarhatják a PCR-t. A vizsgálandó anyagból származó gátlószerek jelenlétének ellenőrzésére a 7.3.2. pontban előírt eljárásokat kell alkalmazni. RNS-templátok esetében ügyelni kell a ribonukleáz-aktivitás kizárására.
2.6.21. Nukleinsav-amplifikációs módszerek Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.8. - 3 5.3. Amplifikáció A célszekvencia PCR-amplifikációjának ciklusait meghatározott körülmények között kell végrehajtani; ilyenek a kettősszálú DNS denaturálásához, a primerek rákapcsolásához és meghosszabbításához alkalmazandó hőmérsékletprofil, a kiválasztott hőmérsékleteken végzett inkubációk időtartama, a felfűtés sebessége. Ezek különböző tényezőktől függnek. Ilyenek például: a primerek és a célszekvenciák hossza, valamint bázisösszetétele; a DNS-polimeráz típusa, a tompítóoldat összetétele és az amplifikáció során használt reakcióelegy térfogata; az alkalmazott termociklizáló készülék típusa, valamint a hővezetés sebessége a készülék, a reakcióedény és a reakcióelegy között. 5.4. Kimutatás A PCR segítségével létrehozott amplikont mérete, szekvenciája, kémiai átalakítása, ill. ezen paraméterek kombinációja révén azonosíthatjuk. A méret szerinti kimutatásra és jellemzésre alkalmas a gélelektroforézis (agaróz- vagy poliakrilamid-géllemezek, illetve kapilláris elektroforézis alkalmazása) vagy az oszlopkromatográfia (pl. folyadékkromatográfia). A szekvencia-összetétel alapján történő azonosításra és jellemzésre alkalmas a célszekvenciához illeszkedő komplementer szekvenciával rendelkező próbafragmensek specifikus hibridizációja, vagy az amplikon hasítása célspecifikus támadáspontú restrikciós-enzimmel. Az azonosítás és a jellemzés kémiai átalakítással is lehetséges, pl. egy fluorofór csoport bevitele után az amplikonok fluoreszcencia-gerjesztéssel detektálhatók. Az amplikonok radioizotóppal jelzett próbafragmensekkel kivitelezett reakció után radioaktivitás-méréssel, vagy enzimmel jelzett próbafragmensekkel végrehajtott reakció után enzimes immunanalitikai módszerekkel is kimutathatók. 6. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE Egy vizsgálaton belül az eredmény csak akkor értékelhető, ha a pozitív kontroll(ok) egyértelműen pozitív(ak), a negatív kontroll(ok) pedig egyértelműen negatív(ak). Minthogy a PCR módszer rendkívül érzékeny, de éppen emiatt a szennyeződés kockázata is nagy, a pozitív eredményeket meg kell erősíteni: a teljes vizsgálati eljárást párhuzamos mérés alkalmazásával meg kell ismételni. Az ismételt vizsgálatot amennyiben megoldható a minta egy újabb részletével kell elvégezni. A mintát pozitívnak tekintjük, ha az ismételt vizsgálatok közül legalább egy pozitív eredményt adott. Amennyiben célszekvencia-határérték van előírva, kvantitatív vizsgálati rendszerre van szükség.
2.6.21. Nukleinsav-amplifikációs módszerek Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.8. - 4 7. MINŐSÉGBIZTOSÍTÁS 7.1. A PCR vizsgálati rendszer validálása A validációs programnak a műszerek validálását és az alkalmazott PCR-módszer validálását egyaránt magában kell foglalnia. Ezzel kapcsolatban az ICH irányelvekre (Q2B: Az analitikai módszerek validálása: Módszertan 1 ) kell hivatkozni. A PCR-vizsgálat validálásához nélkülözhetetlenek a megfelelő hivatalos referenciakészítmények vagy az olyan házi referenciakészítmények, amelyeket azoknak a célszekvenciáknak a Nemzetközi Standardjaira kalibráltak, amelyekre a vizsgálati rendszer irányul. 7.1.1. A mérés megállapított pozitív határértékének (pozitív cut-off pont) meghatározása A minőségi vizsgálatok validálása folyamán meg kell határozni a pozitív határértéket. A pozitív határérték a célszekvenciáknak a minta térfogategységére vonatkoztatott legkisebb száma, amely a futtatások 95%-ában kimutatható. A pozitív határérték több, egymást kölcsönösen befolyásoló tényezőtől függ; ilyen a minta kivonatának térfogata és az extrakciós módszer hatékonysága, a cél-rns transzkripciója a komplementer DNS-sé, az amplifikációs folyamat és a kimutatási módszer. Amikor a PCR-rendszer kimutatási határát definiáljuk, utalni kell minden egyes célszekvencia cut-off -pontjára, valamint a vizsgálatnak e határérték feletti és alatti teljesítőképességére. 7.1.2. A mennyiségi meghatározás módszerei A mennyiségi meghatározások validálása folyamán a következő teljesítményjellemzőket kell megállapítani: torzításmentesség, pontosság, specifikusság, a mennyiségi meghatározás alsó határa, linearitás, mérési tartomány és robusztusság. 7.2. A reagensek minőségének ellenőrzése Minden olyan reagenst, amely az eljárás szempontjából döntő fontosságú, ellenőrizni kell, mielőtt a rutinszerű alkalmazás során felhasználásra kerülne. Elfogadásukat/visszavonásukat előre megállapított minőségi követelményekre kell alapozni. A primerek a PCR-meghatározás döntő fontosságú alkotóelemei, ezért tervezésük, tisztaságuk és a PCR-meghatározás során való felhasználásuk validálása különös gondosságot igényel. Az amplikon specifikus kimutatása érdekében a primerek átalakíthatók (pl. konjugálás fluorofórral vagy antigénnel), amennyiben az átalakítás nem gátolja a célszekvencia amplifikációjának pontosságát és hatékonyságát. 7.3. A futtatások ellenőrzése 7.3.1. Külső kontrollok Annak érdekében, hogy a szennyeződés lehetőségét a legkisebbre csökkentsük, és a megfelelő érzékenységet biztosítsuk, minden egyes PCR-vizsgálathoz a következő külső kontrollokra van szükség: 1 Validation of Analytical Method: Methodology.
2.6.21. Nukleinsav-amplifikációs módszerek Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.8. - 5 pozitív kontroll: a pozitív kontroll meghatározott számú célszekvencia-másolatot tartalmaz; ennek a számnak közel kell lennie a pozitív határértékhez, megállapítása minden PCRmeghatározási rendszerre egyedileg történik, és a rendszer pozitív cut-off pontjának többszöröseként adják meg, negatív kontroll: megfelelő a célszekvenciákat bizonyítottan nem tartalmazó mátrixból vett minta. 7.3.2. Belső kontrollok A belső kontrollok olyan meghatározott nukleinsav-szekvenciák, amelyek, hacsak nincs más előírás, a primer-kötőhelyeket tartalmazzák. A belső kontrollokat meghatározott hatékonysággal kell amplifikálni, és az amplikonoknak egyértelműen felismerhetőknek kell lenniük. A belső kontrolloknak ugyanolyan nukleinsavtípust (DNS-t vagy RNS-t) kell tartalmazniuk, mint a vizsgálandó anyagnak. A belső kontrollt célszerű a vizsgálandó anyaghoz a nukleinsav izolálása előtt hozzáadni; ebben az esetben a vizsgálat egészének (kivonás, reverz transzkripció, amplifikáció, kimutatás) kontrolljaként működik. 7.3.3. Határérték-kontroll A mennyiségi meghatározásokra vonatkozó határérték-kontroll olyan vizsgálati minta, amelyben a vizsgálandó alkotórész koncentrációja azt a határértéket jelenti, amelyet nem lehet meghaladni. Az ilyen vizsgálati mintát amelyben a vizsgálandó alkotórész a megfelelő módon Nemzetközi Egységre kalibrált mennyiségben van jelen a mennyiségi meghatározások minden egyes futtatása során a mintával párhuzamosan kell vizsgálni. 7.4. Külső minőségellenőrzés A külső minőségellenőrzési programokban való részvétel minden egyes laboratórium és minden egyes vizsgáló személy részére fontos PCR-minőségbiztosítási eljárás. A következő rész tájékoztató jellegű. A hepatitisz-c-vírus (HCV)-ribonukleinsav plazmakeverékekben történő kimutatására szolgáló nukleinsav-amplifikációs módszerek (NAT) 2 validálása; útmutató 1. ALKALMAZÁSI TERÜLET A nukleinsav-amplifikációs analitikai eljárások többsége nukleinsav kimutatására alkalmas kvalitatív (kvantális) vizsgálat. Ezeket kiegészítheti néhány házon belül kifejlesztett vagy kereskedelemből beszerzett készlettel végzett kvantitatív vizsgálat. A plazmakeverékek HCV- RNS-szennyezésének kimutatására a kvalitatív vizsgálatok alkalmasak. Ezek a Pharmeuropa Szakmai Útmutató a cikkelyek kidolgozásához c. kiadványa (1999, december, III. fejezet Analitikai eljárások validálása ) által definiált szennyezéshatárérték-vizsgálatnak tekinthetők. 2 Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT).
2.6.21. Nukleinsav-amplifikációs módszerek Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.8. - 6 Az útmutató a plazmakeverékek HCV-RNS-szennyezésének méréséhez csak a kvalitatív nukleinsav-amplifikációs analitikai eljárásokra ír elő validálási módszereket. Ezért az ilyen analitikai eljárások validálása esetében a két legfontosabbnak tekintett jellemző a specifikusság és a kimutatási határ. Ezen túlmenően az analitikai eljárás robusztusságát is értékelni kell. Az útmutató emellett általánosságban véve is a nukleinsav-amplifikáció validálásának alapját képezheti. Jelen szövegben analitikai eljáráson a nukleinsav extrakciójától az amplifikált termékek kimutatásáig terjedő teljes folyamatot értjük. Ha az analitikai eljárás egy részéhez vagy egészéhez kereskedelmi forgalomban kapható készletet (kitet) használunk, a készlet gyártója által már elvégzett, dokumentált validációs vizsgálatokat nem kell elvégezni. Mindazonáltal, a készletnek az adott célra vonatkozó teljesítőképességét (pl. kimutatási határ, robusztusság, keresztszennyeződés) a felhasználónak bizonyítania kell. 2. SPECIFIKUSSÁG A specifikusság a módszernek azt a képességét jelenti, hogy alkalmas a várhatóan jelen levő összetevők jelenlétében a nukleinsav egyértelmű meghatározására. A nukleinsav-amplifikációs analitikai eljárás specifikussága függ a primerek és a próbafragmens megválasztásától (a végtermék analízise esetében), valamint a vizsgálati körülmények szigorúságától (mind az amplifikációs, mind a kimutatási szakaszt illetően). A primerek és a próbafragmensek megtervezésekor a primerek és próbafragmensek kimutatásának specifikussága (ti. hogy a vizsgálattal csak a HCV-RNS-t mutatjuk ki) úgy igazolható, hogy a kiválasztott szekvenciákat adatbankokban közzétett szekvenciákkal hasonlítjuk össze. A HCV esetében a primereket (és a próbafragmenseket) a HCV-genomnak rendszerint az összes genotípusra nézve rendkívül állandó, 5 nem-kódoló részének szakaszaiból választjuk. Az amplifikált terméket a számos módszer egyikével pl. beillesztett primerekkel végzett amplifikációval, restrikciós-enzim-analízissel, szekvenciaanalízissel vagy adott specifikus próbafragmenssel történő hibridizációval egyértelműen azonosítani kell. Az analitikai eljárás specifikusságának validálása érdekében legalább 100 HCV-RNS-negatív plazmakeveréket kell megvizsgálni, és inaktivitásukat kivétel nélkül igazolni kell. Inaktív plazmakeverékekből származó, megfelelő minták az Európai Gyógyszerminőségi Igazgatóságtól 3 szerezhetők be. Szintén a primerek, a próbafragmensek és a módszer paramétereinek megválasztásától függ, hogy az analitikai eljárás alkalmas-e az összes HCV-genotípus kimutatására. Az alkalmasságot jól jellemzett referenciakészítményekkel kell bizonyítani. Mindazonáltal, néhány genotípus (pl. a 6-os genotípus) mintájának beszerzési nehézségei miatt, a leggyakoribb genotípusokat (Európában pl. az 1-es és a 3-as genotípust) kell megfelelő érzékenységgel kimutatni. 3 European Directorate for Quality of Medicines & HealthCare.
2.6.21. Nukleinsav-amplifikációs módszerek Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.8. - 7 3. KIMUTATÁSI HATÁR Adott egyedi analitikai eljárás kimutatási határának nevezzük valamely mintában a nukleinsav azon legkisebb mennyiségét, amely kimutatható, de mennyisége nem feltétlenül határozható meg pontosan. A HCV-RNS plazmakeverékekben történő kimutatására alkalmazott nukleinsav-amplifikációs analitikai eljárással általában kvalitatív eredményeket kapunk. Csak kétféle eredmény lehetséges: pozitív vagy negatív. Bár a nukleinsav-amplifikációs analitikai eljárás kimutatási határának megállapítása ajánlott, gyakorlati célra inkább a pozitív cut-off pontnak nevezett határértéket kell meghatározni. Ez a határérték, mint azt a 2.6.21. általános fejezetben definiáltuk, a minta térfogategységére vonatkoztatott célszekvenciák legkisebb száma, amely a futtatások 95%-ában kimutatható. Ezt a határértéket befolyásolja a vizsgált egyedi mintákban lévő vírusgenomok megoszlása, továbbá az olyan tényezők is, mint pl. az enzimhatékonyság. Így az egyedi analitikai futtatásokra különböző 95%-os cut-off értékek adódhatnak. A pozitív cut-off pont meghatározása céljából munkastandardból vagy WHO HCV 96/790 Nemzetközi Standardra beállított BRP hepatitisz-c vírusból készült hígítási sorozatokat vizsgálunk különböző napokon, hogy megállapíthassuk az egyes futtatások közti ingadozást. Legalább három, egymástól független hígítási sorozatot vizsgálunk, elegendő számú párhuzamossal, úgy, hogy minden hígításra összesen 24 vizsgálati eredményt kapjunk, amelyeket azután statisztikai módszerrel értékelhetünk. Például egy laboratóriumban vagy 3 hígítási sorozatot vizsgálhatunk különböző napokon, hígításonként 8 párhuzamossal, vagy 4 hígítási sorozatot különböző napokon, hígításonként 6 párhuzamossal, vagy 6 hígítási sorozatot különböző napokon, hígításonként 4 párhuzamossal. Annak érdekében, hogy a hígítások számát ésszerű értéken tartsuk, egy előzetes vizsgálattal (pl. a plazmakeverék-minta logaritmikus hígításaival) meg kell határozni egy előzetes pozitív cutoff értéket (vagyis azt a legnagyobb hígítást, amely még pozitív jelet ad). Ezek után a hígítási tartományt az elővizsgálattal meghatározott cut-off pont köré választhatjuk (pl. a logaritmikus skálán 0,5 vagy ennél kisebb hígítási faktort és mátrixként egy negatív plazmakeveréket választva). Ezután megfelelő statisztikai módszerrel kiszámíthatjuk azt a HCV-RNSkoncentrációt, amelyet a futtatások 95%-ában ki tudunk mutatni. Ezek az eredmények az analitikai eljárás meghatározáson belüli és napok közötti ingadozását is bizonyíthatják. 4. ROBUSZTUSSÁG Valamely analitikai eljárás robusztussága annak a mértéke, hogy a módszer paramétereinek kicsi, de szándékos változtatásai mennyire hatástalanok az eljárásra; a robusztusság egyben jelzi a módszernek a normális alkalmazás során várható megbízhatóságát is. A robusztusságot a kifejlesztés szakaszában kell vizsgálni. A robusztusságvizsgálatnak igazolnia kell az analitikai eljárás megbízhatóságát a módszer paramétereinek szándékos változtatásaival szemben. A NAT esetében a módszer paramétereinek kismértékű ingadozása is döntő lehet. Mindazonáltal, a módszer robusztussága igazolható a kifejlesztés folyamán, ha a reagensek (pl. MgCl 2, primerek vagy dntp) koncentrációit kis mértékben változtatjuk. A robusztusság bizonyítására legalább 20, véletlenszerűen választott HCV-RNS-negatív
2.6.21. Nukleinsav-amplifikációs módszerek Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.8. - 8 plazmakeveréket kell vizsgálni, amelyeket az előzetesen meghatározott 95%-os cut-off érték háromszorosáig terjedő koncentrációban HCV-RNS-sel szennyeztünk, és a vizsgálat során pozitív eredményt kell kapni. A robusztussággal kapcsolatban olyan módszerek esetében is problémák adódhatnak, amikor még a vírus-rns kivonása előtt kezdeti ultracentrifugálásra van szükség. Az ilyen módszerek robusztusságának vizsgálatára legalább 20 olyan plazmakeveréket kell megvizsgálni, amelyek különböző mennyiségű HCV-RNS-t tartalmaznak, de a HCV-specifikus antitestek hiányoznak belőlük. A vizsgálatok során valamennyi plazmekeveréknek pozitív eredményt kell adnia. A keresztszennyeződések megelőzését olyan, 20 mintából álló sorozat pontos detektálásával kell igazolni, amely váltakozva tartalmaz negatív plazmakeverék-mintákat és olyan mintákat, amelyek HCV-vel erősen szennyezett (a 95 %-os cut-off értéknek legalább százszorosát vagy legalább 10 4 NE/ml-t tartalmazó) negatív plazmakeverékekből állnak. 5. MINŐSÉGBIZTOSÍTÁS Az olyan biológiai vizsgálatok esetében, mint a NAT, speciális problémák merülhetnek fel, amelyek mind a validálást, mind az eredmények értelmezését befolyásolhatják. A vizsgálati eljárásokat Szabványos műveleti eljárások (SOPs) 4 formájában részletesen le kell írni. Ezeknek tartalmazniuk kell: a mintavétel módját (a tartály típusa, stb.), a mini-plazmakeverékek készítését (adott esetben), az eltartás körülményeit, az analízist megelőzően, a vizsgálati körülmények (beleértve a vírus-rns keresztszennyeződésének vagy lebomlásának megakadályozására tett elővigyázatossági intézkedéseket), a reagensek és az alkalmazott referenciakészítmények pontos leírását, az alkalmazott készülék pontos leírását, az eredmények kiszámítására alkalmazott összefüggéseket, részletezve, a statisztikai értékeléssel együtt. A megfelelő futtatás-ellenőrzés (pl. megfelelő hígítású BRP hepatitisz-c vírus vagy WHO HCV 96/790 Nemzetközi Standardra beállított HCV-mintával mesterségesen szennyezett plazma alkalmazásával) kielégítő rendszeralkalmassági ellenőrzésnek tekinthető, és minden körülmények között biztosítja az analitikai eljárás megbízhatóságát. A technikai felszerelés kvalifikálása: a felhasznált berendezés minden lényeges részét megfelelő beüzemelési és működési kvalifikációs program szerint kell ellenőrizni. Lényeges eszköz (pl. termociklizáló) cseréje után ismét dokumentálni kell az analitikai eljárás teljesítőképességét, mégpedig az előzetesen meghatározott 95%-os cut-off érték háromszorosáig terjedő koncentrációban HCV-RNS-sel mesterségesen szennyezett plazmakeverékből vett 8 párhuzamos minta vizsgálatával. Valamennyi eredménynek pozitívnak kell lennie. A vizsgálatot végző személy kvalifikálása: a vizsgálat munkálataiba bevont valamennyi személynek megfelelő kvalifikációs programot kell teljesítenie. A sikeres képzés igazolására az 4 standard operating procedures
2.6.21. Nukleinsav-amplifikációs módszerek Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.8. - 9 előzetesen meghatározott 95%-os cut-off érték háromszorosáig terjedő koncentrációban HCV-RNS-sel mesterségesen szennyezett plazmakeverékből vett legalább 8 párhuzamos minta vizsgálatát kell végrehajtani. Ezt a vizsgálatot (a 8 párhuzamos mintáét) kétszer meg kell ismételni, két különböző napon, vagyis összesen 24 vizsgálatot kell végezni, három különböző napon. Valamennyi eredménynek pozitívnak kell lennie. A B19 vírus (B19V) DNS plazmakeverékekben történő mennyiségi meghatározására szolgáló nukleinsav-amplifikációs módszerek (NAT) validálása; útmutató 1. ALKALMAZÁSI TERÜLET Az Európai Gyógyszerkönyv megköveteli, hogy azokat a plazmakeverékeket, amelyeket bizonyos termékek gyártásához használnak fel, vizsgálni kell B19 vírus (B19V) DNS jelenlétére. A koncentráció a megfelelő határértéket nem lépheti túl. A követelménynek való megfelelést kvantitatív NAT alkalmazásával célszerű megállapítani. A kvantitatív NAT eljárás validálásának legfontosabb jellemzői a torzítatlanság, a pontosság, a specifikusság, a mennyiségi meghatározás alsó határa, a linearitás és a mérési tartomány. Ezen felül értékelni kell az analitikai eljárás robusztusságát is. Ez az útmutató a plazmakeverékek B19V-DNS-szennyezésének értékelésére szolgáló NAT analitikai eljárás validálási módszereit tartalmazza. A módszerek az ICH irányelvein alapulnak. Mindemellett az útmutató általánosságban véve is a kvantitatív NAT validálásának alapját képezheti. Jelen szövegben analitikai eljáráson a nukleinsav extrakciójától az amplifikált termékek kimutatásáig terjedő teljes folyamatot értjük. Ha az analitikai eljárás egy részéhez vagy egészéhez kereskedelmi forgalomban kapható készletet (kitet) használunk, a készlet gyártója által már elvégzett, dokumentált validációs vizsgálatokat nem kell elvégezni. Mindazonáltal, a készletnek az adott célra vonatkozó teljesítőképességét (pl. pontosság, torzítatlanság, mérési tartomány, robusztusság) a felhasználónak bizonyítania kell. 2. TORZÍTATLANSÁG A torzítatlanság azt fejezi ki, hogy a konvencionális alapon valódinak tekintett érték (vagy egy elfogadott referenciaérték) és a mért érték mennyire esik közel egymáshoz. Egy meghatározás torzítatlansága a kalibrációtól és a meghatározás egyes lépéseinek varianciájától függ. Bár a torzítatlanságot ajánlott az analitikai eljárás teljes mérési tartományra kiterjedően megállapítani, a legfontosabb a határérték-koncentráció körüli szűkebb tartomány torzítatlanságának értékelése. A plazmakeverékek B19V NAT vizsgálatának esetében ajánlatos a kalibrált meghatározás torzítatlanságát BRP NAT vizsgálatra szánt B19 vírus DNS vagy más, az aktuális WHO B19 DNS Nemzetközi Standardra beállított, Nemzetközi Egységekben kalibrált anyag legalább 5 különböző hígításának (hígítási faktor: 0,5 log) mérése alapján értékelni. A hígításoknak olyan tartományba kell esniük, amely a B19V-DNS-re jelenleg javasolt 10,0 NE/µl határértéket magában foglalja (pl. 10 5, 10 4,5, 10 4, 10 3,5 és 10 3 NE/ml). Valamennyi hígítás
2.6.21. Nukleinsav-amplifikációs módszerek Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.8. - 10 esetében 3 párhuzamos meghatározást végzünk. A torzítatlanságot az egyes koncentrációkban a mért érték és az elméleti B19V-DNS-mennyiség százalékos arányaként adjuk meg. A torzítatlanságnak összhangban kell lennie az adott meghatározásra alkalmazott módszer szintjével, amelyet (pl. több laboratóriumra kiterjedő vizsgálat esetén) szintén rögzíteni kell. 3. PONTOSSÁG A pontosság azt mutatja meg, hogy az ugyanazon homogén mintából származó többszörös mintavételen végzett méréssorozat eredményei mennyire esnek közel egymáshoz. A pontosságot három szinten értelmezzük: az ismételhetőség (meghatározáson belüli pontosság) az azonos működési körülmények mellett, rövid időtartamon belül végzett mérések pontosságát jelenti; megállapítása egy meghatározáson belül történik, úgy, hogy egy Nemzetközi Egységekben megfelelő módon kalibrált B19V-DNS-pozitív minta megfelelő, a vizsgálat teljes kvantitatív mérési tartományára kiterjedő hígításait 3-3 párhuzamos mintában mérjük; kiszámoljuk az egyedi mintákra vonatkozó variációs együtthatót (meghatározáson belüli variabilitás); a köztes pontosság (intermediate precision) a laboratóriumon belüli ingadozásra vonatkozik (meghatározások közötti pontosság); meghatározását úgy végezzük, hogy egy Nemzetközi Egységekben megfelelő módon kalibrált B19V-DNS-pozitív minta megfelelő, a vizsgálat teljes kvantitatív mérési tartományára kiterjedő hígításait több párhuzamos mérésben (amelyeket a meghatározásban rutinszerűen használunk), különböző körülmények között (például különböző napon, más analitikus, más eszközök, más reagensek) mérjük; kiszámoljuk az egyedi mintákra vonatkozó variációs együtthatót; a reprodukálhatóság (laboratóriumok közötti pontosság) a különböző laboratóriumok közötti pontosságot fejezi ki; meghatározása adott esetben a több laboratórium részvételével végzett kvantitatív B19V-DNS NAT körvizsgálatok során kapott eredmények összehasonlító elemzése segítségével történhet, pl. a Jártassági Vizsgálati Rendszer (PTS) keretein belül. 4. SPECIFIKUSSÁG A specifikusság a módszernek azt a képességét jelenti, hogy alkalmas a várhatóan jelen levő összetevők jelenlétében a nukleinsav egyértelmű meghatározására. A nukleinsav-amplifikációs analitikai eljárás specifikussága függ a primerek és a próbafragmens megválasztásától (a végtermék analízise esetében), valamint a vizsgálati körülmények szigorúságától (mind az amplifikációs, mind a kimutatási szakaszt illetően). A primerek és a próbafragmensek megtervezésekor a primerek és próbafragmensek kimutatásának specifikussága (ti. hogy a vizsgálattal csak a humán B19V-DNS-t mutatjuk ki) úgy igazolható, hogy a kiválasztott szekvenciákat adatbankokban közzétett szekvenciákkal hasonlítjuk össze. A B19V-vel nem rokon szekvenciákkal jelentős homológia ne legyen kimutatható. Az amplifikált terméket a számos módszer egyikével pl. beillesztett primerekkel végzett amplifikációval, restrikciós-enzim-analízissel, szekvenciaanalízissel vagy adott specifikus próbafragmenssel történő hibridizációval egyértelműen azonosítani kell.
2.6.21. Nukleinsav-amplifikációs módszerek Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.8. - 11 Az analitikai eljárás specifikusságának validálása érdekében legalább 20 B19V-DNS-negatív plazmakeveréket kell megvizsgálni, és inaktivitásukat kivétel nélkül igazolni kell. Parvovírus B19 genotípusok. A Nemzetközi Vírustaxonómiai Bizottság (ICTV) a humán B19 parvovírustörzs 3 genotípusának képviselőit osztályokba sorolta. Az 1-es genotípus a B19V prototípust jelenti, a 2-es genotípus az A6-hoz hasonló vírusszekvenciákat tartalmazza, míg a 3- as genotípusba a V9-szerű szekvenciák tartoznak. A primereket és a próbafragmenseket a nukleinsavszekvencia-adatbázisokon keresztül elérhető megfelelő B19V genotípus szekvenciájára történő illesztéssel úgy kell megtervezni, hogy biztosítsák a különböző humán parvovírus B19 genotípusok detektálásának és mennyiségi meghatározásának állandóságát. A választott megközelítés referenciaanyagok alkalmazásával ellenőrizhető. Mivel egyes genotípusok esetében nehezen szerezhető be biológiai referenciakészítmény, jellemzett célszekvencia-forrásként megfelelő plazmidkészítmények vagy szintetikus nukleinsavak is használhatók. Ezek az anyagok ugyanakkor nem használhatók az extrakciós folyamat validálására. 5. A MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁS ALSÓ HATÁRA A mennyiségi meghatározás alsó határa azt a legkisebb nukleinsav-mennyiséget jelenti, amelynek kvantitatív meghatározása megfelelő pontossággal és torzítatlansággal megvalósítható. A B19V NAT mennyiségi meghatározás alsó határának megállapítása az ismételhetőség és a köztes pontosság vizsgálata során, határhígításos módszerrel történik. Rögzítjük a célnukleinsavnak azt a legkisebb koncentrációját, amely még kellő pontossággal és torzítatlansággal meghatározható. 6. LINEARITÁS A linearitás a módszernek azt a képességét jelenti, hogy a nukleinsav-koncentrációval egyenesen arányos vizsgálati eredmények nyerhetők vele. A B19V NAT meghatározás linearitását az ismételhetőség és a köztes pontosság vizsgálata során értékeljük, úgy, hogy a mintának olyan hígításait vizsgáljuk több párhuzamos mérésben, amelyek a teljes mérési tartományra kiterjednek. Meghatározzuk a célnukleinsavnak azt a koncentrációtartományát, amelyen belül a mérési eredmények egyenesen arányosak az elméleti koncentrációval. 7. MÉRÉSI TARTOMÁNY Egy meghatározás mérési tartományán a mintának azt a nukleinsav-koncentráció intervallumát értjük, amelyen belül a módszer pontossága, torzítatlansága és linearitása bizonyítottan megfelelő. A B19V NAT meghatározás mérési tartományát az ismételhetőség és a köztes pontosság vizsgálata során, a minta hígításainak ismételt mérésével állapítjuk meg. Meghatározzuk azt a felső és alsó koncentrációhatár közé eső tartományt, amelyen belül a mérési eredmények torzítatlansága és pontossága elfogadható.
2.6.21. Nukleinsav-amplifikációs módszerek Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.8. - 12 8. ROBUSZTUSSÁG Egy analitikai eljárás robusztussága annak a mértéke, hogy a módszer paramétereinek kicsi, de szándékos változtatásai mennyire hatástalanok az eljárásra; a robusztusság egyben jelzi a módszernek a normális alkalmazás során várható megbízhatóságát is. A robusztusságot a kifejlesztés szakaszában kell vizsgálni. A robusztusságvizsgálatnak igazolnia kell az analitikai eljárás megbízhatóságát, a módszer paramétereinek szándékos változtatásaival szemben. A NAT esetében a módszer paramétereinek kismértékű ingadozása is döntő lehet. Mindazonáltal, a NAT robusztussága igazolható a kifejlesztés folyamán, ha a reagensek (pl. MgCl 2, primerek vagy dntp) koncentrációit kis mértékben változtatjuk. A robusztusság bizonyítására legalább 20 B19V-DNS-negatív plazmakeveréket, amelyekhez a határérték-koncentrációnak megfelelő mennyiségű B19V-DNS-t adtunk, kell vizsgálni és ezekben elfogadható mennyiségi értéket kell kapni. A keresztszennyeződések megelőzését olyan, legalább 20 mintából álló sorozat pontos detektálásával kell igazolni, amely váltakozva tartalmaz negatív (vagy B19V-DNS-t a határérték-koncentrációnál kisebb mennyiségben tartalmazó) plazmakeverék-mintákat (10 minta) és olyan plazmakeverékeket, amelyek nagy (a határérték százszorosának megfelelő) mennyiségben tartalmaznak B19V-DNS-t (10 minta). 9. MINŐSÉGBIZTOSÍTÁS Az olyan biológiai vizsgálatok esetében, mint a NAT, speciális problémák merülhetnek fel, amelyek mind a validálást, mind az eredmények értelmezését befolyásolhatják. A vizsgálati eljárásokat Szabványos műveleti eljárások (SOPs) formájában részletesen le kell írni. Ezeknek tartalmazniuk kell: a mintavétel módját (a tartály típusa, stb.), a mini-plazmakeverékek készítését (adott esetben), az eltartás körülményeit, az analízist megelőzően, a vizsgálati körülmények (beleértve a vírusnukleinsav keresztszennyeződésének vagy lebomlásának megakadályozására tett elővigyázatossági intézkedéseket), a reagensek és az alkalmazott referenciakészítmények pontos leírását, az alkalmazott készülék pontos leírását, az eredmények kiszámítására alkalmazott összefüggéseket, részletezve, a statisztikai értékeléssel együtt. Egy megfelelő határérték-ellenőrző vizsgálat beiktatása (például Nemzetközi Egységekben kalibrált B19V-DNS-t mint amilyen a BRP NAT vizsgálatra szánt B19 vírus DNS tartalmazó plazma) kielégítő rendszeralkalmassági ellenőrzésnek tekinthető, és bármilyen felhasználási körülmények között biztosítja az analitikai eljárás megbízhatóságát. A technikai felszerelés kvalifikálása. A felhasznált berendezés minden lényeges részét megfelelő beüzemelési és működési kvalifikációs program szerint kell ellenőrizni. Lényeges eszköz (például termociklizáló) cseréje után ismét dokumentálni kell az analitikai eljárás teljesítőképességét, 8 olyan párhuzamos plazmakeverék minta vizsgálatával, amelyek a B19V-
2.6.21. Nukleinsav-amplifikációs módszerek Ph.Hg.VIII. Ph.Eur.6.8. - 13 DNS-t a határérték-koncentráció körüli mennyiségben tartalmazzák. Valamennyi eredménynek elfogadhatónak kell lennie, és a meghatározásnak a validálás során tapasztalt jellemzőit kell tükröznie. A vizsgálatot végző személy kvalifikálása. A vizsgálat munkálataiba bevont minden egyes személynek megfelelő kvalifikációs programot kell teljesítenie. A sikeres képzés igazolására, a vizsgálatot végző személyeknek 8 olyan párhuzamos plazmakeverék minta vizsgálatát kell elvégezniük 3 különböző napon (ez összesen 24 mintát jelent), amelyek a B19V-DNS-t a határérték-koncentráció körüli mennyiségben tartalmazzák. Valamennyi eredménynek elfogadhatónak kell lennie, és a meghatározásnak a validálás során tapasztalt jellemzőit kell tükröznie.