Poli(ADP-ribóz) polimeráz (PARP) szerepe a bőr ultribolya (UV) fény indukálta károsodásában

Átírás

1 1 Doktori (Ph.D.) értekezés Poli(ADP-ribóz) polimeráz (PARP) szerepe a bőr ultribolya (UV) fény indukálta károsodásában Dr. Csete Béla Interdiszciplinális doktori iskola vezető: Dr. Sümegi Balázs, egyetemi tanár Alprogramvezető: Dr. Farkas Beatrix, egyetemi tanár Dr. Battyáni Zita, egyetemi docens Pécsi Tudományegyetem 2009.

2 2 Tartalomjegyzék Bevezetés 2. Célkitűzések 10. I. Anyag és módszer 12. I/1. Állatkísérletek 12. I/2. Klinikai tünetek értékelése 24. II. Eredmények 30. III. Összefoglalás 45. III/1. Témában elért új eredmények 46. Irodalomjegyzék 56. Rövidítések jegyzéke 66. Köszönetnyilvánítás 67. A szerző közleményeinek jegyzéke 68. A szerző kongresszusi előadásainak jegyzéke 70. Táblázatok és Ábrák 72.

3 3 Bevezetés A bőr multifunkcionális interface a külvilág és a szervezet között. A környezeti tényezők (légköri szennyeződés, inszoláció fokozódása, az ózonlyuk növekedése, stb.), valamint az életmódbeli szokások (nyári, téli üdülés, hétvégi szabadtéri tevékenység, mesterséges ultraibolya (UV) besugárzás rendszeres igénybevétele, stb.) radikális változása az UV-fény okozta bőrkárosodás pontos patomechanizmusának megismerését, valamint ezáltal a folyamat megelőzésére és kezelésére szolgáló eljárások kidolgozását világszerte a bőrgyógyászat egyik vezető kutatási területévé tette. Az UV fény három különböző tartományra osztható. Így az UVA nm (ezen belűl UVAI: nm, UVAII: nm), az UVB: nm és az UVC: nm formájában lett meghatározva (Diffey 2002). Ismert, hogy az UV-sugarak hullámhossz-dependens módon penetrálnak a bőrbe, vagyis a hullámhossz növekedésével a behatolás mélysége nő. A rövidebb hullámhosszú UVB-sugárzás főleg az epidermiszben abszorbeálódik, és ott dominálóan a keratinocitákkal lép interakcióba. A hosszabb hullámhosszú UVA-tartomány a mélybe penetrál, és az epidermisz mellett érinti a dermális sejtek funkcióját is (Höningsmann 2002). Az UVA- és UVB-tartomány káros hatása additív jellegű és kumulálódik (Lim és mtsai. 2001, Kurtmann 2001) (1.ábra). Annak ellenére, hogy a Földet érő elektromágneses hullámból az UVAtartomány aránya lényegesen magasabb (95%), mint az UVB-é, a biológiailag káros hatások kiváltását dominálóan az UV-fény UVB-

4 4 tartományával hozzák összefüggésbe (Elmets és mtsai. 2001, Cole 2001, Lim és mtsai. 2001). Az UV-fény legtöbb, bőrben jelentkező kóros biológiai hatásának fő molekuláris targetje a DNS. Az epidermisz számos kromoforral (nukleinsavak, urokainsav, aromás aminosavak, melanin prekurzorok, stb.) rendelkezik, melyek a fény UV-tartományát elnyelik, és fotokémiai reakción keresztül a bőr biológiai károsodását idézhetik elő (Hönigsmann 2002). Az UV-fény direkt DNS-károsító hatása során dominálóan ciklobután-pirimidindimerek (CPD), valamint pirimidin (6-4) pirimidon fotoproduktumok képződnek (Freeman és mtsai. 1989, Hemminki és mtsai. 2001). A direkt DNS-károsodás kiváltásában az UVB- és a rövid UVA- (UVA-II) tartománynak van szerepe (Young és mtsai. 1998) A fény UVA-I tartománya főleg indirekt módon, ROS indukció által fejti ki hatását, mely a DNS oxidációja mellett, a lipid-peroxidációban, a fehérjék oxidációjában, a transzkripciós faktorok aktivációjában, DNS-törések előidézésében nyilvánul meg (Krutmann és mtsai. 1997). A fény UVB-tartománya szintén képes ROS képződést indukálni, direkt hatása mégis a DNS-fototermékek (timindimerek), egyesláncú DNS-törések képződésén, a DNS-repair enzimek aktivációján keresztül jelentősebb (Katiyar és mtsai. 2000, Berton és mtsai. 1997, Krutmann 2001, Mitchell és mtsai. 2001). Az epidermisz sejtjeiben bekövetkező DNS-károsodás mértéke jól követhető az akut UV-fény stressz hatására létre jött apoptótikus keratinocyták ( sunburn sejtek ) kvantitatív meghatározásával (Ziegler és mtsai. 1994). Az UV-sugárzás direkt és indirekt DNS-t károsító hatása a bőrben gyulladás, fototoxikus reakció, immunszupresszió, photoaging, fotokarcinogenezis és

5 5 számos egyéb elváltozás formájában nyilvánul meg (Krutmann 2001, Kulms és mtsa. 2000, Yarosh és mtsai. 2001, Maccarrone és mtsai. 1997, Steenvoorden és mtsai. 1997) (2. Ábra). Általában az UV-sugárzás akut tüneteinek kiváltásáért, amely dominálóan az epidermális keratinocitákra kifejtett különböző mértékű citotoxikus károsodás következménye, a fény UVB-tartományát teszik felelőssé (Elmets és mtsai. 2001, Lim és mtsai. 2001). A napégés, számos jelátviteli útvonalon keresztül, önmaga elégséges lehet az évekkel, évtizedekkel később manifesztálódó melanoma és nemmelanoma bőrtumorok (carcinoma spinocellulare, carcinoma basocellulare) indukciójához. A krónikus fénykárosodás, vagy photoaging kiváltásában az UV-fény mindkét tartományának szerepe van, hiszen hatásuk additív, mégis az UVA jelentőségét emelik ki. Az UV-fény okozta öregedés ( photoaging ) és fotokarcinogenezis (melanoma malignum, carcinoma basocellulare illetve spinocellulare) legkifejezettebben az I-II bőrtípusú (fehér, érzékeny bőr) kaukázusiaknál jelentkezik (Young és mtsai. 1996, Katiyar és mtsai. 2000, Kraemer 1997, Farkas és mtsai. 2002). Az életkor meghosszabbodása, valamint a természetes (napfény) és a mesterséges (pl. szolárium) UV-expozíció növekedése által kiváltott fénykárosodás világszerte a jó- és rosszindulatú bőrtumorok előfordulási gyakoriságának progresszív emelkedéséhez vezetett A malignus bőrtumorok incidenciája az utóbbi 30 évben hazánkban is drámaian emelkedett, s ez a tendencia jelenleg is folytatódik. Míg az epidermális eredetű laphám carcinoma és a basocelluláris carcinoma patogenézisében a krónikus (élet során összeadódó) napfény expozíciónak, addig malignus melanoma

6 6 esetében inkább az ismétlődő, rövid expozíciós idejű, intenzív napégéseknek lehet szerepe. Fenti tényezők miatt a fényvédő készítmények iránti követelmények megnőttek. A teljes spektrumú védelem (UVA, UVB) alkalmazása feltétlenül indokolttá vált (Lim és mtsai. 2001). A jelenleg meglévő, és a fényvédők használatát sok esetben akadályozó mellékhatások (fototoxikus, fotoallergiás reakció, színező hatás, nem megfelelő konzisztencia, stabilitási problémák) kiküszöbölése fontos feladat (Lim és mtsai. 2001). A kutatás az eddigiektől merőben eltérő, új típusú fényvédő készítmények (pl.: a DNS-repair kapacitást támogató T4V (T4N5) liposzómális endonukleáz, az IL-12, PARPgátlók) előállítása irányába folyik (Yarosh és mtsai. 2001, Schwartz és mtsai 2002, Farkas és mtsai. 2002). A cél a megelőzés és a hatékony védelem által a bőrtumor-incidencia növekedésének megállítása (Lim és mtsai 2001). A rendelkezésünkre álló új molekulákkal munkánk célja elsősorban az akut és krónikus UV-fény okozta károsodás kialakulásának megelőzésében szerepet játszó szabályzó mechanizmusok vizsgálata, valamint a bőr védelmét elősegítő illetve károsító folyamatok farmakológiai befolyásolhatóságának tanulmányozása volt. A bonyolult védelmi funkció érvényesüléséhez az alapvető celluláris folyamatokat (proliferáció, differenciálódás, túlélés, apoptózis) szabályozó, számos jelátviteli rendszer korrekt működése szükséges. Jelen munkában a nagyszámú jelátviteli folyamatból, melyek az UV-fény indukálta bőrelváltozások kialakulásában részt vesznek a poli(adp-ribóz) polimeráz (PARP) enzim aktivitás és annak szabályozásával összefüggő mechanizmusokat kívántam vizsgálni.

7 7 A poli(adp-ribóz) polimeráz az eukarióta sejtekben (kivéve az élesztősejteket) nagy mennyiségben (körülbelül 10 6 molekula/sejt) jelenlevő nukleáris, 116 kd molekulasúlyú enzim, amely meglehetősen hosszú féléletidejű fehérje. A PARP három fő doménból áll: az N-terminális DNSkötő domén (DBD), az automodifikációs domén (AMD) és a C-terminális katalitikus domén. A DBD-n belül két cink-ujj felelős a DNS kötésért és néhány fehérje-fehérje kölcsönhatásért. A DBD ezen kívül tartalmaz egy nukleáris lokalizációs szignál (NLS) régiót, amelyen belül a kaszpáz hasító hely (DEVD) is található. Az automodifikációs domén tartalmaz egy BRCT (breast cancer susceptibility protein C terminus) szakaszt, amely számos DNS repair és sejtciklus fehérjében közös. A PARP a különböző fehérjefehérje kölcsönhatásokban a BRCT szakaszon keresztül vesz részt. Az enzim C-terminális részén található aktív hely, az eukariótákban rendkívül konzervált, 50 aminosavból álló szekvencia úgy is ismert, mint PARP névjegy (Virág és mtsa. 2002). Amennyiben a sejtet különböző behatások (pl.: alkiláló szerek, ionizáló sugárzás, UV-sugárzás vagy szabadgyökök, stb) károsítják, a PARP gyorsan odakötődik a DNS lánctörések helyére, automodifikáción megy keresztül, amely a célfehérjén (leggyakrabban magán az enzimen) hosszú, elágazó láncú poli(adp-ribóz) polimerek képződéséhez vezet. A folyamathoz NAD + használódik fel szubsztrátként, amely végeredményben az intracelluláris NAD + deplécióját okozza (Lindahl és mtsai. 1995, Burkle 2001, Virág és mtsa. 2002). A képződő negatív töltésű PARP azután leválik a DNSvégekről, elősegítve a DNS-repair folyamatát (Lindahl és mtsai. 1995). A poli(adp-ribóz) in vivo rövid életű, mert a poli(adp-ribóz) glükohidroláz

8 8 (PARG) gyorsan (2-5 perccel a polimer képződése után) lebontja (Bernardi és mtsai. 1997). A PARP-nak ez az oda-vissza kötődése a DNS lánctörés helyén annak a hipotézisnek a megszületéséhez vezetett, hogy a PARP és a poli-adp-riboziláció különböző, kromatinhoz kötött működésekben is szerepet játszik (de Murcia és mtsai. 1997, Kanai és mtsai. 2000). A PARP automodifikációja megváltoztatja az enzim affinitását a DNS lánctörésekhez, valamint azt a képességét, hogy más, a DNS-repair-ben részt vevő fehérjékkel versenyezzen (Lindahl és mtsai. 1995, D Amours és mtsai. 1999). A PARP különböző biológiai folyamatokban játszott lehetséges funkciójába azok az in vitro kísérletek nyújtottak sokoldalú betekintést, amelyekben NAD + analógokat alkalmaztak a poli-adp-riboziláció gátlására (például: nikotinamid, benzamid és származékai). A tanulmányok szerint a kémiai gátlószerek hatékonyan képesek megakadályozni a NAD + deplécióját, és túlérzékennyé tenni a sejteket a DNS-károsító szerekre, valószínűleg a károsodott DNS kijavítását késleltetve (D Amours és mtsai. 1999, Shall 1995). Ezek az anyagok valóban gátolják a PARP aktivitást, ugyanakkor a normális sejtmetabolizmust is befolyásolják más NAD + -dependens folyamatokat érintve (Milam és mtsai. 1984). Annak ellenére, hogy az elmúlt évtizedben számos szervvel és szövettel (szív, vázizom, központi idegrendszer, vese, bél, izület, szem, stb.) kapcsolatos vizsgálatok történtek a PARP szerepére vonatkozóan(zhang 2002, Virág és mtsa. 2002, Szabados és mtsai ). A bőr az ilyen irányú kutatásokból gyakorlatilag kimaradt. A PARP aktivációnak a bőrelváltozások patomechanizmusában betöltött jelentőségével kapcsolatban csak nagyon szórványos adatok találhatók az irodalomban, a PARP aktiváció bőrben

9 9 történő szabályozásával (PARP-gátlók hatása) kapcsolatos vizsgálatokra vonatkozó keresésünk pedig eredménytelenül zárult. A PARP bőrben betöltött szerepére vonatkozó eddigi ismereteinket a következőkben tudjuk összefoglalni. Keratinocitákon végzett vizsgálatokkal mutatták ki, hogy a peroxinitrit és a hidrogén-peroxid a HaCaT sejtekben PARP aktivációt idéz elő, amely hozzájárul a peroxinitrit által okozott citotoxicitáshoz (Szabó C. és mtsai. 1998), ill. Hinshaw és mtsai. a kén-mustárral (DNS károsító szer) kiváltott fokozott PARP-szintézisről számoltak be (Hinshaw és mtsai. 1999). Később, in vivo oxazolonnal előidézett kontakt dermatitisz kapcsán (Szabó E. és mtsai. 2001), ill. egérbőr mustárolajjal történő kezelése során (Virág és mtsai. 2002) észleltek PARP aktivációt. Virág és mtsai. az epidermisz bazális rétegében, immunhisztokémiai vizsgálattal, monoklonális poli-adp-ribóz ellenes antitestet használva észleltek kifejezett keratinocita festődést. Ugyanezen kísérlet során, a mustárolajjal kezelt bőrben, poliklonális antinitrotirozin antitestet használva, az epidermális és dermális sejtekben jelentős nitrotirozin képződést figyeltek meg, mely alapján feltételezték a peroxinitrit jelenlétét Vizsgálataik alapján arra következtettek, hogy a PARP aktiváció egyik mechanizmusa a PARP direkt aktivációja lehet az alkilált DNS által, valamint az intracutan peroxinitrit képződés is hozzájárulhat az enzim aktivációjához (Virág és mtsai. 2002). Annak ellenére, hogy az UV-fény DNS-károsító hatása (Hemminki és mtsai. 2001, Freeman és mtsai. 1989), valamint a PARP DNS-lánctörésre történő aktivációja (Benjamin és mtsai. 1980, Satoh és mtsa. 1992, Lindahl és mtsai. 1995) jól ismert, az UV-besugárzást követően a PARP bőrben betöltött szerepére vonatkozóan ismereteink hiányosak. Ezért érdemesnek látszott,

10 10 hogy kutatásom egyik legfontosabb céljává tenni az UV-expozíciót követő PARP-aktiválás kimutatását, valamint azt, hogy direkt bizonyítékokat szolgáltassak a PARP-gátlás vagy reguláció protektív hatására.

11 11 Célkitűzések Munkánk célja a bőr különböző környezeti stresszhatásokkal szembeni, illetve a már kialakult kóros állapotok helyreállításában részt vevő poli(adpribóz) polimeráz (PARP) enzim szerepének és farmakológiai befolyásolhatóságának tanulmányozása volt. A környezeti stresszhatások közül érdeklődésünk középpontjába a fény ultraibolya (UV) tartománya került. Ismert, hogy az élet során elszenvedett fénykárosodás kumulálódik. A civilizált világban az életkor meghosszabbodásával a természetes (napfény) és mesterséges (pl. szolárium) UV-expozíció által kiváltott fénykárosodás mértéke jelentősen nő. A fentiek következtében, az UV-fény okozta jó- és rosszindulatú (melanoma, és nem-melanoma típusú) bőrtumorok előfordulási gyakoriságának progresszív növekedése már jelenleg is világszerte megoldandó problémát jelent. Az új molekulák (immunstimulánsok, DNS-protektív anyagok, stb.) előállításával és alkalmazásával várható a hatékonyabb prevenciós lehetőségek számának növekedése illetve a kóros állapotok jelenleginél korszerűbb diagnosztikus és terápiás megoldása. A rendelkezésünkre álló új molekulákkal célunk elsősorban az akut és krónikus UV-fény károsodás kialakulásának megelőzésében szerepet játszó szabályzó mechanizmusok vizsgálata, valamint a bőr védelmét elősegítő, protektív, illetve károsító folyamatok farmakológiai befolyásolhatóságának tanulmányozása volt. A megvalósításhoz egyszerű, ugyanakkor jól reprodukálható modelleket próbáltunk használni, amelyek mind sejtszinten, mind pedig a bőr, mint szerv

12 12 szintjén biztosítják a fiziológiás és patológiás történések vizsgálhatóságát, és magukban foglalják a gyakorló klinikus számára az alkalmazás potenciális lehetőségét. A fentiek alapján tanulmányozni kívántuk: 1. PARP-regulátor/inhibitor általi szabályzás vizsgálata a bőr akut és Krónikus UV-irradiáció elleni védelmében A poli-adp-riboziláció jelentősége a bőr UV-fény indukálta károsodásában PARP aktivitás in vitro és in vivo vizsgálata PARP-regulátor/inhibítor antieritematogén, DNS-protektív, immunoprotektív hatásának vizsgálata 2. PARP-regulátor/inhibítor szerepe az UVA- és UVB-fény indukálta karcinogenezis elleni védelemben

13 13 I. Anyag és módszer A vizsgálatok végzéséhez PTE ÁOK Régionális Etikai Bizottsága engedélyével, valamint beteg információs és beleegyező nyilatkozattal rendelkeztünk. I./1. Állatkísérletek A kísérleteket az European Community guiding principles for the care and use of laboratory animals szabályai szerint, állatetikai engedély birtokában végeztük. Egy-egy kísérleti sorozatban az állatok életkor és súly szerint lényeges eltérést nem mutattak. I./1.1. Akut és krónikus fénykárosodás vizsgálata hairless egérmodellen A lokálisan alkalmazott PARP-regulátor (különböző koncentrációban BGP- 15M hatóanyagot tartalmazó krém) dermatológiai hatásának vizsgálatához (akut és krónikus UV-fény expozíciós kísérletek) hairless CRL:hr/hr BR Hr1, (Charles River Ltd., Németország) szőrtelen egereket használtunk (3. Ábra). Az általunk használt egerek lényeges tulajdonsága, hogy immunkompetensek, spontán malignus tumor képződésre nem hajlamosak, és jóindulatú papillómák is csak nagyon idős korban jelentkeznek az állatokon (Sundberg 1994). Az egerek hátán az epidermisz vastagsága megközelítőleg 30 µm (két sejtsoros), az epidermális sejtek turnover ideje 1-2 hét. A szőrtelensége miatt kifejezett UV-abszorpciót mutató epidermisz alkalmassá teszi ezt az egértípust az UV-fény hatásának (pl. az akut, vagy a krónikus fénykárosodás, fotokarcinogenezis, stb.) modellezésére (De Gruijl

14 14 és mtsa. 1995). Kísérleteinkhez 5-8 hetes, g súlyú, nőstény egereket használtunk. Az állatokat kórokozó mentes környezetben, 12 órás periódikus (sötét/világos) megvilágítás alkalmazásával, C-on, 50-70% páratartalom mellett, általánosan használt egértápon és csapvíz itatással tartottuk. Az állatok egyéni identifikálása a fülön történő jelöléssel, a ketreceké pedig kártyával történt. I./1.2. Lokális kezeléshez alkalmazott készítmények BGP-15M (PARP-regulátor) az O-(2-hidroxi-3-piperidino-propil) piridin-3- karboxil sav amidoxim monohidroklorid sója. A molekula, amelyet lokális alkalmazásra állítottak elő, az orális, szisztémás alkalmazásra szánt dihidroklorid sóval szemben a BGP-15M jelölést kapta (előállító: N-GENE Res. Lab., New York). A lokális készítményre vonatkozó adatokat az előállító bocsátotta rendelkezésünkre. Vizes oldata enyhén savas kémhatású (ph 5,6). Por formában fehér, nem higroszkópos kristályos anyag. Vízben oldódik. A BGP-15M két enantiomert (+ és -) tartalmaz, a molekula chilaris centruma mentén. A BGP-15M jelölés egyben a racem keverékre utal. A kísérletekhez előállított krém 5-20% koncentrációban tartalmazott BGP-15Mt. Az elvégzett stabilitási (fotostabilitási) vizsgálatok alapján a BGP-15M a krémben stabilnak bizonyult. A preklinikai biztonsági vizsgálatok (toxikológia, mutagenitás, farmakológia, farmakokinetika) dominálóan orális adást követően, bizonyos esetekben dermális kezeléshez társulva (pl. akut dermális toxicitás egérben, szőrtelen egérben, akut dermális irritáció nyúlban, szubakut (28 napos) dermális toxicitás két hetes követéssel patkányban)

15 15 történt. Az ismertetett adatok alapján a krém formula a biztonsági vizsgálatok során lokális (eritéma, ödéma), és szisztémás (letalitás, belszervi makroszkópos és mikroszkópos eltérések, testsúly csökkenés) kóros elváltozásokat nem okozott. BGP-15M lokális készítmény vivőanyaga olaj a vízben (O/V) típusú, kis zsírtartalmú kenőcs (desztillált víz, glicerin, sztearin, cetil-sztearil-alkohol, fehér vazelin, folyékony paraffin, lecitin, polietilénglikol-cetilsztearil éter (etoxiszáma 6) polietilénglikol-cetilsztearil éter (etoxiszáma 25) (Ph.Hg.VII. szerinti magyar névvel feltüntetve). Az AS jelzésű készítményt kísérleteinkben kontrollként használtuk. A kereskedelmi forgalomban kapható, Mexoryl SX komponense által az UVA tartományban is hatékony, fotostabil fényszűrőt tartalmazó, SPF (Sun Protection Factor) 30 és anti UVA/UVB jelzésű (széles spektrumú, a fény UVB és UVA tartományát lefedő), korszerű fényvédőt választottuk ki referencia készítményként, és jelöltük AS -sel. A kontroll készítmény összetétele a következő: desztillált víz, octocrilen, ciclopentasiloxan, titándioxid, glicerin, propilénglikol, izohexadekán, sztearin, butilmetoxidibenzoilmetán, oktil-palmitát, sztearil-heptanoát, PVP/eikozén kopolimer, nátrium-cetil-foszfát, jojoba, tokoferol-acetát, metilcellulóz propilénglikol éter, fenoxietilalkohol, sztearil-kaprilát, polietilénglikol sztearinsav észtere (100 etilénoxid csop.), etil-p-hidroxi benzoát, trietanolamin, dimethikonol, szilikon olaj, propil-p-hidroxi benzoát, tereftalidén-dikámfor-szulfon sav, akrilátok/c10-30 alkil-akrilát krosszpolimer, dinátrium-edta, butirospermum parkii, cetil-alkohol, metil-p-hidroxi benzoát,

16 16 butil-p-hidroxi benzoát, alumínium-hidroxid, glicerilmonosztearát, parfüm (C9794/1). (Ph.Hg.VII. szerinti magyar névvel feltüntetve). A szőrtelen egerek törzsén kialakított egy, vagy több tesztterületet BGP-15M tartalmú krémmel (hatóanyag tartalom: 5%, 10%, 15%, 20% BGP-15M), illetve hatóanyagmentes vivőanyagával (vehikulum), vagy az AS -sel jelölt készítménnyel, 2 mg/ testfelszín cm 2 krém egyenletes felvitelével kezeltük. Az UV-fény akut károsító hatásának vizsgálata során az állatokat az UV-fény expozíció előtt 15 perccel, egyszeri kezelésben részesítettük. Az UVbesugárzás krónikus hatásának tanulmányozására végzett kísérletekben az egerek tesztterületeit heti 5 alkalommal, egymást követő napokon, az UVirradiáció előtt 15 perccel, azonos időben és módon kezeltük. I./1.3. Szőrtelen egerek UV-fény kezelése Az UV-irradiáció kivitelezéséhez mesterséges (UVB- és UVA-tartományban sugárzó) és természetes fényforrást (Nap) használtunk. Az UVBexpozícióhoz a széles spektrumú UV21 Philips lámpát (13 cső, csőtípus: F 85/100 W, emissziós spektrum: nm, peak: nm, Waldmann Medizintechnik, Villingen-Schwenningen) alkalmaztunk UVB-sugárzóként. Az UVA-irradiációt Waldmann UV 8001K széles spektrumú UVA-készülékkel (csőtípus: WF 85/100 W, emissziós spektrum: nm, peak: 365 nm, Waldmann Medizintechnik, Németország) végeztük. A sugárzás méréséhez IL 700 spektroradiométert (koszinusz korrekciós SEE detektorral) használtunk.

17 17 A természetes fénnyel, a napfénnyel végzett UV-expozíció paramétereinek meghatározása a beeső teljes fotonszám mérése alapján Brewer MK3 Spektrofotometerrel és Brewer szoftverrel (Sci-Tec, USA) történt. (A mérések végzéséért ezúttal szeretnénk köszönetet mondani Tóth Zoltánnak, Országos Meterológiai Szolgálat Légkörfizikai Intézet, Budapest.) Az aktuális maximális irradianciát és a biológiailag effektív intenzitásokat a fény UVBtartományának nm hullámhosszúságú, valamint az UVA-tartomány nm hullámhosszúságú részére adtuk meg. Hazánkban, a fény UVBtartományában az irradiancia maximális értéke: 1,2-1,3 J/cm 2 /h, az UVAtartományában pedig: 8,5-8,6 J/cm 2 /h. A vizsgálat időpontjában a fény UVB-tartományában ( nm-re integrálva) az irradiancia maximális értéke: 1,08 J/cm 2 /h volt. A vizsgálat időpontjában a fény UVA-tartományában ( nm-re integrálva) az irradiancia maximális értéke: 8,3 J/cm 2 /h-nak bizonyult. Ez az érték nm tartományban 13 J/cm 2 /h. A biológiailag effektív intenzitások: UVB ( nm): 0,07 J/cm 2, UVA ( nm): 0,015 J/cm 2. A számítások végzéséért szeretnénk köszönetet mondani Erostyák Jánosnak (PTE Kísérleti Fizikai Tanszék, Pécs). Az állatokat a besugárzáshoz a mesterséges UV-fényforrástól 30 cm-re helyeztük el. A bőrfelszínen mért sugárzás intenzitás alapján határoztuk meg az egyes kísérlet során a sugárzó által leadandó dózist. (A sugárzó és a spektroradiométer kalibrálása, az előírás szerinti rendszeres időszakonként, a szakszerviz által történt.) Minden egyes kísérlet előtt meghatároztuk a minimális eritéma dózist (MED), amelyet mj/cm 2, illetve J/cm 2 -ben adtunk meg.

18 18 A szoláris UV-fény kezeléshez az állatokat speciális egérlapon rögzítettük, amely biztosította a tesztterület standard kezelését és a környező bőr biztonságos takarásának megoldását. Az UVA-besugárzás, valamint a szoláris expozíció esetén az állatokat a hőhatástól alulról, átfolyásos vízhűtéssel működő rendszerrel védtük. Az UVA-fénnyel, a krónikus fénykárosodás megítélésére (pl.: fotokarcinogenezis tanulmányozásához) végzett kísérletek során, a besugárzási idő csökkentése céljából forszírozott UVA -kezelést, vagyis pszorálen (8-metoxi-psoralen (8-MOP), Geroxalen oldattal fényérzékenyített tesztterületeket sugaraztunk be (Lowe és mtsai. 1987). A 8-MOP oldattal történt ecsetelés és az UVA-irradiáció között 30 perc telt el. A napfény expozíciót felhőmentes nyári napon óra között végeztük. Az előkísérletek során határoztuk meg mindazon feltételeket, amelyek az állatok számára az általunk megítélt legkíméletesebb eljárást biztosították. I./1.4. A minimális eritéma dózis (MED) meghatározása szőrtelen egereken A minimális eritéma dózis (MED) alatt azt az UVB-fény által közvetített energiamennyiséget értjük, amely a bőr minimális eritémás reakciójának előidézéséhez szükséges (Lowe 1990). A MED meghatározásához az egerek fedetlen bőrén kialakított 6 db, egyenként 0,25 cm 2 területű tesztterületet emelkedő dózisú (0,12 J/cm 2 -től induló) UVB-fénnyel sugaraztuk be. A MED leolvasása 24 órával az UVB-besugárzást követően,

19 19 ugyanazon személy által történt (az interperszonális eltérések elkerülése céljából). I./1.5. UVB-expozíció akut hatásának vizsgálata PARP-regulátorral kezelt egérbőrön Az egerek hátán (thoracalis régió), a reakciómentes, ép bőrön, 2 x 1,44 cm 2 - es nagyságú, egymás alatt elhelyezkedő (egymástól legalább 0,8 cm távolságra levő), tesztterületet alakítottunk ki, és használtunk a kísérletekben (antieritematogén koncentráció meghatározásra, fényvédő hatás összehasonlító vizsgálatára UVB-tartományban, stb.) - az állatok számát az egyes kísérleteknél tüntettük fel. Az egerek kezeléséhez a PARP-regulátor BGP-15M tartalmú krémet (hatóanyagtartalom: 5%, 10%, 15% és 20%) alkalmaztuk, illetve vivőanyagát használtuk. Az egerek krémmel történő előkezelését 1.2. pontban leírtak szerint végeztük. Ezt követően az állatokat egyszeri, eritémát okozó UVB-irradiációban részesítettük. Az alkalmazott MED dózisának meghatározása 24 órával a kísérlet előtt 3 állaton történt. A környező bőrfelszíneket az UV-behatástól takarással védtük. A negatív kontroll csoportot a krémmel nem kezelt, UV-expozícióban nem részesült állatok képezték. Az irritatív hatás vizsgálatára 20% BGP-15M tartalmú krémmel kezelt, UV-expozícióban nem részesült állatok csoportja szolgált. Az UVB-irradiáció után közvetlenül, a BGP-15M krémet, illetve vivőanyagát az állatok bőréről eltávolítottuk. A vizsgálatokat az egerek I.-VI. csoportjával (jelölés: /1= felső, /2= alsó tesztterület) végeztük, melyek a következő kezelésben részesültek: I.: I./1.:

20 20 vivőanyag + UVB, I./2: 5% BGP-15M + UVB; II.: II./1.: vivőanyag + UVB, II./2: 10% BGP-15M + UVB; III.: III./1.: vivőanyag + UVB, III./2: 15% BGP-15M + UVB; IV.: IV./1.: vivőanyag + UVB, IV./2: 20% BGP-15M + UVB; V.: 20% BGP-15M; VI.: kezeletlen, negatív kontroll. A tesztterületek elrendezésével biztosítani kívántuk az esetleges individuális különbségekből adódó eltérések minimálisra csökkentését. A lokálisan alkalmazott PARP-regulátor hatásának vizsgálatához a bőrmintákat az UVB-besugárzás után közvetlenül, vagy 24 óra elteltével excízióval nyertük. Az állatokat cervicalis dislocatioval pusztítottuk el. I./1.6. Egérbőr kezelése a PARP-regulátor és ismert fényvédő faktorú készítmény antieritematogén hatásának összehasonlító vizsgálatához A BGP-15M antieritematogén hatását a forgalomban kapható, széles spektrumú (UVA és UVB tartományban ható), általunk AS -sel jelölt, fényvédő készítménnyel hasonlítottuk össze. Az egerek háti felszínén kialakított 1,44 cm 2 -es tesztterületek közül a proximálisat AS jelzésű krémmel, a disztálisat pedig 10%, 15%, vagy 20% BGP-15M tartalmú krémmel kezeltük az egymáshoz viszonyított antieritematogén hatás megítéléséhez. Az egyes készítmények, kísérleti körülményeink között, az eritéma kialakulására kifejtett gátló hatásának meghatározásához a proximális tesztterületet UVB-irradiációban részesítettük (pozitív kontroll), a disztális tesztterületet pedig AS jelzésű, vagy 15% BGP-15M krémmel kezeltük. A tesztterületeket egyszeri, 2 MED dózissal UVB-irradiációban részesítettük, a környező bőr takarással biztosított védelme mellett. A MED meghatározása (I./1.4. pont) a kísérlet

21 21 előtt 24 órával, 3 állaton történt. Negatív kontrollként kezeletlen, UVBexpozícióban nem részesült egerek csoportja szolgált. A krémet az állatok bőréről az UVB-irradiáció után közvetlenül eltávolítottuk. A kezelés alapján a vizsgálatokhoz az állatok következő csoportjait használtuk: I.: I/1.:AS + UVB, I./2.:10% BGP-15M+UVB; II.: II./1.:AS + UVB, II./2.: 15% BGP-15M+UVB; III.: III/1.: AS+UVB, III./2.: 20% BGP-15M+UVB; IV.: IV./1.: UVB, IV./2.: AS+UVB; V.: V./1.: UVB, V./2.: 15% BGP-15M+UVB; VI.: kezeletlen, negatív kontroll csoport. A tesztterületek elrendezésével biztosítani kívántuk az esetleges individuális reakciókülönbségből adódó eltérések minimálisra csökkentését. Az antieritematogén hatást az UVBbesugárzás után 24 és 48 órával vizsgáltuk. I./1.7. Szőrtelen egerek kezelése PARP-regulátorral szoláris-expozíció akut hatásának vizsgálatához A PARP-regulátor, a napfény akut károsító hatásával szembeni fotoprotektív tulajdonságának vizsgálatához a szőrtelen egerek csoportjait 10%, 15%, vagy 20% BGP-15M tartalmú krémmel, valamint vivőanyagával és az ismertettek alapján kezeltük. Az állatok felhőtlen nyári napon, délben (12-13 óra), speciálisan erre a célra kialakított (hőhatást csökkentő rendszer) körülmények között (I./1.3. pont) részesültek a tesztterületeken 1 órán keresztül természetes napfény expozícióban. Az egerek a napoztatási idő alatt mért irradiancia alapján összesen 8,3 J/cm 2 /h UVA és 1,08 J/cm 2 /h UVB dózisú sugárzást kaptak. Az állatokat a tesztterületek kivételével az UVfénytől védtük. Negatív kontrollként kezeletlen, az UV-fénytől a teljestest

22 22 takarásával védett (sham-irradiált) egerek szolgáltak. A BGP-15M krémet, illetve vivőanyagát az állatok bőréről az UV-irradiáció után közvetlenül eltávolítottuk. A kezelés alapján az egerek következő csoportjait használtuk: I.: I./1: 10% BGP-15M + UV, I./2.: vivőanyag + UV; II.:II/1.: 15% BGP-15M + UV, II./2.: vivőanyag + UV; III.: III./1: 20% BGP-15M + UV, III./2.: vivőanyag + UV; IV.: 15% BGP-15M; V.: kezeletlen, negatív kontroll. Az állatok egy részét közvetlenül az UV-expozíció után cervicalis dislocatioval elpusztítottuk, a tesztterületekből nyert bőrmintákat további feldolgozásig fagyasztva (-70 C) tároltuk. A fennmaradó egerek bőrén az UV-irradiáció után 24 órával végeztünk vizsgálatokat. I./1.8. Szőrtelen egerek kezelése PARP-regulátorral UVB-expozíció krónikus hatásának vizsgálatához A PARP-regulátor, BGP-15M protektív hatását a krónikus UVB-irradiáció bőrelváltozásokat előidéző tulajdonságával szemben, azonos életkorú (6 hetes), 18-21g súlyú, nőstény szőrtelen egereken vizsgáltuk. Az egerek hátán (n=20 állat/csoport), a középvonalban 12 x 18 mm-es tesztterületet alakítottunk ki, melyet 15% BGP-15M tartalmú krémmel, vagy annak vivőanyagával (n=20 állat) előkezeltünk. Az állatok az előkezelés után napi egyszeri, 1 MED UVB-besugárzást kaptak, heti öt egymást követő napon keresztül. A MED dózisának meghatározása 24 órával a kísérlet elkezdése előtt 5 egéren történt. Az állatok tesztterületen kívül eső bőrét takarással védtük az UV-sugárzással szemben. Tíz egér nem részesült kezelésben. Ez

23 23 a csoport volt a negatív kontroll. A kontroll csoportba tartozó egerek bőrállapota (makroszkópos és mikroszkópos) szolgált a photoaging (fény általi öregedés) mentes kronológiai öregedés ( aging ) követésére. Öt állatot a tesztterületnek megfelelően 15% BGP-15M tartalmú krémmel kezeltünk (UVB-fénytől védve) az irritatív vagy allergiás reakciók vizsgálata céljából. Az UVB-irradiáció után közvetlenül a BGP-15M krémet, ill. vivőanyagát az állatok bőréről eltávolítottuk. A kialakított vizsgálati csoportok a következők: I.: 15% BGP-15M + UVB; II.: vivőanyag + UVB; III.: 15% BGP-15M; IV.: kezeletlen, negatív kontroll. Az állatokat 32 héten át kezeltük és követtük. A 6. héttől kezdve az egyes csoportokból cervicalis dislocatioval elpusztított egerek bőrmintáin hisztológiai, immunhisztokémiai és elektronmikroszkópos vizsgálatokat végeztünk. I./1.9. Szőrtelen egerek kezelése PARP-regulátorral UVA-expozíció krónikus hatásának vizsgálatához A PARP-regulátor BGP-15M potenciális fotoprotektív tulajdonságát a krónikus UVA-irradiáció által a szőrtelen egerek bőrében előidézett változásokra ( photoaging és fotokarcinogenezis) forszírozott-uva kezelésben részesített (1.3. pont), azonos korú (7 hetes), nőstény egereken vizsgáltuk. Az egerek hátán 2,25 cm 2 (1,5x1,5 cm) tesztterületek (n=2) kerültek kialakításra. Az állatokat 8-metoxipsoralen (8-MOP, Geroxalen, Gerot Pharmazeutika, Wien) 0,15%-os oldatának használatával fényérzékenyítettük. Az egerek előkészítése a kísérlethez a

24 24 következőképpen történt: 5 µl/cm 2 8-MOP oldattal a tesztterületeket bekentük, az egereket sötétbe helyeztük, majd 30 perc múlva, a 15% BGP- 15M tartalmú krémmel, vagy annak vivőanyagával kezeltük és 15 perc elteltével UVA-irradiációban részesítettük. Az állatok UVA- és a forszírozott- UVA kezeléssel (8-MOP + UVA) szembeni érzékenységének vizsgálatára külön állatcsoportot állítottunk be (krémkezelést nem kaptak). További, 15% BGP-15M tartalmú krémmel kezelt (UVA-expozíciótól védett) egerek szolgáltak az esetlegesen fellépő irritatív, vagy allergiás reakció vizsgálatára. A fentiek mellett kezeletlen kontroll csoportot használtunk. Az egerek heti 5 alkalommal, napi 0,5 J/cm 2 UVA-besugárzást kaptak 26 héten keresztül. Az állatok tesztterületen kívül eső bőrét takarással védtük. Az UVA-irradiáció után közvetlenül a kezelésre használt krémeket (BGP-15M tartalmú, illetve vivőanyag) az állatok bőréről eltávolítottuk. A kezelés szerint az állatokat a következő csoportokba osztottuk: I.:I./1.: 8- MOP + UVA, I./2.: UVA; II.: II./1.: 8-MOP + vivőanyag + UVA; II./2.: 8-MOP + 15% BGP-15M krém + UVA ; III.: III./1.: 8-MOP + vivőanyag, III./2.: 15% BGP-15M krém; IV.: kezeletlen kontoll (n=6 egér/csoport). A kontroll csoportba tartozó egerek bőrállapota szolgált a kronológiai öregedés követésére. A rendszer összeállítása lehetővé tette az egerek UVA- és forszírozott-uva érzékenységének (makro- és mikromorfólógiai) megítélését, valamint az önkontrollos elhelyezés az esetleges individuális különbségekből adódó eltérések minimálisra csökkentését. Az egereket 26 héten át kezeltük és követtük. A 26. hét végén cervicalis dislocatioval elpusztított egerekből vett bőrmintákat használtuk a hisztológiai és immunhisztokémiai vizsgálatokhoz.

25 25 I./2. Klinikai tünetek értékelése I./2.1. Klinikai vizsgálatok akut és krónikus UV-expozícióban A különböző kezelésben részesült egerek tesztterületeinek bőrállapotát vizuálisan és dermatoszkóppal vizsgálva összehasonlítottuk a kezeletlen kontroll állatokéval. Az akut UV-expozíció által kiváltott fénykárosodás klinikai tüneteit (eritéma, ödema, vezikula, bulla, erózió) az UV-besugárzás után közvetlenül és 24 órával azt követően, öt fokozatú skála (0-4 pont) szerint értékeltük (I/2.2. pont) és tüntettük fel az egérkövetési lapokon. A krónikus UVB- és UVA-besugárzás során a szőrtelen egerek tesztterületeit hasonló módon, a kezelések előtt, hetente 5 alkalommal, valamint a kísérletek befejezésekor vizsgáltuk. A klinikai tünetek (eritéma, pigmentáció, erózió, exulceráció) intenzitását (I/2.2. pont) értékeltük. Az átmérő 1 mm nagyságú tumorokat vettük figyelembe és tüntettük fel. Az észlelteket az egérkövetési lapon regisztráltuk. Az egyes csoportok bőrstátuszában bekövetkezett változásokat átlagosan 4 hetente, valamint a kísérlet végén fotódokumentációval rögzítettük. I./2.2. Klinikai tünetek értékelése pontszámmal A klinikai tünetek meglétének és intenzitásának értékeléséhez öt fokozatú skálarendszert használtunk. A tünetek súlyosságát 0-4 ponttal: 0 = nincs, 1 = nagyon enyhe, 2 = enyhe, 3 = közepesen súlyos, 4 = súlyos fejeztük ki.

26 26 Eritémára vonatkoztatva: 0 = nincs, 1 = nagyon enyhe (alig észlelhető), 2 = enyhe (jól látható), 3 = közepesen súlyos (vörös), 4 = súlyos (mélyvörös); ödémára: 0 = nincs, 1 = nagyon enyhe (alig megítélhető), 2 = enyhe (érintett terület előemelkedő széllel bír), 3 = közepesen súlyos (a bőr szintje fölé emelkedik <1mm-rel), 4 = súlyos (>1mm-rel emelkedik a bőr szintje fölé). A krónikus UVB- és UVA-besugárzás során a szőrtelen egerek tesztterületein a klinikai tüneteket (eritéma, pigmentáció, erózió, exulceráció) hasonló módon értékeltük. A krónikus UVA-besugárzás során hat fokozatú skálát alkalmaztunk (0 = nincs - 5 = nagyon súlyos). I./3. PARP enzim auto-adp-ribozilációjának vizsgálata Western-blot analízissel A PARP auto-adp-ribozilációját különböző bőrmintákban (kezeletlen, nem besugárzott; 15% BGP-15M tartalmú krémmel kezelt; 15% BGP-15M tartalmú krémmel, vagy vivőanyaggal előkezelt és UV-fénnyel besugárzott) határoztuk meg (Szabados és mtsai. 2000). A bőrmintákat (20-22 mg/minta) 250 µl 50 mm Tris pufferben (ph 7,8) Ultra-Turrax készülékben homogenizáltuk, majd 8 M karbamid tartalmú 2x Laemmli puffer 250 µl-ének hozzáadását követően Potter-Elvehjem teflonos homogenizátorban (Wheaton) tovább homogenizáltuk, majd centrifugáltuk (5 perc, rpm). A mintákban levő fehérjéket SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel (8%-os gél) szeparáltuk és nitrocellulóz membránra blottoltuk (Western-blot analízis) (Szabados és mtsai. 2000). Az ADP-ribozilált fehérjék kimutatására anti- ADP-ribóz monoklonális antitestet (Dr. Alexander Berkley, Heidelberg és Dr. Masanao Miva, Tsukuba bocsátotta rendelkezésünkre) és anti-egér IgG

27 27 peroxidáz komplexet (Sigma, München) használtunk. Az antitest-antigén komplex megjelenítését ECL (Enhanced Chemiluminescence) módszerrel végeztük. A Western-bloton kapott jelek kvantitatív meghatározása Image Tool (Version 1.27) image processing programmal (University of Texas, Health Science Center, San Antonio) történt. I./4. Sunburn sejtek kvantítatív meghatározása A sunburn sejtek UV-fény expozicíó hatására a bőrben megfigyelhető apoptótikus keratinociták. A sunburn keratinociták a környező sejtektől különálló, lekerekedett alakú, zsugorodott, eozinofil citoplazmával, vakuolumokkal rendelkező, kondenzált, piknotikus sejtmaggal bíró sejtek (Ziegler és mtsai. 1994). A jellegzetes morfológiai elváltozásokkal rendelkező sunburn sejteket felhasználják a fénykárosodás mértékének megítélésében. Az eozinofilen festődő, nukleusz nélküli, vagy piknotikus maggal rendelkező sunburn sejtek számát a szövetminták 10%-os pufferolt formalinban fixált, paraffinba ágyazott, He-festett, 4 µm-es metszetein, a bazálmembrán 250 µm-es szakasza (kalibrált ocular, Periplan GF 10x/20 Leitz, Nürnberg) feletti interfollikuláris epidermiszben, 400x nagyítás mellett (Diaplan fénymikroszkóp, Leitz, Nürnberg) határoztuk meg. Az állatonként 16 látótérben (80 látótér/csoport) vizsgált sunburn sejtek számának átlagát 1 mm hosszúságú epidermiszre vonatkoztatva (átlag ± SEM/mm epidermis) adtuk meg.

28 28 I./5. Hisztológiai vizsgálatok A vizsgálatokhoz a szövetmintákat narkózisban, vagy az állatok cervicalis dislocatioval történő elpusztítása után nyertük. Az így kapott anyagot, vagy azonnal feldolgoztuk, vagy a további feldolgozásig -70 C-on tároltuk. Kimetszés után közvetlenül a bőrminták egy részét Tissue Freezing Mediumot (Cambridge Instruments, Heidelberg) használva beágyazóként, folyékony nitrogénben lefagyasztottuk. A blokkokat feldolgozásig -70 C-on tároltuk. Az immunhisztokémiai vizsgálatokhoz 6 µm-es metszeteket készítettünk (-24 C, Reichert-Jung Cryocut 1800 kriosztát, Leica, Nusslock). Másrészt, a szövetmintákból formalinos fixálás (fedeles beágyazó kazettában, (Bio-Optica, Milánó), 4,5% pufferolt formalin, ph 7,0, 9-24 h), paraffinba való beágyazás (Citadel 1000 víztelenítő automata (Shandon, Runcorn), 22 h, felszálló alkohol sor: 50% etilalkohol, 70% etilalkohol, 80% etilalkohol, 96% etilalkohol, aceton, amilacetát + paraffinolaj (1:1), xylol (Reanal, Budapest), paraffin (tissuewax, olvadáspont: C, (Medite, Burgdorf)) történt. Rotációs mikrotómmal (Leica RM 2135 rotációs mikrotóm, Nusslock) 4 µm-es (felvétel és tárgylemezre olvasztás, 56 C, 30 min.) metszeteket készítettünk. A festések előtt deparaffinálást és rehidrálást (xilol 2x10 min., abszolut alkohol, 96% alkohol 2x, 80% alkohol, 70% alkohol, 50% alkohol), majd 3x csapvizes öblítést végeztünk (Mikkel 1994, Luna 1968).

29 29 I./5.1. Hematoxilin-eozin (He) festés A metszeteket hematoxilin oldattal (Merck, Darmstadt) 8 percig festettük, majd kékítést (2 min., csapvíz) követően a további festést eozin oldattal (Merck, Darmstadt) szintén 8 percig végeztük. A víztelenítéshez felszálló alkoholsort (70% etilalkohol 2x, 90% etilalkohol, 96% etilalkohol 2x, abszolut alkohol 2x, abszolút alkohol+xilol 1:1 arányú keveréke, xilol 2x) használtunk. A készítményt Pertex oldattal (Medite, Burgdorf) fedtük (Mikkel 1994, Luna 1968). I./5.2. Fontana-Masson festés A melanin kimutatására paraffinos metszeteken argentaffin reakciót végeztünk Fontana-Masson módszere szerint (Krobock és mtsai. 1978). Deparaffinálást és rehidrálást követően a metszeteket 2%-os AgNO 3 oldattal (Reanal, Budapest) inkubáltuk (szobahő, 2h), majd mosás után hidegen telített (5%) nátriumtioszulfát oldattal (Reanal, Budapest) kezeltük (szobahő, 2 min.), folyó csapvizes mosás (30 min.) után háttérfestésként Mayer-féle kármint (Merck, Darmstadt) alkalmaztunk (3 min.). Dehidrálást követően a fedés Pertex oldattal (Medite, Burgdorf) történt. I./5.3. Orcein-Giemsa festés A rugalmas rostok vizsgálatára paraffinos metszeteken Orcein-Giemsa festést végeztünk (Krobock és mtsai. 1978). Deparaffinálást és rehidrálást

30 30 követően a metszeteket orcein (Merck, Darmstadt) savanyított alkoholos oldatával festettük (20 min.). Abszolut alkohollal való differenciálás, Giemsa oldattal (Reanal, Budapest) történő háttérfestés (5 min.) és dehidrálás után, a fedés Pertex oldattal (Medite, Burgdorf) történt. I./6. Immunhisztológiai vizsgálatok Az egérbőrből nyert, 6 µm-es kriosztátos metszeteket üveg tárgylemezen, hideg acetonban (4 C, 10 min.) fixáltuk. A szövetminták minőségének ellenőrzésére a metszeteken hematoxilin-eozin festést végeztünk. Az immunhisztokémiai reakcióhoz anti-poli-adp-ribóz poliklonális antitestet (hígítás: 1:1000 TBS-ben, Biomol, Hamburg) használtunk, az inkubációt szobahőmérsékleten, 60 percig végeztük, és a streptavidin-biotin-peroxidáz módszert alkalmaztuk (H 2 O 2 /aminoetilkarbazol (AEC) előhívás, Immunotech Universal kit (Immunotech, Marseilles)). Negatív kontrollként nem immunizált egér hasűri folyadéka szolgált (Mikel 1994). I./7. Elektronmikroszkópos vizsgálatok Elektronmikroszkópos vizsgálathoz a frissen eltávolított bőrmintákat órán át, 4 C-on Karnovszky fixálóban (1% paraformaldehid és 2,5% glutáraldehid keveréke, Reanal R, SERVA) inkubáltuk, majd 1%-os ozmiumtetroxidban utófixáltuk (90 min.). Dehidratáció után az anyagot Araldit-be (Fluka) ágyaztuk. Az ultravékony metszeteket uranil acetáttal és ólom citráttal (MERCK) kontrasztosítottuk, és JEOL 1200 EX II transzmissziós elektromikroszkópon vizsgáltuk (Pease 1964).

31 31 II. Eredmények 1. PARP-regulátor szerepe a bőr UV-fény károsodása elleni védelemben 2. PARP-regulátor hatásának vizsgálata UV-fény indukálta karcinogenezisben Napjainkban a bőr vonatkozásában a legjelentősebb környezeti DNS károsító faktor a napfény UV tartománya. Egyszeri, magas dózisú napfényexpozíció alkalmazásával vizsgáltuk a PARP-regulátor (5-20% BGP-15M hatóanyag tartalmú krém) potenciális DNS-protektív hatását immunkompetens hairless (szőrtelen) egérmodellen. Az UV-sugárzás által az egérbőrben indukált akut DNS-károsodás mértékét a bőrben képződött egyes láncú DNS-törések mennyiségének meghatározásával, továbbá az UV-irradiáció által okozott DNS-károsodás markereként nyilvántartott epidermális sunburn sejtek (apoptótikus keratinociták) képződésének kvantitatív, valamint ultrastruktúrális vizsgálatával jellemeztük. II./1.1. PARP-regulátor hatása az UV-sugárzás indukálta egyes láncú DNS törések képződésére a bőrben Az egyes láncú DNS törések meghatározását DNS-lánc szétcsavarodásán alapuló fluoreszcenciás módszerrel végeztük. Mint ismert, a DNS a törések környezetében szétcsavarodik és csak a sérülés mentes régiókban marad meg kettős láncú formában. Ugyanakkor a kettős láncú DNS-hez kötődő

32 32 ethidium-bromid fluoreszcenciája sokkal magasabb, mint hasonló körülmények között az egyes láncúé. Az egyszeri, magas dózisú, természetes UV-expozíció (napfény) akut bőr DNS-károsító hatását szőrtelen egérmodellen vizsgáltuk. Rendszerünkben a napfény expozícióban nem részesült, kezeletlen egerek, valamint a 15% BGP-15M tartalmú krémmel kezelt csoport bőrmintáiban a DNS nagy része (átlagosan 80%) károsodást nem szenvedett, kettős láncú DNS-nek bizonyult. Ugyanakkor az intenzív napfény expozíciónak (egy óra alatt 8,3 J/cm 2 UVA és 1,08 J/cm 2 UVB) kitett egérbőrben a vivőanyaggal kezelt mintákban az egyes láncú DNS törések mennyiségének jelentős megnövekedése következtében, a nem károsodott DNS aránya 30% alá csökkent (1. Táblázat). A napfény behatás előtt PARP-regulátorral (15% BGP-15M tartalmú krém) végzett lokális előkezelés az intenzív UV-sugárzás által indukált nagyfokú DNS-károsodás mértékét szignifikánsan (p<0,01) csökkentette, a mintákban (n=5) az ép DNS aránya meghaladta az 50%-ot (4. Ábra). II./1.2. PARP-regulátor hatása az akut UVB-sugárzás indukálta sunburn sejtek képződésére Az apoptótikus sejthalál egyik prototípusának tartott sunburn sejtképződés kvantitatív meghatározásával vizsgáltuk egérbőrben, az elszenvedett UVfény károsodás mértékét. Rendszerünkben (I./1.5. pont) a PARP-regulátorral vagy a hatóanyagot nem tartalmazó vivőanyaggal előkezelt egércsopotok tesztterületeiben egyszeri, eritémát okozó (2 MED) UV-irradiáció hatására

33 33 jelentkezett sunburn sejtek (apoptótikus keratinociták) számát hasonlítottuk össze az UV-sugárzástól védett (kezeletlen) kontroll állatok bőrében észleltekkel. A sunburn sejtek kvantitatív meghatározását 24 órával az UVB-expozíció után vett bőrmintákból készült, hematoxilin-eozinnal festett hisztológiai készítményekben vizsgáltuk. Az UVB-besugárzástól védett, kontroll állatok bőrmintáiban az epidermisz 1 milliméteres bazálmembrán feletti szakaszán a sunburn sejtek átlagos száma 0,5 ± 0,2 volt (2. Táblázat). Az UV-expozíció hatására a vivőanyaggal kezelt bőrben, az ugyanekkora epidermisz szakaszon megfigyelhető sunburn sejtek száma hetvenötszörösére (37,4 ± 1,4 sejt/mm) nőtt, ami kifejezett DNS-károsodásra utalt (5. Ábra). A PARP-regulátorral történt előkezelés már az 5% BGP-15M hatóanyag tartalom mellett szignifikánsan (p<0,01) csökkentette az UVB-besugárzás által indukált apoptótikus keratinociták képződését (8,8 ± 0,4 sejt/mm epidermisz), ami a szer magasabb koncentrációinál (10% és 15%) még kifejezettebben érvényesült (1,6 ± 0,3 és 1,1 ± 0,4 sejt/mm epidermisz) (6. Ábra). A 15% BGP-15M tartalmú krém előkezelés 34-szeres védelmet mutatott az egyszeri, eritémát okozó (2 MED) UVB-sugárzás apoptótikus sejthalált kiváltó hatásával szemben. Amennyiben az UVB védelmi képesség megítélésének elterjedt módját, a protektív faktort használjuk, úgy a PARP-regulátor (15% BGP-15M tartalmú krém) protektív faktora a sunburn sejt képződésre: 34 (2. Táblázat). Az apoptótikus keratinociták számával meghatározott, UVB-expozíció indukálta DNS-károsodásra vonatkozó eredmények összhangban vannak a napfény által okozott, a bőrben képződött egyes láncú DNS törések

34 34 kvantitatív vizsgálatával kapott adatokkal, és a PARP-regulátor feltételezett fotoprotektív tulajdonságát véli alátámasztani. II./1.3. PARP-regulátor hatásának ultrastruktúrális vizsgálata az akut UVB-sugárzás indukálta DNS-károsodásra a bőrben A lokálisan alkalmazott PARP-regulátor hatását az akut UVB-irradiáció által okozott fénykárosodás ultrastruktúrális eltéréseit frissen eltávolított bőrminták ultravékony metszeteiben transzmissziós elektronmikroszkóppal vizsgáltuk. A kezeletlen, UV-fénytől védett szőrtelen egerek bőrmintáiban kóros ultrastruktúrális eltérést nem észleltünk. Ugyanakkor az eritémát okozó (2 MED) UVB-besugárzásban részesült (vivőanyaggal előkezelt) egérbőrben a felszíni hámréteg bazális és szuprabazális sejtrétegében az apoptózis ultrastruktúrális jeleit mutató sejteket detektáltunk (7. Ábra). A kromatin marginális kondenzációját, részleges nukleáris fragmentációt, a mag zsugorodását, perinukleáris ödémát és az intercelluláris kapcsolat részleges felbomlását lehetett megfigyelni. Az elváltozás megfelelt a sunburn sejtekre jellemzőknek (7. Ábra). A lokálisan alkalmazott PARP-regulátorral (BGP-15M tartalmú krémmel) előkezelt, UVB-irradiációban részesített állatok bőrmintáiban apoptózisra jellemző sejtkárosodást az elektronmikroszkópos feldolgozás során nem észleltünk (8. Ábra). Az akut UV-expozícióval végzett ultrastruktúrális vizsgálatok eredményei további adatot szolgáltattak a PARP-regulátor DNS-protektív szerepére.

35 35 II./1.4. PARP auto-adp-ribozilációja és regulációja UV-besugárzott bőrben A poli(adp-ribóz) polimeráz, egy olyan evoluciónárisan konzervatív nukleáris enzim, mely az eukarióta sejtekben a környezeti (pl. UV-sugárzás) és endogén genotoxikus hatásokkal szembeni DNS-károsodást elhárító rendszer ismert szabályzó faktora (D Amours és mtsai. 1999). A nagyfokú DNS-károsodás, amely direkt módon, túlméretezett PARP-aktivációhoz vezet, a nukleáris fehérjék fokozott poli-adp-ribozilációja, valamint a PARP auto-adp-ribozilációja által előidézi a NAD + és az ATP deplécióját, a sejt energia metabolizmusának károsodását, és ezáltal a sejtfunkciók különböző mértékű zavarát eredményezheti. Az egyszeri, magas dózisú, természetes UV-expozíció akut DNS-károsító hatása által a szőrtelen egérbőrben indukált PARP-aktiváció mértékét az enzim auto-adp-ribozilációjának mérésével határoztuk meg. Kísérleti körülményeink között (I./1.7. pont) az egér csoportok tesztterületeinek az UVexpozíció előtt különböző koncentrációjú BGP-15M tartalmú krémmel történő kezelésével a PARP-regulátor enzimaktivitásra kifejtett hatását vizsgáltuk. A PARP auto-adp-ribozilációjának meghatározását az UV-irradiáció (napfény expozíció) után közvetlenül eltávolított bőrmintákban végeztük. Western-blot technikát alkalmaztunk, az ADP-ribozilált fehérjéket anti-poli(adp-ribóz) monoklonális antitesttel (peroxidáz komplex) detektáltuk, ECL -módszerrel láthatóvá tettük, valamint Image-Tool (verzió 1.27) image processing programmal a jelintenzitás erősségének mértékét kvantitatív módon

36 36 meghatároztuk (3. Táblázat). A továbbiakban immunhisztokémiai technikával vizsgáltuk a bőrminták epidermális sejtjeiben a PARP ADP-ribozilációját. II./1.5. PARP auto-adp-ribozilációjának vizsgálata Western-blot analízissel akut UV-fény expozícióban részesült egérbőrben Kísérleti körülményeink között (I./1.7. pont) a kezeletlen szőrtelen egerek bőrmintáiban az ADP-riboziláció mértéke (Western-blot jel) a nehezen detektálható tartományba esett, ami arra utalt, hogy az UV-irradiációtól védett állatok bőrében a PARP aktivációs szignál intenzitása (DNS törések mennyisége) gyakorlatilag elenyésző volt (9. Ábra és 3. Táblázat). Az egy órás napfény expozícióban részesült, vivőanyaggal előkezelt állatokból származó bőrmintákban a PARP enzim auto-adp-ribozilációja az UVsugárzástól védett kontroll bőrben meghatározott érték 25x-re nőtt. Ugyanakkor a 10% BGP-15M tartalmú krémmel végzett előkezelés hatására az UV-expozíció által kiváltott fokozott ADP-riboziláció mértéke, a Western-blot analízissel kapott jelek intenzitásának kvantitatív meghatározása alapján, több mint 50%-kal csökkent. A BGP-15M lokális alkalmazásával, UV-besugárzás hatására a bőrben létrejött extrém magas PARP-aktivitás (a PARP-enzim auto-adp-ribozilációjával mérve) szignifikáns mértékben (p<0,01) csökkent.