Hallás és szenzorineurális halláskárosodások a gyógyszeres terápia lehetőségének kutatása

Átírás

1 Hallás és szenzorineurális halláskárosodások a gyógyszeres terápia lehetőségének kutatása Zelles Tibor SE, Farmakológiai és Farmakoterápiás Intézet

2 A halláskárosodás jelentősége A leggyakoribb emberi szenzoros deficit Az európai népesség >10 % érintett (>40 millió ember) Befolyásolja a beszéd kialakulását, a kognitív fejlődést és a tanulást Hátrányosan befolyásolja a mindennapi életet, gyakran vezet depresszióhoz idős korban Becslések szerint a kezeletlen halláskárosodások évente több mint 90 milliárd költségterhet jelentenek az EU-nak A vakság elszigetel a tárgyaktól. A süketség elszigetel az emberektől. (Imanuel Kant)

3 Halláskárosodások Vezetéses Szenzorineurális Zajkárosodás Presbycusis Ototoxicitás (pl. aminoglikozid, cisplatin) Egyéb (pl. genetikai okok, autoimmun, CMV)

4 Percepciós halláskárosodások (SNHL) Akut: 5-20 / (1977) 160 / (2009) 65 év feletti lakosság ~40%-t érinti * American Speech-Language-Hearing Association Polony G., PhD védés, 2015

5 Növekvő társadalmi jelentőség Hearing loss is projected to be among the top ten causes of burden of disease in high- and middle-income countries DALY (Disability-Adjusted Life Year) = years lived with disability + years of life lost Mathers & Loncar, PLOS Med, 2006

6 A szenzorineurális halláskárosodások aktuális terápiás lehetőségei* Megelőzésére és gyógyítására nincs hatékony gyógyszeres terápia. Akut esetben: Spontán javulás %-ban (?) Kortikoszteroid kezelés Szisztémás: hatékonyság???, ajánlható Intratimpanális: > placebo Egyéb gyógyszeres lehetőségek Antivirális, Trombolitikus, Értágító, Vazoaktív anyagok és Antioxidánsok alkalmazása nem javasolt (Stachler et al., 2012) Hiperbárikus O 2 terápia: drága, hatékonyság??? nem javasolt Krónikus esetekre: nincs hatékony gyógyszeres kezelés. Egyetlen lehetőség: hallásjavító eszközök *American Academy of Otolaryngology Head and Neck Surgery Foundation érvényben lévő 2012-es szakmai irányelve alapján Polony G., PhD védés, 2015

7 Békésy György - Georg von Békésy (Budapest, 1889.VI.3. - Honolulu, 1972.VI.13.) The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1961 "for his discoveries of the physical mechanism of stimulation within the cochlea"

8 Az egér alkalmas modell állat Ember Egér (NMRI) TheSciOfNature_61p506_1974_GünterEhret_AgedependentHearingLossInNormalHearingMice

9 Lateral olivocochleáris efferensek (LOC) - Otoprotekció az IHC-SGC transzmisszió gátlásán keresztül - LOC terminálisok CAP (zaj Compound Action Potential ) - DA receptor agonisták hallóideg tüzelés - DA receptor agonisták kóros struktúrális és funkcionális változások Lendvai et al., Neurochem Int, 2011 D Aldin, EurArchOtorhinolaryngol, 1995; HearRes, 1995; Gil-Loyzaga, ActaOtolaryngol, 1995; Oestreicher, HearRes, 1997; Puel, HearRes, 1988; Pujol, ActaOtolaryngol, 1993

10 A LOC terminálisok DA felszabadításának első neurokémiai bizonyítéka, tengerimalac cochlea Vizi Szilveszter csoportja: Gáborján et al., Neuroscience, 1999 In vitro superfusion [ 3 H]DA release

11 Potenciális otoprotektív farmakoterápia - emelni az endogén DA felszabadulást a LOC terminálisokból Isolated cochlea 1 mm afferent terminal Ribbon synapse axon terminals IHC Halmos et al., Neuroscience, 2005 Doleviczényi et al., Neurosci Lett, 2005 Halmos et al., Neuroscience, 2008 Doleviczényi et al., Neurochem Res, 2008 Lendvai et al., Neurochem Int, 2011

12 A hallás objektív vizsgálata (objektív audiometria): auditoros agytörzsi kiváltott válasz (ABR) mérés altatott egéren Hallásküszöb meghatározás 1 uv 3 ms 1 uv 3 ms

13 SNHL modellek: egy károsító tényezővel (pl. kanamycin, zaj, életkor előrehaladása) rontjuk a hallást Aminoglikozid példa: 2 hét kanamycin kezelés hallásküszöb eltolódást okoz Kontroll Kanamycin 800 mg/kg 1 uv 3 ms Hallásküszöb eltolódás = küszöb kezelés után küszöb kezelés előtt

14 In vivo SNHL modellek 1. Aminoglikozid (kanamycin) modell 2. Zaj okozta halláskárosodás (NIHL) modell 3. Időskori halláskárosodás (AHL) modell

15 1. A Rasagilin és egy másik kísérleti vegyület védő hatású az aminoglikozid okozta halláskárosodásban Polony et al., Neuroscience, 2014

16 2. A zaj okozta halláskárosodás (NIHL) modell Noise-box : homogén zajtér, zajterhelés egyszerre akár 20 egérnek (fájdalomküszöb alatti zajterhelés éber állatok) Márki Ferenc, Firtha Gergely állítható zajparaméterek (hangnyomás, frekvenciatartomány, zajterhelés ideje) A zajszint és a spektrum folyamatos ellenőrzése és regisztrálása zajszintmérővel Átmeneti (TTS) és permanens (PTS) hallásküszöb eltolódás mérése ABR módszerrel

17 Zajexpozíció Akut zajexpozíció Krónikus zajexpozíció Ismételt mérsékelt zajexpozíció

18 Egyszeri zajexpozíció okozta tartós halláskárosodás (PTS) modell 98 db, 8-16 khz, fehér zaj, 30 perc

19 Hallásküszöb eltolódás (db) ANOVA és Bonferroni post hoc test Compound A védő hatása - egyszeri zajexpozíció 1. nap 1. nap 30. nap (PTS) 30. nap (PTS)

20 Zajszintmérés akusztikus csoport 21 rendezvényen 25 műszeres zajmérés Gáborján Anita és mtsai (SE Fül-Orr-Gége Klinika)

21 Kategóriajel db* A rendezés, részvétel feltételei A 76 alatt B C D E 99 fölött Gyermekek a rendezvényen korlátozás nélkül részt vehetnek gyermekek részvétele 2 óránál hosszabb műsor esetén nem ajánlott gyermekek részvétele 1 óránál hosszabb műsor esetén nem ajánlott. 1 óránál hosszabb tartózkodás esetén hallásvédő eszköz használata javasolt gyermekek részvétele nem ajánlott gyermekek részvétele nem ajánlott hallásvédő eszköz használata javasolt 18 év alattiak részvétele esetén a legnagyobb L C,peak nem lehet 125 db-nél nagyobb Biztosítani kell, hogy a közönség ne tudja megközelíteni a hangsugárzókat 5 m-en belül Biztosítani kell, hogy a közönség ne tudja megközelíteni a hangsugárzókat 15 m-en belül Gáborján Anita és mtsai (SE Fül-Orr-Gége Klinika)

22 Ismételt, mérsékelt zajexpozíció modell 95 db, 4-20 khz, fehér zaj, 15 perc

23 Ismételt, mérsékelt zajexpozíció modell egyszeri zaj kiválasztása n=3-6

24 Ismételt, mérsékelt zajexpozíció modell egyszeri zaj ismétlése n=3-6

25 3. DBA/2J és BALB/c egerek az életkorral összefüggő halláskárosodást mutatnak (AHL); a DBA/2J progresszívebben

26 3. AHL elleni védő hatás tesztelése DBA/2J egerekben

27 Hallásküszöb eltolódás (db) 3. AHL elleni védő hatás tesztelése BALB/c egerekben * * * * **** *** * *** * **** **** * * **** * *** * **** ** **** **** **** Életkor (hetek)

28 Funkcionális imaging vizsgálatok halló egér hemicochlea preparátumon

29 Hemicochlea preparátum, Ca 2+ indikátor töltés Kifejlett hallású egerek (> P15) Érett Corti-szerv Megtartott anatómiai struktúra Bulk loading 4x-es objektív 300 μm 40x-es objektív Egysejt elektroporáció (Nevian & Helmchen 2007) Jóbb jel-zaj arány TM OHCs IHC IPC OPCs DCs BM 30 μm

30 Az újszülött egerek süketek. A ~normál hallásuk P13-15 után kezdődik Egér audiogrammok korfüggés P8 cochlea fő struktúrái kialakultak P9 - IHC elektromosan aktív P9 Nuel tér megnyílik P10 BM & SG kialakult; külső hallójárat megnyílik >P10 - AP-ok a n. VIII-ban P17-19 P14 optimális érzékenység 15 khz-nél megjelenik P18 utolsó mitózis a Cortiban G Ehret, J Am Audiol Soc, 1976

31 Az ATP befolyásolja az endolympha K + koncentrációját és az endocochleáris potenciált Mammano, Physiology, 2007

32 Fiziológiás inger ATP és a purinerg jelátviteli rendszer Purinerg rendszer: ionotróp (P2X) és metabotróp (P2Y) receptorok szerep a fejlődésben, támasztósejtek közötti kommunikációban, zaj elleni védelemben Intracelluláris Ca 2+ szint növekedés, belső raktárak ürítése sejtmembránon levő ioncsatornák nyitása Hensen sejt Deiters sejt OGB-1 Fura2/K +

33 Az ATP reverzibilis & ismételhető Ca 2+ tranzienst vált ki a Corti szerv támasztósejtjeiben Horváth et al., Neurochem Res, 2016

34 Az ATP kiváltotta Ca 2+ tranziensek extracelluláris Ca 2+ & intracelluláris Ca 2+ raktár függők Horváth et al., Neurochem Res, 2016

35 Elektroporációs Ca 2+ indikátor töltés

36 Támasztó sejtek - Deiters sejt Kevésbé kutatott terület szemben a szőrsejtekkel Aktív cochleáris mikromechanika Tápanyag ellátás, metabolitok eltávolítása Passziv cochleáris mikromechanika Cochlea fejlődése Endolympha K + homeosztázis hallás érzékenységének szabályozása zaj elleni védelem Endolympha és perilympha ionösszetételének fenntartása Deiters sejt Ca 2+ indikátorral töltve phalangeális nyúlvány 10 µm

37 DC nyúlvány és sejttest ATP válasz - Időeltolódás Deiters sejt ,2 ΔF/F 0 20 s s (100 µm ATP, n=40, sejttest késésének átlaga = 5.28 s, S.E.M. = 0.7; p = 1.59*10-9 )

38 A perfúzió iránya nem befolyásolja a késést Megfordított áramlású kamrával: out Ca 2+ válasz késés in in 2 s (40) (11) out A két kísérleti felállásban a késés mértéke azonos (p=0,23)

39 A jelenség általánossága és koncentráció-függetlensége Beltenyésztett egértörzs mutáció? Purinerg receptorok ATP koncentráció érzékenysége Ca 2+ válasz késés 2 s (6) (24) (40) (3) (5) (6) 10 (8) (18) (7) ATP (µm) BALB/c (beltenyésztett) C57Bl/6 (beltenyésztett) CD1 (nem beltenyésztett)

40 Az adenozin receptorok aktivációja nem járul hozzá a Ca 2+ válasz kialakításához ROI-background sec ATP ATP 1 8-SPT ATP Adenosine ATP 0, F/F 0 0,6 0,4 0,2 0 0, sec 0,6 0,4 2 0 Nincs válasz 11/12 kísérletben 100 s-on időablakon belül 0,2 0 8-SPT nem okoz jelentős változást sem az amplitúdó értékekben, sem a késés mértékében

41 Genetikailag módosított (KO) egerek a hallás érintettségének vizsgálata

42 Pejvakin KO

43 A zajexpozícióval szembeni túlérzékenység oka a pejvakin függő peroxiszóma proliferáció károsodása & nem a mitokondrium károsodás okozta ROS túlprodukció Delmaghani et al., Cell, 2015

44 m mérés (Rh123) a Corti szervben & a SG-ban emberi SNHL modelljében (pej -/-) Delmaghani et al., Cell, 2015

45 Caskin KO

46 CASK Ca 2+ /kalmodulin-dependens szerin protein kináz, adaptor protein Nagy mennyiségben fordul elő az IR-ben Megtalálható szomatodendritikusan, pre- ill. posztszinaptikusan Funkciói: Génátírás szabályozása Axonok kifejlődésének segítése Fehérje transzport Szinaptikus interakciókban való részvétel, szinapszis formálás CASK gén deléciója abnormális szinaptikus funkció, perinatális halál (egerekben)

47 CASK a fülben Megtalálható a hallópálya szinapszisaiban Külső és a belső szőrsejtek sztereocíliumaiban Kapcsolatba lép a whirlinnel, presztinnel, protein 4.1 N-el, melyek hibás működése halláskárosodással jár

48 Caskin Horgonyzófehérje, két izomer (Caskin 1,2) Preszinaptikusan, posztszinaptikus denzitásban fordul elő 2 izoforma. Caskin 1: agyban, neuropilben, főleg szomatodendritikusan A CASK Ca 2+ /kalmodulin doménjével kapcsolódik EphrinB1-R Nck adaptor protein Caskin 1 kapcsolat szerepe lehet a dendritek citoszkeletális szerkezetének kialakításában Retina ribbon szinapszisai (CASK és Caskin) Ribbon szinapszis a fülben

49 Caskin WT vs KO Hallásküszöb (db) 100 Click *** 15 ** *** khz *** 80 *** ** *** 11 7 ** 2 1 Caskin KO Caskin HZ Caskin WT khz ** *** ** *** khz * *** *** * khz khz *** *** ** *** *** *** Állatok életkora (hónapok)

50 Amplitúdó (nv) Fiatal Caskin 1,2 KO és a heterozigóta (HZ) állatok amplitúdó értékei (30 db; click stim) Állatok életkora (hónapok)

51 Látencia (ms) Fiatal Caskin 1,2 KO és a heterozigóta (HZ) állatok látencia értékei (30 db; click stim) Állatok életkora (hónapok)

52 PACAP KO

53 PACAP Kollaborációs partner eredményei (Dr. Reglődi Dóra csoport) A glukagon/szekretin/vip peptidcsalád tagja Legnagyobb mennyiségben az idegrendszerben és az endokrin mirigyekben PAC1 és VPAC1, VPAC2 receptorok Neurotrofikus, neuroprotektív, antiapoptotikus Általános citoprotektív: cardiovaszkuláris, urogenitalis, gastrointestinalis Védő hatás az érzékszervekben

54 PACAP-ot expresszáló sejtek

55 PACAP WT vs KO

56 Köszönetnyílvánítás Márki Ferenc Firtha Gergely Augusztinovicz Fülöp

57 Berekméri Eszter Humli Viktória Szepesy Judit - Király Kornél Köles László Kollaborátorok: Tamás László, Gáborján Anita, Polony Gábor, (SE, Fül-Orr-Gége Kl.) Vizi E. Szilveszter, Zsilla Gabriella (MTA KOKI) Fülöp Balázs, Reglődi Dóra, Tamás Andrea (PTE) Buday László (MTA TTK) Schlett Katalin (ELTE) Christine Petit (Inst. Pasteur) Horváth Tamás (Bajcsy-Zsilinszky Kh.) TDK: Dienes Tamás, Juhász Balázs Deák Orsolya, Sapir Shawn Halmos György (Univ. Groningen) Grimm András (SE)