A COCHLEA DOPAMINERG ÉS GLUTAMÁTERG NEUROTRANSZMISSZIÓJÁNAK VIZSGÁLATA

Átírás

1 A COCHLEA DOPAMINERG ÉS GLUTAMÁTERG NEUROTRANSZMISSZIÓJÁNAK VIZSGÁLATA Doktori (Ph.D.) Értekezés dr. Halmos György Témavezető: Prof. Dr. Vizi E. Szilveszter Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet Budapest Szigorlati bizottság: Prof. Dr. Czigner Jenő Dr. Rejtő Kálmán Dr. Kiss János Opponensek: Birálóbizottság: Dr. Tretter László Dr. Vass Zoltán Dr. Hársing László (póttag) Prof. Dr. Hadházy Pál (elnök) Prof. Dr. Bauer Miklós Prof. Dr. Sziklai István Dr. Küstel Marianna (póttag) Semmelweis Egyetem Doktori Iskola 6. Doktori Iskola Vezető: Prof. Dr. Réthelyi Miklós 6/1. Program Programvezető: Prof. Dr. Palkovits Miklós VI. Alprogram: Neurofarmakológia Alprogramvezető: Prof. Dr. Vizi E. Szilveszter 1

2 Tartalomjegyzék Összefoglaló 5 Abstract 7 A. Bevezetés 9 B. Irodalmi háttér 11 B.1. A neurotranszmisszó alapjai 11 B.1.1. A szinaptikus kapcsolat 11 B.1.2. A cochlea neurotranszmitterei és azok receptorai 13 B Dopamin 13 B Glutamát 14 B.1.3. Nem-szinaptikus kapcsolat 15 B.2. A cochlea 16 B.2.1. A cochlea mikroanatómiája 16 B Perifériás hallósejtek 16 B Belső szőrsejtek 16 B Külső szőrsejtek 17 B Deiters sejtek 17 B Hallórostok 18 B Afferens hallórostok 18 B Efferens hallórostok 18 B.2.2. Neurotranszmisszó a cochleában 19 B Afferentáció 19 B Efferentáció 22 B A lateralis olivocochleáris efferensek védő funkciója, különös tekintettel 24 a dopaminra B.2.3. A szőrsejtek kalcium-homeosztázisa 26 B.3. A cochlea működése patológiás folyamatokban 27 B.3.1. Ischaemiás halláskárosodás 27 B.3.2. Akusztikus trauma 30 B.3.3. Aminoglikozid ototoxicitás 30 C. Célkitűzések 32 D. Anyag és módszer 34 D.1. Állatok 34 D.2. Felhasznált anyagok 34 D.3. Izolált tengerimalac cochlea preparátum 34 D.4. Dopamin felszabadulásának mérése 36 D.4.1. In vitro, mikrotérfogatú perfúziós módszer 36 D.4.2. A perfundált szövet ingerlése 37 D Elektromos téringerlés 37 2

3 D Veratridin-ingerlés 37 D.4.3. Drogok hozzáadása 37 D.4.4. A felszabadult dopamin mennyiségének értékelése 37 D.5. Glutamát és dopamin felszabadulásának párhuzamos mérése 39 D.5.1. In vitro, mikrotérfogatú perfúziós módszer módosítása 39 D.5.2. Magas nyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) glutamát meghatározás 39 D.5.3. Drogok hozzáadása D.5.4. Elektromos téringerlés 40 D.6. Aminoglikozid antibiotikumok hatásának vizsgálata a dopamin 40 elszabadulására D.6.1. Akut hatás vizsgálata 40 D.6.2. Krónikus neomycin kezelés 41 D.7. Szőrsejtek intracelluláris Ca 2+ -koncentrációjának vizsgálata intakt 41 tengerimalac Corti-szerven D.7.1. Corti szerv preparálása 41 D.7.2. Intracelluláris Ca 2+ -mérés 41 D.8. Statisztikai analízis 42 E. Eredmények 43 E.1. Ischaemiás modell hatása a dopamin felszabadulására 43 E.1.1. Kontroll kísérletek 43 E.1.2. Veratridin hatása különböző koncentrációkban 43 E.1.3. Veratridin hatásának gátlása tetrodotoxinnal 45 E.1.4. Glutamát receptor antagonisták hatása a dopamin felszabadulására 46 E.2. Dopamin és glutamát felszabadulásának szimultán mérése 48 E.2.1. Kontroll kísérletek 48 E Dopamin felszabadulása 48 E Glutamát felszabadulása 49 E.2.2. Tetrodotoxin hatása 50 E Dopamin felszabadulása 50 E Glutamát felszabadulása 50 E.2.3. Dopamin receptor agonista és antagonista hatása 50 E Dopamin felszabadulása 50 E Glutamát felszabadulása 51 E.3. Aminoglikozid antibiotikumok hatása a dopamin felszabadulására 52 E.3.1. Akut hatás 52 E.3.2. Krónikus hatás 54 E.4. Intracelluláris kalciumkoncentráció mérése. 55 E.4.1. Az egyes sejttípusok azonosítása 55 E.4.2. A sejtek töltődése fura-2/am-mel 55 E.4.3. A belső szőrsejtek ingerlése KCl-dal 57 F. Megbeszélés 58 F.1. Ischaemia hatása a dopamin felszabadulására 59 F.2. Glutamát receptor antagonisták hatása a dopamin felszabadulására 61 F.3. Dopamin és glutamát felszabadulásának szimultán mérése 62 3

4 F.4. Aminoglikozid antibiotikumok hatása a dopamin felszabadulására 64 F.5. Intracelluláris Ca 2+ -koncentrációjának vizsgálata intakt tengerimalac Cortiszerven 66 F.6. Kutatásaink klinikai vonatkozásai 67 G. Rövidítések jegyzéke 69 H. Köszönetnyilvánítás 71 I. Irodalomjegyzék 72 J. A témában megjelent publikációk jegyzéke 84 4

5 ÖSSZEFOGLALÁS A cochleában a belső szőrsejtek (BSZ) és az afferens ideg közötti neurotranszmitter legnagyobb valószínűséggel a glutamát (Glu). Ischaemia és zaj hatására a BSZ-ből felszabaduló extrém mennyiségű Glu károsítja az afferens ideg dendritjét. A lateralis olivocochleáris efferens (LOC) axonja a BSZ alatt szinaptizál az afferens dendritjével. A LOC-ből felszabaduló dopaminról (DA) kimutatták, hogy zaj és ischaemia hatására létrejövő Glu-excitotoxicitás ellen nyújt védelmet. Kísérleteink során in vitro mikrotérfogatú perfúziós módszert használtunk izolált tengerimalac cochleából a DA felszabadulásának mérésére. A veratridin egy Na + - csatorna aktivátor szer, mely ischaemiához hasonló intracelluláris állapotot hoz létre, hatását kizárólag neuronális sejteken fejti ki. Kísérleteink során kimutattuk, hogy veratridin hatására a DA nyugalmi- és elektromos inger kiváltotta felszabadulása szignifikánsan megemelkedett. Ezt a hatást ionotróp Glu-receptor antagonisták nem befolyásolták. Új módszert dolgoztunk ki, mely során az in vitro mikrotérfogatú perfúziós módszert HPLC-vel kombináltuk, így a DA-nal párhuzamosan Glu-mérés is lehetővé vált. Elektromos ingerlés hatására mindkét transzmitter felszabadulása szignifikánsan megemelkedett, mely hatást tetrodotoxin gátolta. Ezzel igazoltuk a transzmitterek idegi eredetét. A Glu felszabadulását DA receptor antagonista és agonista szer nem változtatta meg szignifikánsan, míg mind a DA agonista és antagonista megemelte a DA kiáramlását. Mivel ismert, hogy az aminoglikozid antibiotikumok halláskárosodást okoznak, ezért megvizsgáltuk hatásukat a DA felszabadulására. Azt találtuk, hogy neomycin koncentrációfüggően gátolta az elektromos ingerlés kiváltotta DA felszabadulást. A gentamicin és a kanamicin viszont nem befolyásolták a DA felszabadulását. Amikor krónikusan neomycinnel kezeltük állatokat a cochleáikkal végzett kísérletek során a DA felszabadulását nem befolyásolta a neomycin. Kísérleteink során bebizonyítottuk, hogy (1) az elektromos (axonális) ingerlésre felszabaduló DA és a Glu neuronális eredetű, (2) az ischaemiához és zajhatáshoz hasonló állapotban a belsőfül eredetű DA felszabadulása megemelkedik, mely Glureceptoroktól független. (3) Új módszert állítottunk be, mellyel párhuzamosan tudtunk izolált emlős cochleából DA- és Glu-felszabadulást mérni. (4) DA receptor agonistákkal 5

6 és antagonistákkal végzett kísérleteink során nem találtunk bizonyítékot a BSZ-eredetű Glu felszabadulásának preszinaptikus szabályozására. (5) Neomycinnel végzett kísérleteink során az aminoglikozid antibiotikumok ototoxicitásának egy új lehetséges hatáspontját, a DA felszabadulásának gátlását találtuk. Ezt a hatást alátámasztják a krónikus neomycin-kezelés után kapott eredmények is, melyek hátterében egy adaptív mechanizmus állhat. (6) A cochleában zajló transzmiszmitter kölcsönhatások jobb megértéséhez egy új preparátumot dolgoztunk ki, melynek segítségével egyszerre, saját környezetében mérhető a Corti érzékhám különböző sejtjeiben az intracelluláris kalciumion koncentráció. 6

7 ABSTRACT DOPAMATERGIC AND GLUTAMATERGIC NEUROTRANSMISSION IN THE COCHLEA Glutamate (Glu) is most likely the transmitter between the inner hair cell (IHC) and the afferent nerve terminal. The damage of the afferent nerve due to ischemia or acoustic trauma is caused by the extreme Glu release from the IHC. Axon terminals of the lateral olivocochlear efferent (LOC) fibers form synapse with dendrites of the afferent nerve beneath the IHCs. The LOC terminals, that release dopamine (DA) has a protective role against the Glu-excitotoxicity in case of ischemia and acoustic trauma. We used in vitro microvolume superfusion method to measure DA release from isolated guinea pig cochlea. Veratridine is a sodium-channel activator drug that causes intracellular changes similar to ischemia, acting only on neuronal elements. We found that both the resting and the evoked release of DA significantly increased in response to veratridine. This effect was not influenced by ionotrop Glu-receptor antagonists. We developed a new method, combining the in vitro microvolume superfusion technique with high performance liquid chromatography (HPLC), to simultaneously measure the release of DA and Glu. The release of both transmitters increased in response to electric field stimulation, that could be blocked by tetrodotoxin. This proves the neuronal origin of the transmitters. DA receptor antagonist and agonist drugs did not change significantly the release of Glu, while both agents increased the outflow of DA. Since the ototoxicity of aminoglycoside antibiotics is well-known, we also examined the effect of aminoglycosides on DA release. We found that neomycin decreased the electrically evoked release of DA in a concentration-dependent manner. Gentamicin and kanamycin had no significant effect on the release of DA. In the experiments where the cochleae were from chronic neomycin-treated animals, neomycin did not significantly change the release of DA. In our experiments, we proved (1) the neuronal origin of the cochlear DA and Glu, (2) the release of cochlear DA is elevated in a condition similar to ischemia and acoustic trauma, which seems to be independent from Glu receptors. (3) We set up a new method to measure simultaneously the release of DA and Glu from isolated mammalian cochleae. (4) In our experiments with DA receptor agonist and antagonist we did not find any evidence of presynaptic regulation of Glu released from IHCs. (5) 7

8 We found a new probable site of action of aminoglycoside antibiotics, as neomycin inhibited the release of DA. An adaptive mechanism may underlie the ineffectiveness of neomycin application in the chronically treated animals. (6) In favor of the better understanding of the transmitter interactions in the cochlea, we developed a new preparation, that enables us to simultaneously measure the intracellular calcium concentration of many different cell types of the organ of Corti. 8

9 A. Bevezetés A WHO Internetes honlapján közzétett legfrissebb, júliusi becslés szerint a föld teljes lakosságából 250 millió ember szenved közepes, vagy annál súlyosabb fokú halláskárosodásban. Ennek a tetemes népcsoportnak kb. 2/3-a a fejlődő országokban él, de a fejlett európai országok lakosságának is hozzávetőleg 4 %-a 40 db-nél nagyobb halláscsökkenésben szenved. A percepciós halláskárosodás már évtizedek óta a klinikai és kísérletes vizsgálatok középpontjában áll. Bár a patomechanizmus sok tekintetben tisztázott, jelenleg sem ismert teljes egészében; így a definitív klinikai kezelés is várat magára. Az idegi típusú hallásromlások etiológiai okai közül kiemelkedik az ischaemiás halláskárosodás jelentőssége, hiszen minden bizonnyal ebbe a csoportba sorolhatóak az időskori halláscsökkenések (presbyacusis) legnagyobb része. A modern világ ismert civilizációs betegségei közé sorolható a zaj okozta halláskárosodás, mely a fokozódó technikai fejlődéssel egyre növeli ezt a nagyszámú betegcsoportot. Az európai országok nemzeti össztermékük 0,2 2 %-t költik a zaj okozta halláskárosodás megelőzésére, illetve a már kialakult károsodások kezelésére (201). Az akusztikus trauma és az ischaemia patomechanizmusa sok tekintetben igen hasonló, így kísérleteinkben együtt vizsgáltuk e két noxa belsőfülre gyakorolt hatását. Ischaemiás körülmények (magas intracelluláris nátrium- és kalciumion koncentráció) modellezésére egy nátrium-csatorna aktivátor szert, veratridint alkalmaztunk. Kísérleteink középpontjában a cochlea ingerületátvivő rendszerének két olyan transzmittere a glutamát és a dopamin - állt, melyek az eddigi irodalmi adatok szerint központi szerepet játszanak a hallás fiziológiás és patológiás működésében. Az ototoxikus szerek közül a leggyakrabban halláskárosodást az aminoglikozid antibiotikumok okoznak. A fejlődő országok ebben is az élen járnak, de azért a fejlett európai országokban is eléri az 1,9 %-ot az ototoxikus halláskárosodások prevalenciája (202). A korábbi kutatások többféle morfológiai és funkcionális eltérést is észleltek az aminoglikozid antibiotikumok hatására. Kísérleteinkben, létrejöttének megértéséhez szerettünk volna közelebb kerülni egy, ezidáig még ismeretlen patomechanizmus feltárásával. 9

10 Végül dolgozatom tartalmaz egy új, jelenleg még további csiszolást igénylő módszert, illetve azzal elért kezdeti eredményeinket, mely az eddigi kutatásaink eredményeinek jobb megértését teszi lehetővé, az egyes élettani és kóros folyamatok sejt-szintű követése segítségével. 10

11 B. Irodalmi háttér B.1. A neurotranszmisszó alapjai Tekintettel arra, hogy ez a dolgozat nem ölelheti fel az ingerületátvitel minden részletét, és nem is célom teljes mélységéig ismertetni a neurofarmakológia alapjait, itt kizárólag a kísérleteink szempontjából kiemelkedő jelentőségű szempontokkal foglalkozom. Így ebben a fejezetben az ingerületátvitel morfológiai alapjainak ismertetését követően rövid áttekintést kívánok adni a cochleán belüli információtovábbításért felelős transzmitterek közül a dopaminról, a glutamátról, és azok receptorairól. Végül röviden áttekintem a nem-szinaptikus kapcsolat lényegét, és annak lehetséges szerepét a hallás mechanizmusában. B.1.1. A szinaptikus kapcsolat Az idegsejtek axonjai és dendritjei között magasan specializált kapcsolatok, szinapszisok vannak, melyek segítségével a neuronok között gyors információátadás történik. A szinapszisban elkülöníthetjük a pre- és postszinaptikus membránt, melyek között helyezkedik el a szinaptikus rés. A két oldal között az információt neurotranszmitterek közvetítik. A neurotranszmitterek a preszinaptikus idegsejtben termelődnek, és azok vezikulumaiban tárolódnak. A sejt depolarizációjának hatására innen felszabadulnak, és a szinaptikus résbe jutnak, ahol diffúzióval elérhetik a posztszinaptikus membránt. Itt receptorával találkozva létrehozza a megfelelő hatást, mely a receptortól függően lehet aktiváció vagy gátlás. A posztszinaptikus oldal receptorai vagy tartalmaznak ioncsatornát (ionotróp receptorok), és a ligand bekötődésekor ionáramokat hoznak létre, vagy metabolikus változásokért felelős fehérjéket aktiválnak (metabotróp receptorok). A hatás létrehozását követően igen fontos a transzmitter inaktiválása, mely több úton történhet: (1) a transzmitter enzimatikus elbontásával, (2) a preszinaptikus membránon át visszavétellel, (3) az előzőek kombinációjával. Fontos megjegyezni, hogy egy szinapszisban egy akciós potenciál hatására több különböző transzmitter is felszabadulhat, és amennyiben a megfelelő receptorok is jelen vannak a posztszinaptikus membránon, úgy mindegyik hatása érvényesül, és egy összetett biológiai válasz jöhet létre egy stimulus hatására. A 11

12 szinapszisban létrejött ingerületátvitelt több tényező is befolyásolhatja, pre- illetve posztszinaptikusan. Preszinaptikusan autoreceptorok lehetnek jelen, melyekhez a felszabadított transzmitter kötődik, így annak ingerületét befolyásolják. Ide más idegsejtekből felszabadult anyagok is kötődhetnek, melyek vagy szinaptikus kapcsolatban vannak az idegvégződéssel (axo-axonális kapcsolat), vagy nemszinaptikus kapcsolat révén (l.d. B.1.3.). A posztszinaptikus sejten, a szinaptikus membránon kívül elhelyezkedő receptorok befolyásolhatják a szinaptikus ingerületátvitel hatékonyságát, illetve ide is kötődhetnek távoli sejtek által termelt és ide diffundáló transzmitterek (nem-szinaptikus kapcsolat). A fenti szinaptikus elrendezéstől jelentős eltérések lehetnek, melyek az egyes sejttípusokra jellemzőek, a leggyakoribb az axodendritikus és axosomatikus kapcsolat, amikor a sejt axonja funkcionális kapcsolatot létesít a célsejt dendritjével, vagy sejttestjével. De ezen kívül két sejttest kapcsolata is fennállhat (somato-somatikus szinapszis), vagy dendritek között is lehet információátvitel (dendro-dendritikus szinapszis). A központi és perifériés idegrendszerben gyakori az axonokban a klasszikus szinaptikus szerveződés nélküli vezikulák csoportos jelenléte, melyek így több helyütt képesek ingerületátvitelre az axonterminálistól proximálisan (1,13,41,118) (B/1 ábra). AP VDCC VDCC Ca 2+ 1 Ca B/1. ábra A szinapszis felépítése, működése és annak szabályozása (1) neurotranszmitterek termelődése (2) vezikulumokban tárolódása (3) depolarizáció (AP) hatására feszültség-függő Ca 2+ -csatornákon (VDCC) keresztül Ca 2+ áramlik az intracelluláris térbe, melynek hatására a vezikulumok a szinaptikus résbe ürítik tartalmukat (4) a transzmitterek receptoraikhoz kötődnek (5) lebomlanak a szinaptikus résben (6) visszavételre is kerülhetnek (7) preszinaptikus receptor (8) posztszinaptikus receptor

13 B.1.2. A cochlea neurotranszmitterei és azok receptorai B Dopamin A dopaminról először azt gondolták, hogy csak a noradrenalin prekurzoraként játszik szerepet a neurotranszmisszióban, később azonban kiderült, hogy a két katecholamin eloszlása az idegrendszerben igen különböző, sőt kimutatták, hogy a központi idegrendszeri katecholaminok több mint fele dopamin (13). A dopamin szintézise L-tirozinból történik: tirozin-hidroxiláz L-DOPÁ-vá (3,4-dihidroxi-Lfenilalanin) alakítja, majd ezt a DOPA-dekarboziláz alakítja dopaminná. Ebben a folyamatban a tirozin-hidroxiláz szabályozása igen szigorú: a sejtek depolarizációjának következtében megnyíló feszültségfüggő kalcium csatornákon keresztül beáramló Ca 2+ a kalmodulinnal komplexet képez, ami aktiválja a tirozin-hidroxilázt foszforiláló protein-kinázt. Ennek a tirozin-hidroxiláznak az aktivitása a preszinaptikus D3- dopaminreceptorok szabályozása alatt áll. Az enzim a foszforilációt követően aktivizálódik. A sejtplazmában szintetizálódott dopamint a vezikulákba egy energiaigényes transzportrendszer juttatja be. A dopamin metabolizmusának egyik lehetséges útja a noradrenegr sejtekben történő noradrenalin-szintézis, melyet a dopamin- -hidroxiláz enzim végez, ez folyamat a szinaptikus vezikulákban játszódik le. A dopaminerg sejtek esetében a metabolizmus a monoamin-oxidázhoz, illetve a katekol-o-metiltranszferázhoz kapcsolódik, ilyenkor dihidroxi-fenilecetsav, illetve homovanilinsav keletkezik (1,97,200). A dopamin a pre- és posztszinaptikusan elhelyezkedő dopaminreceptorokat izgatja. A dopaminreceptorok metabotróp receptorok, működésük G fehérjéhez kötött. Molekuláris biológiai módszerekkel legalább 5 féle dopaminreceptort azonosítottak ezidáig, melyeket két nagy csoportba oszthatunk, a D1 és D2 típusúak. A D1 típusúak az adenilát-cikláz aktivációján keresztül a ciklikus adenozin-3,5 -monofoszfát (camp) szintjét megemeli, melynek hatására fehérjefoszforilációs mechanizmusok aktiválódnak a sejtekben. A D1 típusú receptorok családjába két receptor tartozik, a D1 és a D5. A D2 típusú receptorok a camp szintet csökkentik az adenilát-cikláz gátlásával, de ezen kívül a Ca 2+ -áramokat gátolják, és a K + -áramokat aktiválják, így hyperpolarizálják a 13

14 sejteket. Ide tartozik a D2 (ennek 2 fajtája van a receptor harmadik citoplazmatikus hurkának hossza alapján: D2 short és D2 long ), a D3 és a D4 receptor (13). B Glutamát A glutamát a központi idegrendszer általános excitatoros transzmittere. Tekintettel arra, hogy a glutamát a sejtek anyagcseréjében is részt vesz, egyes szinapszisokban a glutamát neurotranszmitterként való szerepének bizonyítása nem könnyű feladat. Ez az oka annak, hogy a cochleában az afferens ingerületátvezetésben betöltött szerepe a mai napig nem teljesen bizonyított, bár ez indirekt bizonyítékok következtében egyre biztosabb (részletesen l.d. B ). A glutamát több biokémiai folyamat során szintetizálódhat, melyek közül a citromsav-ciklus során és a glutaminból keletkező glutamát játszik szerepet a neurotranszmisszóban. Előbbiben kulcsfontosságú enzim a glutamát-dehidrogenáz, utóbbiban a glutamináz. A neurotranszmisszóban szerepet játszó glutamát élesen elkülönül a sejtek anyagcseréjétől, a szinaptikus vezikulákba való juttatásáért specifikus protonpumpa felelős. A neuronok depolarizációjának eredményeként a feszültségfüggő kalcium csatornákon keresztül beáramló Ca 2+ okozza a vezikulák exocitózisát, és a glutamát szinaptikus résbe való ürülését (1). A szinaptikus résből a glutamát eliminálását aktív felvételi mechanizmusok végzik: neuronális- (GLT1, GLAST) és gliális (EAAC1, EAAT4) uptake rendszerek. A glutamát metabolizmusa elsősorban a gliákban zajlik glutamin-szintetáz hatására (40). A szinaptikus résbe jutott glutamát a receptoraihoz kötődve hozza létre hatását. A glutamátreceptorokat két nagy csoportra oszthatjuk: ionotróp és metabotróp receptorokra. Az ionotróp glutamátreceptorok három csoportra oszthatók: NMDA (N-metil-D-aszpartát), AMPA ( -amino-3-hiroxi-5-metil-4-izoxazol-propionsav) és kainát receptorokra. Nevüket szelektív agonistáikról kapták. Az utóbbi kettőt farmakológiai hasonlóságuk miatt gyakran nevezik nem-nmda receptoroknak is. Az NMDA receptor egy ioncsatorna, mely aktivációjakor befele irányuló Na + - és Ca 2+ -, kifele irányuló K + -áramot hoz létre. A receptoron több kötőhely található a glutamát/nmda kötőhelyen kívül. A csatorna hatékony izgatásához elengedhetetlen a glicin-kötőhely egyidejű aktiválása. Kiemelném még a kötőhelyek közül a csatornában található gátló hatású dizocilpinről (MK-801) elnevezett MK-801 kötőhelyet. Az 14

15 NMDA receptorok különlegessége, hogy Ca 2+ -permeabilitása igen nagy. A receptor működésének fontos szabályozója egy olyan modulációs hely, melyet Ca 2+ hatására protein-kinázok foszforilálnak. A nem-nmda receptorok Na + -ra és K + -ra permeábilisek (bizonyos alegység összetétel esetén Ca 2+ -ra is), aktiválódásuk az endogén agonista kötőhelyre történő glutamát, AMPA vagy kainát bekötődéskor következik be (1,40). Kiemelendő még a GYKI-kötőhely, mely egy szelektív antagonistáról, a GYKI ról kapta nevét, melyen keresztül a receptor allosztérikusan gátolható (195,171). Az AMPA és kainát receptorok a gyors depolarizációt közvetítik a legtöbb glutamáterg szinapszisban a központi idegrendszerben. Az NMDA receptorok aktivitásához AMPA vagy kainát receptor által előidézett elődepolarizáció szükséges. Nemcsak a gyors excitatoros transzmissziót, hanem a szinaptikus plaszticitást is kötik ezen receptorok működéséhez. Az excitatoros szinapszisokban igen gyakori többféle ionotróp glutamátreceptor együttes előfordulása (13). A metabotróp receptorok több altípusát elkülönítették (mglur1-7), melyek egyik csoportjának (mglur1,5) másodlagos hírvivője a foszfatidil-inozitol rendszer, így serkentő hatású; másik csoportja (mglur2,3,4,6,7) pedig az adenilát-cikláz rendszert gátolja (40). B.1.3. Nem-szinaptikus kapcsolat A szinaptikus kapcsolattal nem rendelkező varikozitásokból felszabaduló transzmitterek az extracelluláris térben diffundálva távoli receptorokon is kifejthetik hatásukat. Az ingerület ilyen fajta terjedését nevezzük nem-szinaptikus kapcsolatnak. Többek között jellemző, hogy ebben az információtovábbítási formában az extracelluláris térben igen kicsi az ingerületátvivő anyag koncentrációja, ennek megfelelően nagyobb a receptorok érzékenysége. Ez utóbbiból következik, hogy az ilyen kapcsolatok befolyásolása az elsődleges a kisebb hatóanyag koncentrációk esetén, amely a gyógyszerek beadását követően mérhető a szövetekben (190,191,194). A cochleában több helyütt is elképzelhető a nem-szinaptikus kapcsolatok által történő kommunikáció, melyek közül kísérleteink szempontjából három fontos lehetőséget emelek ki. Kimutatták a lateralis olivocochleáris efferensek en passant 15

16 boutonjainak szinaptikus kapcsolat nélküli jelenlétét is (91,143,198), így valószínű, hogy az ezekből a boutonokból felszabaduló transzmitterek - így a dopamin is - a primer afferens rostokon kívül a neuronok sokaságán fejtik ki neuromodulátor hatásukat. Másik lehetőség, hogy a glutamát afferens rostokat érintő excitotoxicitásában (részletesen l.d. B.3.1.) nemcsak a belső szőrsejtekből felszabaduló transzmitter játszik szerepet, hanem a szinapszisokból kidiffundáló és a nem-szinaptikus utakat felhasználó glutamát is, ahogyan ezt a központi idegrendszer más területein már leírták (190,193). A harmadik lehetőség a nitrogén monoxid (NO) által mediált nem-szinaptikus kölcsönhatások (85). Az NO neuromodulátor hatását már korábban leírták a cochleában (42), tekintettel arra, hogy az NO gáz halmazállapotú mediátor, így diffúziója szabadon végbemegy a sejtmembránon, tehát a neuronok között is (55). B.2. A cochlea B.2.1. A cochlea mikroanatómiája Ebben a fejezetben a Corti szerv sokféle sejtjei közül kizárólag csak a kísérleteink szempontjából kiemelkedő jelentőségűekkel foglalkozom, így a szenzoros epitélium sejtjei közül csak a külső és belső szőrsejtekről és a támasztósejtek közül csak a Deiters sejtekről esik szó. B Perifériás hallósejtek B Belső szőrsejtek A hallás valódi receptorsejtjei a belső szőrsejtek, róluk vezetődik el az ingerület 95 %-a a központi idegrendszeri struktúrák felé a n. cochlearison (afferens idegrost) keresztül (8,42,122,161). Ezek palack alakú sejtek egy sejtsorban helyezkednek el. Széles felszínükön horizontálisan elhelyezkedő sztereociliumsor látható. A szőrök egy úgynevezett cuticularis lemezt fúrnak át, mely egy fibrosus aktint, miozint, fimbrint és kalcium-kötő fehérjét tartalmazó réteg (52,155). A sejtek magja nagy, ovális, a plazmában elszórva mitokondriumok, mikrotubulusok, lizoszómák és világos vezikulumok helyezkednek el. A kutikuláris lemez alatt egy barázdált test (striated body) van, mely a külső szőrsejtekből hiányzik (154). A plazmamembrán alatt található 16

17 egy úgynevezett felszín alatti ciszternarendszer, mely valójában nem más, mint egy módosult simafelszínű endoplazmatikus retikulumrendszer. A belső szőrsejtek bázisánál sok afferens idegvégződés látható (141). B Külső szőrsejtek: A külső szőrsejtek 3-4 sejtsorban helyezkednek el, hosszúkás alakú sejtek, melyek a Corti szervhez alapjuknál és csúcsuknál vannak rögzítve. Felszínüket szintén kutikuláris lemez fedi, melyet átfúrva, emelkednek ki a sztereociliumok, melyek W alakban helyezkednek el. A külső szőrsejtek igen prominens citoplazmatikus komponense a felszín alatti ciszternarendszer, mely az intracelluláris kalcium kompartmentalizálásában játszik igen fontos szerepet. Ezek a ciszternák a sejtek csúcsánál oválisokat képeznek, melyeket Hensen testeknek nevezünk. A sejtmag alatt a ciszternarendszer egy rétegűvé válik, melyet szubszinaptikus ciszternának hívunk. Nagy efferens szinapszisok vannak a sejtek bázisánál, melyek mellett kevés kis afferens dendrit is látható (141). A külső szőrsejtekkel szinaptizál az afferens rostok 5 %-a (42,122). A külső szőrsejtek feszültségfüggő hosszváltozásra képesek, mellyel egyrészt a cochlea erősítő funkcióját (cochlear amplifier) biztosítják, másrészt védelmet nyújt a membrana basilaris extrém kitérési ellen (20,30,31,120,127). B Deiters sejtek: A Deiters sejtek a külső szőrsejtek támasztósejtjei, melyeket kehelyszerűen vesznek körbe, phalangealis nyúlványaik révén pedig a külső szőrsejtek apikális felszínét is elektromosan elszigetelik egymástól. Mikrotubulusokat és filamentumokat tartalmaznak, melyek a Corti szerv rigiditásának fenntartásában alapvető fontosságú. (Ilyen szerepe van még a belső és külső pillérsejteknek is.) (153). Az eredeti elképzelések szerint ezek a sejtek csak támasztó funkcióval bírnak, de az utóbbi évtizedekben egyre több bizonyíték van rá, hogy más szerepük is van, nevezetesen részt vehetnek a hanginger perifériás feldolgozásában valamilyen módon. Erre utal, hogy ezek a sejtek is depolarizálhatók, illetve, hogy ezek a sejtek is kapnak efferens 17

18 beidegzést (91). Másrészről a kreatin-kináz és a tubulovezikuláris membránstruktúra arra utal, hogy esetleg a külső szőrsejt motilitásban is szerepük lehet (159,160). B Hallórostok B Afferens hallórostok Az afferens rostok, mint már arról említés esett, kb %-a a belső szőrsejtekről vezetődik el, és csak kb %-a a külső szőrsejtekről (8,42,122,161). A humán cochleában kb afferens cochleáris idegrost van (116). A belső szőrsejtekről elvezetődő rostok myelinizáltak, bipolárisak, nagy sejttestük a gangion spiraleban helyezkedik el, ezeket nevezzük I. típusú afferenseknek (105,109,162). Az I. típusú afferensekre a divergencia jellemző, azaz egy belső szőrsejtről több (kb. 20) afferens vezetődik el (164). A II. típusú afferensek kisebbek, és zömében hiányzik róluk a myelinhüvely, ezek a rostok a külső szőrsejtekről visznek információt a központ felé. Ezen rostok a külső szőrsejtekről vezetődnek el, és a Corti alagutat keresztezve csatlakoznak a többi afferenshez. Ezeknek az afferenseknek a funkciója nem tisztázott, azonban feltételezik, hogy ezek az idegek a külső szőrsejtek kontraháltsági állapotáról szállítanak információt az agyba (42). Másik elképzelés szerint ezek a rostok filogenetikai maradványok, azaz az egyedfejlődés során egy rövid időszakban ugyancsak I. típusú rostok voltak, melyek maradványai lennének a II. típusú afferensek (152). Ezekre a rostokra a konvergencia jellemző, azaz 100 külső szőrsejtről is vezethet egy rost (32). B Efferens hallórostok A cochlea efferens beidegzését elsőként Rasmussen írta le (134). Kezdetben is már kétféle, keresztezett, és keresztezetlen pályákat írtak le, pontos elkülönítésük csak később, a tracer technikák fejlődésével és elterjedésével vált lehetővé (197). Pontos funkciójukról sok adatunk van, azonban még a mai napig nem ismert teljes egészében. A cochlea efferens beidegzését két részre oszthatjuk: a laterális és a mediális olivocochlearis nyalábra (199). A lateralis olivocochlearis rostok kis fusiformis sejttestjei az azonos oldali oliva superior laterális magcsoportjaiban helyezkednek el, 18

19 míg a mediális olivocochleáris efferensek ovális, közepes és igen nagy neuronjai a mediális oliva superiorban találhatók. A lateralis efferensek többségében hüvelyezetlenek, míg a mediális köteg axonjai myelinizáltak. Az olivocochlearis nyaláb a vestibularis rosttal fut, és az Oort-féle vestibulocochlearis anasztomózis révén éri el a cochleát (163). A lateralis rendszer rostjainak %-a a homolateralis cochleába projiciál, és a belső szőrsejtek alatt az afferens idegrost dendritjén alkot úgynevezett en passant és terminális axo-dendritikus szinapszist (57,89). Az mediális olivocochlearis rostok átkereszteződést követően (IV. agykamra fenekén) zömmel az ellenoldali belsőfülbe futnak, ahol szinapszist képeznek a külső szőrsejtekkel (57,198) (B/1 táblázat). Efferens Lateralis olivocochlearis Mediális olicochlearis Sejttest Oliva superior lateralis magjai (kicsi, fusiformis sejtek) Oliva superior medialis magjai (nagy, ovális sejtek) Myelin Nincs Van Projekció Ipsilateralis cochlea Contralateralis cochlea Szinapszis Belső szőrsejt alatt az afferens dendritjén Külső szőrsejt bázisa Transzmitter Acetilkolin, GABA, Dopamin, Acetilkolin, GABA, CGRP Neuropeptidek, (CGRP, dynorfinok, encephalinok), Szerotonin B/1 táblázat Az olivocochlearis efferensek főbb jellemzőinek összefoglalása Ezeken kívül a cochlea ereinek afferens beidegzése is jelentős, melyekről az utóbbi évek tanulmányai bebizonyították, hogy trigeminális eredetűek (186,187). B.2.2. Neurotranszmisszó a cochleában (B/2 ábra) B Afferentáció A cochlea szenzoros epitéliumában a két fajta szőrsejt funkciója alapvetően eltér egymástól. A belső szőrsejtekről ugyan azt állítják, hogy a hallás valódi receptorsejtjei, mivel az afferensek %-a róluk vezetődik el (l.d. B ), azonban fontos tudni, hogy ezek valójában passzív receptorsejtek, hiszen a finom hangolást (nagyfokú szenzitivitás és frekvencia specificitás) a külső szőrsejtek biztosítják (30,120). 19

20 A belső szőrsejtekből a mechanoelektromos transzdukció eredményeként transzmitter szabadul fel, mely az afferens izgalmi állapotát hozza létre. A transzmitterfelszabadulás feltétele a felszültségfüggő kalcium csatornákon a kalciumionok sejtbe jutása (151). A mechanoszenzoros csatornákon kisfokú ionáramok azonban állandóan jelen vannak, így a feszültségfüggő kalcium csatornák valamilyen fokban állandóan aktiváltak (27,69). Ebből következik, hogy transzmitterfelszabadulás akusztikus inger nélkül is van, tehát az afferens rostoknak van nyugalmi kisülése (89,91). A szőrsejtek ingerületbe jövetele (pl. hanginger hatására), mely a szőrsejtek elhajlásának következménye a transzmitterfelszabadulás valószínűségét jelentősen megemeli. Ezzel ellentétben a sztereociliumok ellenkező irányú elhajlása a nyújtásaktivált kalciumcsatornák inaktiválását okozzák, mely a sejtek hyperpolarizációjához vezet, ez pedig a feszültségfüggő kalcium csatornákon keresztül kevesebb kalciumion beáramlást, és következményesen kevesebb transzmitterfelszabadulást eredményez. Ennek eredményeképpen az afferens rost kisebb tüzelési frekvenciája megfigyelhető (90,142). A belső szőrsejtekből felszabaduló ingerületátvivő anyag legnagyobb valószínűség szerint a glutamát, ami a központi idegrendszer általános excitatoros transzmittere (62,16,42,45,46,100,112,122128). Korábbi állatkísérletek már találtak bizonyítékokat, hogy a belső szőrsejtekből glutamát szabadul fel, de ennek transzmitter szerepét nem sikerült minden kétséget kizáróan bizonyítani. Az elmúlt évben megjelent ACh DA GABA NP 5-HT D2 nachr Lateralis Olivocochlearis Efferens Belsõ szõrsejt NMDA Glu AMPA kainát I. típusú II. típusú Afferens Külsõ szõrsejt Glu 9nAChR machr Medialis Olivocochlearis Efferens ACh GABA NP B/2 Ábra A cochlea szinapszisrendszerének összefoglalása. Részletesen l.d. a szövegben. (Rövidítések: ACh: acetilkolin, DA: dopamin, GABA: -amino-vajsav, NP: neuropeptid, 5-HT: szerotonin) 20

21 közleményben (110) arról számolnak be, hogy humán sziklacsonton végzett kísérletek során bizonyították a glutamát afferens transzmitter szerepét. Kísérleteik során monoklonális antitestekkel a belső szőrsejtek szinaptikus régiójában azonosították cadaver temporális csontokon a glutamátot, a glutamin szintetázt és egy glutamát receptor alegységet (NMDAR2). Akusztikus stimuláció alatt többször detektálták már a glutamát-felszabadulást (42,73,122), mely azonban nem meggyőző, tekintetbe véve azt, hogy az ingerlés hatására tapasztalt glutamát felszabadulását a szőrsejtek kiirtását követően is regisztrálták (15). A korábbi kísérletek hitelességét rontja az a tény is, hogy kolinerg és GABAerg szinapszisból is felszabadulhat glutamát (34). Ez a glutamát ubikviter mivoltából adódik, ugyanis ez az aminosav a szervezet metabolikus folyamataiban is részt vesz (41). Nordang és mtsai (110) kimutatták a transzmitteren kívül annak szintézisében részt vevő enzimet és egyidejűleg annak receptorát is, ami együtt meggyőzően bizonyítja annak szerepét a neurotranszmisszióban. A nagyszámú közlemény, mely a glutamát receptor antagonistákkal és agonistákkal végeztek indirekt bizonyítékokat szolgáltatnak a glutamát afferens ingerületátvivő szerepéhez (42,122). A külső szőrsejtekből felszabaduló afferens traszmitter, tekintettel arra, hogy ezeknek a sejteknek az afferentációja nem bír olyan jelentőséggel, mint a belső szőrsejteké, nem áll annyira az intenzív kutatás középpontjában. Ugyan itt is valószínű a glutamát transzmitter szerepe (4,136), és a fenti közlemény (110) utal ebben a szinapszisban is részvételére, azonban különös gondot jelent itt is a metabolikus pooltól a transzmitter pool elkülönítése. Az afferens hallórostok dendritjén levő lehetséges receptorokkal igen sok tanulmány foglalkozik (42,122,151), hiszen a belső szőrsejt és az afferens rost közötti ingerületátvitelnek igen nagy klinikai jelentősége van (B.3.). A cochleában az ionotróp glutamát receptorok mindhárom (NMDA, AMPA, kainát) fajtáját azonosították. Korábbi tanulmányok kizárták az NMDA receptorok szerepét az afferens transzmisszióban, ugyanis NMDA agonistákkal és antagonistákkal végzett kísérletek is hatástalannak bizonyultak a cochleáris potenciálokra (50,78). Ezeket a kísérleteket később nagyobb nagy intenzitású hangingerrel megismételve ennek ellenkezőjét találták, ugyanis mind az NMDA agonisták, mind az antagonisták szignifikánsan befolyásolták a szummációs akciós potenciált (124). Az utóbbi kísérletek nagyobb meggyőző erejét, azaz az erőteljesebb inger hatásosságát, az NMDA receptorok azon 21

22 tulajdonsága biztosítja, miszerint hippocampusban végzett kísérletek során bizonyították, hogy ezeknek a receptoroknak az ingerléséhez erősebb, vagy sorozatos depolarizáció szükséges (26). Az AMPA és kainát receptorok jelenlétét az afferens dendriteken ugyancsak agonistákkal (14,76,77,88) és antagonistákkal (38,42,122) végzett kísérletek bizonyították. AMPA (125) és kainát (11) intracochleáris perfúziója során a szummációs akciós potenciál változását figyelték meg, míg a szőrsejtek potenciáljai nem változtak. Az antagonisták (CNQX, DNQX) ugyancsak az afferensek akciós potenciáljait változtatták meg (92). Érdekes, hogy a glutamát receptor agonisták minden esetben a várt szummációs akciós potenciálemelkedés helyett csökkenést okoztak, amit az afferens rostok nyugalmi aktivitásának következtében kialakult serkentés utáni gátlásnak tulajdonítanak (12). Az AMPA receptorokat később molekuláris biológiai módszerekkel is kimutatták (119). A cochleában elhelyezkedő metabotróp glutamát receptorokról szóló közlemények ellentmondásosak. RT-PCR és in situ hibridizációs technikával ugyan kimutattak több fajta metabotróp receptort is az afferens hallórostok dendritjén (108), de az agonisták hatására sem a másodlagos hírvivők emelkedett szintjét, sem megváltozott cochleáris potenciálokat nem tudtak regisztrálni (122). Újabb, mikroiontoforetikus technikával végzett kísérletek során azonban igazolták az mglur1 típusú receptorok jelenlétét is az afferens transzmisszióban. Ez alapján úgy tűnik, hogy nem csak a korábban feltételezett afferens-regenerálódásában (149) van szerepük a metabotróp glutamát receptoroknak. B Efferentáció Az oliva superior mediális sejtcsoportjaiból eredő mediális olivocochlearis rostok, mint már arról esett szó zömmel az ellenoldali belsőfülbe futnak, ahol szinapszist képeznek a külső szőrsejtekkel (B ). Tekintettel arra, hogy a mediális olivocochleáris efferentáció, és a külső szőrsejtműködés nem állt kutatásaink középpontjában, és ennek irodalma igen kiterjedt, itt erről csak egy viszonylag rövid összefoglalót adok. A mediális olivocochleáris rostok és a külső szőrsejtek között a fő ingerületátvivő az acetilkolin (31,168), de CGRP (42) és GABA (49,57,169) jelenlétét is kimutatták ebben a szinapszisban. Az izolált külső szőrsejtek kísérleti létrehozása óriási lehetőséget jelentett a mediális efferensek funkciójának vizsgálatához, a külső 22

23 szőrsejteken jelenlevő receptorok, ioncsatornák azonosításához (19). Az otoakusztikus emisszió felfedezése (82) ezen rostokról további funkcionális következtetéseket enged meg. Korábban azt gondolták, hogy nikotin- és muszkarinreceptorok is jelen vannak ebben a szinapszisban, mivel mindkettő receptorfajta antagonistái hatásosan gátolták a mediális olivocochleáris aktiválására létrejövő cochleáris potenciálokat. Később a Cortiszervben egy új nikotinreceptor alegységet, az 9-et fedezték fel (39), mely a fenti farmakológiai tulajdonságoknak megfelel. Ettől függetlenül jelenleg úgy tűnik, hogy muszkarinreceptor is szerepet játszik ezen szinapszis transzmissziójában (122). A mediális olivocochleráis rostok aktivitásukkal gátolják a külső szőrsejtek motilitását, ami a cochleáris erősítést csökkentéséhez vezet (104). Ennek egyik módja lehet a potenciált mozgássá átalakító mechanizmus hatékonyságának befolyásolása (168). Ennek a motilitást gátló hatásnak a hallás fiziológiás mechanizmusában haszna is lehet, például binaurális zajos környezetben csökkenti az idegi adaptáció okozta maszkolást, vagy az auditoros válasz elnyomásával elősegíti a szelektív hallást, amennyiben a figyelem máshová irányul (63). A mediális olivocochleáris rostok a lassú motilitás módosításával befolyásolni tudják a gyors szőrsejtmozgást is (36). A lateralis olivocochleáris rostok az azonos oldali oliva superior laterális magcsoportjaiból szállítanak információt a belsőfülbe, a belső szőrsejtek alatt az afferens idegrost dendritjein alkotnak szinapszist (17,91,198). Az utóbbi 5 évben egyes tanulmányok felvetették, hogy a lateralis olivocochleáris rendszert is két részre oszthatjuk: GABAerg és kolinerg efferensekre (143,198). A belső szőrsejt és az afferens idegrost közötti szinapszis modulációját végzik ezek a rostok, a belőle felszabaduló neurotranszmitterek kotranszmissziója révén. Az itt felszabaduló transzmittereket immunhisztokémiai és folyadékszcintillációs módszerekkel azonosították, ezek az acetilkolin, a dopamin, a GABA és különböző neuropeptidek (encephalinok, dinorphinok, CGRP) (138). Ezen kívül kimutattak szerotonint is a lateralis efferensekben, de ezek szerepe jelenleg nem ismert (58). Az acetilkolinról kimutatták, hogy a belső szőrsejtek alá juttatva fokozza az afferens spontán- és glutamát-kiváltotta kisülését. Ezzel szemben GABA nem változtatta meg a spontán aktivitást, viszonyt szignifikánsan csökkentette az I. típusú afferensek stimuláció-kiváltotta tüzelését (48). Az encephalinokat immun-hisztokémiával és HPLC-vel a lateralis efferensek szinaptikus végződéseiben mutatták ki (44), dinorfinok jelenlétét radioinnumassay-vel 23

24 igazolták (68), a CGRP-t immunhisztokémiai módszerrel azonosították a lateralis olivocochlearis efferensek terminálisaiban. Saffieddine és mtsai (138) immunfluorescens kolokalizációs módszerrel valamennyi efferens transzmitter együttes jelenlétét kimutatták. A dinorfinoknak különleges szerepet tulajdonítanak a fülzúgás (tinnitus) létrejöttében. Ismert, hogy a dinorfinok a glutamát hatását az NMDA típusú receptorokon képesek potencírozni. Mivel a szőrsejtekből nyugalmi glutamát felszabadulás van, a dinorfinok fokozott felszabadulásuk révén az afferens rostok fokozottabb kisülését okozhatják, ami szubjektív tinnitusban nyilvánulhat meg (139). A dopamin cochleáris transzmitter szerepét 1978-ban Bobbin és Thompson még kizárta (16), tekintettel arra, hogy a szummációs akciós potenciálra szignifikáns hatást nem találtak. A dopamin cochleában betöltött transzmitter szerepére először Gil-Loyzaga és Praes-Herbute hívta fel a figyelmet 1989-ben magas nyomású folyadékkromatográfiával végzett tanulmányukban, amivel kimutatták dopamin jelenlétét a cochleában (60). Eybalin és mtsai (43) immunfluorescens technikával tyrozin-hidroxiláz pozitivitást, dopamin- -hidoxiláz negativitást mutattak ki a lateralis efferensek varikozitásaiban, mely szintén dopamin jelenlétére utal. Laboratóriumunkban Gáborján és mtsai (53) in vitro mikrotérfogatú perfúziós rendszerrel neurokémiai bizonyítékot szolgáltattak a dopamin felszabadulására izolált tengerimalac cochlea lateralis olivocochleáris efferenséből. Kimutatták, hogy a dopamin felszabadulását preszinaptikusan D 1 receptorok pozitívan regulálják, míg a D 2 receptor által mediált negatív feed-back hatást kizártak. RT-PCR technikát alkalmazva D 2long és D 3 receptorokat azonosítottak a cochleában (81). B A lateralis olivocochleáris efferensek védő funkciója, különös tekintettel a dopaminra A belső szőrsejtet ért akusztikus noxa, vagy ischaemia hatására abból extrém mértékű glutamát szabadul fel, ez a nervus cochlearis izgalma révén a cochleáris magvakba juttaja az ingerületet, ami átkapcsolódás után az oliva superior lateralis magvainak ingerületi állapotát okozza. Ezekből a magokból a lateralis olivocochleáris rostok a cochleába vezetik vissza az információt, mégpedig a belső szőrsejtek alatti 24

25 afferensek dendritjeihez (l.d. B ). Ezt a visszacsatoló kört nevezzük short-loop feed-back mechanizmusnak (127) (B/3 Ábra). A lateralis olivocochleáris rostoknak védő funkciót tulajdonítanak; zaj és ischemia esetén az extrém glutamát felszabadulás toxikus hatását posztszinaptikusan gátolja az afferens ideg dendritjén. Erre az első utalást Rajan tette 1985-ben (123), aki kísérleteivel bizonyította, hogy a lateralis efferens elektromos stimulációja csökkentette az intenzív hanginger kiváltotta cochleáris potenciálokat. Kimutatták, hogy intenzív akusztikus expozíció a cochlea potenciáljait jobban megváltoztatja, amennyiben az efferenseket sztrichninnel gátolják (123). Mikroiontoforetikus technikával bizonyították, hogy a dopamin magában alkalmazva nincs különösebb hatása az afferens spontán aktivitására, ezzel szemben az NMDA- és AMPA-kiváltotta tüzelést dopamin és D1, illetve D2 dopamin-receptor agonisták dózisfüggően gátolták (111). Egy D2/D3 agonista szer, a piribedil intracochleáris perfúziója során azt találták, hogy intenzív zajexpozíció alatt, illetve ischaemia előtt alkalmazva, hatásukra a cochleáris potenciálok változása szignifikánsan kisebb volt. Ezzel morfológiailag korreál, hogy a piribedil alkalmazása Glu mellett az afferens dendritek károsodása elmaradt, ugyanakkor a károsodás ugyanolyan mértékű szőrsejtek volt. Ez a kísérletsorozat arra utal, hogy a dopamin közvetlenül az afferens rostokat védő NMDA D2 funkciót kainát AMPA lát el ischaemia, illetve zajkárosodás esetén (28,29,57,131). DA Lateralis Olivoc oc hlearis Efferens B/3 Ggl. spirale Ábra A short-loop feed-back. Részletesen l.d. a szövegben. (Rövidítések: Nucl. cochl: Nucleus cochlearis, Oliva sup.: Oliva superior, DA: dopamin) Oliva sup. Nucl. cochl. 25

26 B.2.3. A szőrsejtek kalcium-homeosztázisa (B/4 ábra) A szervezetben a legtöbb biokémiai út, transzdukciós mechanizmus vagy sejtek közötti információátvitel intracelluláris szabad kalciumionok által szabályozott. Ebből adódik, hogy igen fontos a sejten belüli szabad kalciumion koncentráció szigorú regulációja. A kalcium a sejtek homeosztázisában alapvető fontosságú, így a fehérjefoszforilációban, az intracelluláris ph szint, sejtvolumen és a különböző ioncsatornák aktivitásának szabályozásában központi szerepet játszik (196). A transzdukciós mechanizmusoknak a cochleában kiemelt jelenőségük van, hiszen a hanginger elektromos jellé alakítása (mechanoelektomos transzdukció) és a külső szőrsejtek motilitása (elektromechanikus transzdukció) is ilyen folyamat. Az előbbiben fontos moduláló szerepet tölt be az intracelluláris szabad kalcium (115). Utóbbi folyamatban a lassú szőrsejtmozgásban van szerepe (167). A fenti élettani folyamatokon túl a kalcium szerepe kiemelkedő patológiás Kalciumkötő fehérjék ATP Ca 2+ Ca 2+ Protein kinázok Ligandum R Ca 2+ ADP IP 3 R ATP ADP RyR NyACs Ca 2+ Na + Ca 2+ Ca 2+ Endoplazmatikus retikulum Ca 2+ Mitokondrium Na + VDCC Ca 2+ B/4 Ábra. A szőrsejtek kalcium-homeosztázisa vázlatosan. (Rövidtések: R: receptor, NyACs: nyújtás aktivált csatorna, VDCC: feszültségfüggő kalcium csatorna, RyR: ryanodin receptor, IP 3 R: inozitol-trifoszfát receptor.) 26

27 folyamatokban is. Az intracelluláris kalciumszint emelkedése ozmotikus változásokat eredményez, melynek hatására víz áramlik a sejtekbe, mely a sejtek duzzadását, degenerációját, végül nekrózisát okozza. A tartósan magas kalciumszint olyan fehérjéket aktivál, melyek a sejt ledontását indukálják. Ezen kívül enzim túlaktiváció, szabadgyökképzés, membránkárosodás és DNS fragmentálódás következik be, mely ugyancsak sejthalálhoz vezet (47) (részletesen l.d. B.3.1.). Az intracelluláris szabad kalciumszint szabályozása a sejtekben több szinten valósul meg. Az első szint maga a plazmamembrán, ahol a beáramlás ligand aktivált kalcium csatornákon (elsősorban NMDA típusú glutamát receptorokon és nikotinreceptorokon), L-típusú feszültségfüggő kalcium csatornákon, és a szőrsejteken a nyújtás (stretch) aktivált csatornákon keresztül történik. A kiáramlás kalcium pumpákon és Na + -Ca 2+ antiporteren keresztül zajlik. A második szintet az intracelluláris kalciumkötő fehérjék és organellumok jelentik. A kalciumkötő fehérjék pufferként, transport-fehérjeként, illetve enzimaktivitás szabályozóként is szerepet játszhatnak. Az endoplazmatikus retikulum, mely igen kifejezett a szőrsejtekben (l.d. B.2.1.1), és a mitokondriumok energiaigényes folyamatokkal kompartmentalizálják a kalciumot. A kalcium felszabadulása ezekből a raktárakból jól szabályozott módon, inozitoltriszfoszfát és ryanodin receptorokon keresztül történik (196). B.3. A cochlea működése patológiás folyamatokban Ebben a fejezetben kizárólag a kutatásainkkal kapcsolatba hozható noxákkal és azok lehetséges patomechanizmusaival foglalkozom, így az ischaemia, a zaj és az aminoglikozidok által okozott cochleáris károsodásokkal. B.3.1. Ischaemiás halláskárosodás A cochlea vérellátása igen sérülékeny, az autoreguláció igen érzékeny ( ,185. Az ellátó ereken történő elégtelen keringésen kívül több tényező okozhat keringészavart, így például az endolymphahydrops is (181,184). Kimutatták, hogy ischaemiás körülmények között sejtek tartós depolarizációja következtében a glutamát felszabadulása megnövekedik az idegrendszerben (101), de a 27

28 glutamát nem-szinapikus transzmisszó útján is előidézheti hatásait (190). Ennek oka legnagyobb valószínűséggel az energiaigényes Na + /K + pumpa bénulása (140). Másrészről a glutamát neuronális és gliális visszavétele csökken, melynek oka az uptake rendszer elégtelen energiaellátásából adódik (101). Ennek a két folyamatnak az eredményeképpen a glutamátkoncentráció a szinaptikus résben extrém mértékben megnő (10 mm), ami a poszszinaptikus glutamátreceptorok fokozott ingerületét okozza. Az excitotoxicitás szempontjából kiemelkedő az ionotróp receptorok jelentősége, melyek maguk is ioncsatornák. Ezeken át nagy mennyiségű kation (elsősorban Na + és Ca 2+ ) áramlik a sejtekbe, ez az ozmolaritás szabályai szerint nagy mennyiségű vízbeáramlást okoz. Ez a vízbeáramlás a sejtek duzzadásához (101). Az NMDA receptorokon, a feszültségfüggő kalcium csatornákon belépő, illetve az intracellulárisan kompartmentalizált Ca 2+ mobilizálásával proteázok és lipázok aktiválása következik be, mely hosszú távon a sejtek irreverzibilis önemésztődéséhez vezet (2,25,40). Ez a folyamatot valószínűleg a Corti szervben is lejátszódik, a belső szőrsejtekből felszabaduló extrém mértékű glutamát (9,65,100,112,128,131130) az afferens rostok duzzadásához, degenerációjához vezet (132). Úgy tűnik, hogy elsődleges a nem-nmda receptorok aktivációja, és az NMDA receptorokon keresztül megvalósuló afferenspusztulás másodlagos (38,124). A kainát és AMPA inracochleáris alkalmazása során azonnali és jelentős afferensduzzadást észleltek (125,129), melyet nem-nmda antagonistákkal ki tudtak védeni (126). Az afferensek duzzadását humán cadaver sziklacsontokon is megfigyelték, amikor a keringés leállása és a fixálás között hosszú idő telt el (164). A dopamin lehetséges védő hatásáról és az agonista piribedilről már esett szó (B ) (B/5 A Ábra). A sejtekbe jutott kalciumionok hatására a nitrogén monoxid szintetáz (NOS) is aktiválódik, ami fokozott nitrogén monoxid (NO) produkciót eredményez (103) (B/5B, ábra). A NO neuromodulátor és neurotranszmitter szerepet is betölt a 28

29 Belsõ szõrsejt B/5 Ábra Ischaemiás K + Ischaemia ATP Na + Ca 2+ Glu Glu uptake Glu Na+ Glu Na + Ischaemia Glia Glu uptake halláskárosodás lehetséges mechanizmusa Részletesen l.d. a szövegben. Na + NOS Ca 2+ NO NMDA AMPA Na + Ca 2+ kainát Afferens cochleában (42). Izolált belső szőrsejtekből az NO felszabadulását bizonyították (170). A NO a DNS szintézist, a citromsav-ciklust és az elektrontranszport láncot is gátolja a vas-szulfid tartalmú enzimek inaktiválásával (156). A toxikus szabadgyök-képzésben is szerepet játszik az NO túlprodukciója, mivel reakcióba lép a szuperoxid anionnal (O - 2 ), és peroxinitrit anion (OONO - ) keletkezik, ami igen agresszív hidroxilionra (OH - )és nitrogén dioxidra (NO 2- ) bomlik (7). A NO a programozott sejthalált, az apoptosist is beindítja, amit pro-apoptotikus molekulák fokozott, a citoprotektív molekulák csökkent termelése, az ATP raktárak kimerítése, és katabolikus folyamatok (pl.: RNS, DNS, fehérjebontás) aktiválása közvetít (203). A NO hatására létrejövő apoptosist a ganglion spirale sejtjeiben is kimutatták (117,205). Cochleában NO- és szabadgyök-termelést kimutattak sejtaktivációt követően (74,94). Állatkísérletekben NOS inhibitorral sikerült kivédeni a baktériumtoxin által okozott cochleakárosodást (5). A NO-ról ezzel szemben kimutatták azt is, hogy a cochleáris véráramlást serkenti, szerepe központi a cochlea autoregulációs mechanizmusában (183,185). 29

30 B.3.2. Akusztikus trauma Állatkísérletekben alapvetően két folyamatot figyeltek meg az állatok zajexpozícióját követően: az egyik a szőrsejtkárosodás, a másik a primer afferens neuronok dendritjeinek destrukciója (122). A szőrsejtkárosodás a külső szőrsejtek első sorával kezdődik, melyet a belső szőrsejtsor degenerálódása követ, és legvégül figyelhető meg a második és harmadik külső szőrsejtsor pusztulása (144). A primer afferens rostok akusztikus trauma kiváltotta duzzadása, majd degenerációja és pusztulása ugyanannak a folyamatnak, azaz a glutamát excitotoxicitásnak a következménye, amit a B.3.1. pontban már kifejtettem. A két noxa, azaz az ischaemia és zajhatás, hasonló patomorfológiai következményének egyik oka a zaj hatására fellépő csökkent cochleáris véráramlás (113,172), és az endolympha oxigénszaturációjának romlása (173). Ezt több kísérletsorozat is bizonyítja. Egyrészt glutamát receptor agonistákkal végzett kísérletek a zajhatásra fellépő afferensduzzanathoz (135) hasonló morfológiai elváltozásokat tudtak létrehozni (42,122,129). Másrészt glutamát receptor antagonistákkal meg tudták akadályozni a zaj hatására kialakuló afferensduzzanatot (73,130), és a szummációs akciós potenciálértékek is kevésbé változtak (83,122,148). B.3.3. Aminoglikozid ototoxicitás Az aminoglikozid antibiotikumok gram-negatív baktériumok ellen hatékonyak. Támadáspontjuk többes, egyrészt a fehérjeszintézist gátolják a bakteriális riboszómákhoz való kötődés révén, másrészt foszfolipidekhez is kötődnek, amivel membránkárosodást is létrehoznak, harmadrészt szabadgyökképzés révén a fehérje-, zsír- és DNS-katabolizmust is indukálnak (66). Ezek a folyamatok nem kizárólag a baktériumokban, de a gazdaszervezetben is lejátszódhatnak (93). Bár ezeknek a gyógyszereknek az oto- és nefrotoxicitása jól ismert, a klinikai gyakorlat még a mai napig rákényszeríti az orvosokat az aminoglikozidok használatára súlyos gram-negatív fertőzésekben. Az ototoxikus antibiotikumok egy csoportja főleg vesztibulotoxikus, mint pl.: a streptomycin és a gentamicin, másik részük inkább cochleáris károsodást idéz elő, ilyenek az amikacin, a kanamycin és a neomycin (23). 30

31 Ezeknek az antibiotikumoknak nagy dózisa a legtöbb emberben toxikus, de egyes családokban már kis koncentrációk is halláskárosodást, süketséget okozhatnak (51). Az ototoxikus halláskárosodáshoz való genetikai fogékonyság intenzív kutatások tárgyát képezi, feltételezik egy öröklött mutáció szerepét. Kínai családokban, akiknél halmozottan fordult elő aminoglikozidok által indukált halláskárosodás, a mitokondriális 12S rrns gén A1555G mutációját találták (121). Az aminoglikozidok által okozott halláskárosodás magas frekvenciákon kezdődik, és a progresszív, irreverzibilis külső szőrsejt-pusztulás a csiga bázisánál jól ismert tény (37,146,157). A belső szőrsejtek kevésbé tűnnek érzékenynek az aminoglikozidokra, bár amikacin hatására kimutattak ennek a sejttípusnak a degenerációját is. Elektromikroszkópos tanulmányok az érzékhám pontos károsodási sorrendjét mutatták ki. A szőrsejtek sztereociliumainak disztorziója, fúziója, majd elvesztése a sejttest pusztulásához vezet. A Deiters sejtek nyúlványai is eltűnnek. A külső szőrsejtek károsodása az első sorban kezdődik, majd a második és harmadik sorok is degenerálódnak. A szőrsejtek helyét támasztósejtek, főleg pillér- és Deiters sejtek foglalják el (150). A fenti morfológiai eltérésekkel párhuzamosan a funkcióban bekövetkező károsodások is megfigyelhetők: a cochleáris mikrofónia csökken, majd később irreverzibilis küszöbemelkedés következik be (137). Tekintettel arra, hogy elődlegesen külső szőrsejt-károsodás lép fel, az otoakusztikus emisszóban is eltéréseket regisztráltak aminoglikozidkezelést követően: a tranziens- és disztorziós kombinációs otoakusztikus emisszió amplitúdók megváltoztak. A morfológiai elváltozásokat követve kezdetben a magas, majd az alacsonyabb frekvenciatartományok komponensei változtak (80). 31

32 C. Célkitűzések I. Ischaemiás modell felállítása a cochleában Az irodalomban elsőként Intézetünkben sikerült in vitro mikroperfúziós módszerrel neurofarmakológiai bizonyítékot szolgáltatni a dopamin neurotranszmitter szerepéről (53). Izolált tengerimalac cochleán végzett, in vitro kísérleteinkkel (1) egyrészt további bizonyítékokat akartunk szolgáltatni a dopamin neurális eredetéről, (2) másrészt arra kerestük a választ, hogy gyógyszeresen modellezett zaj és ischaemia hatására a cochleában valóban emelkedik-e a dopamin felszabadulása. Korábbi kísérletekben igazolták, hogy az ischaemia (hypoglikémia + hypoxia) hatására létrejövő, főleg citoplazmatikus eredetű transzmitterfelszabadulást a kalciumiontól független intracelluláris nátriumion-szint emelkedés okozza (102). A veratridin egy neurotoxikus, nátrium-csatorna aktiváló szer, alkalmazása intracelluláris nátriumion koncentráció emelkedést okoz, hatását kizárólag depolarizálható sejtmembránokon hozza létre, azaz csak neuronális sejteken hat (22,21,33,175). A veratridin tehát ischaemiához hasonló intracelluláris viszonyokat teremt, és egyben alkalmas a dopamin neuronális eredetének igazolására. (3) Továbbá azt szerettük volna megvizsgálni, hogy gyógyszeresen befolyásolható-e a dopamin felszabadulása, mely a későbbiekben esetleg terápiás lehetőségekkel is kecsegtet. Kimutatták, hogy a központi idegrendszerben több helyen a glutamát receptorok izgatása a dopamin felszabadulását eredményezi (24,71,84). Idáig az irodalomban nem találtunk utalást arra, hogy a (4) cochleáris dopamin felszabadulásában az ionotróp glutamát receptorok szerepet játszanak-e, ezért erre is választ kerestünk kísérleteinkben. A glutamát receptor antagonisták alkalmazásának másik célja az volt, hogy kimutassuk, vagy kizárjuk a belsőfülben egy a cochleán belüli, visszacsatolási mechanizmus jelenlétét, mely védelmet biztosítana a külső noxák következtében létrejövő glutamát okozta excitotoxicitás ellen. Elképzeléseink szerint ennek lényege a belső szőrsejtekből felszabaduló glutamátnak a laterális olivocochleáris efferensre való közvetlen hatására létrejött dopamin felszabadulás lenne. II. A dopamin és glutamát felszabadulásának szimultán mérése a cochleából (5) Célunk volt egy új módszer beállítása, melynek segítségével izolált tengerimalac cochleából in vitro mikroperfúziós módszer segítségével párhuzamosan 32

33 detektálhatóvá válik a dopamin és a glutamát felszabadulása. Ezek során a kísérletek során a tetrodoxin, ami egy feszültségfüggő nátrium-csatorna gátló szer, alkalmazásával bizonyítani akartuk mind a dopamin, mind a glutamát neuronális eredetét. Ismert a dopamin posztszinaptikus gátló hatása a glutamáterg sejtekre (42,57,59,111,112,122,127). (6) A dopamin agonistával és antagonistával végzett kísérleteink során arra kerestük a válasz, hogy a glutmát felszabadulására hatással van-e a dopamin. III. Aminoglikozid antibiotikumok új hatásmechanizmusa Az aminoglikozid antibiotikumok ototoxikus hatásának több mechanizmusa ismert (42,107,133,145). (7) Kísérleteinkkel az aminoglikozidok hatását vizsgáltuk a dopamin felszabadulására. Figyelembe véve, hogy a dopaminnak ischaemia és zaj esetén védő szerepet tulajdonítanak (28,29,57,59,111,122,123,127,128,130), az aminoglikozidok káros hatásának megértésében a dopamin-felszabadulás gátlása új patfiziológiai utat jelenthet. IV. Intracelluláris kalciummérés intakt Corti szerven (8) Végül jelenleg is folyó kísérleteinkben a fenti folyamatok intracelluláris mechanizmusainak jobb megértését tűztük ki célul. Ennek érdekében egy olyan preparátumot létrehozásán dolgoztunk, mely elsőként lehetőséget teremt a halló érzékhám különböző sejtjeiek intracelluláris kalciumion-koncentrációjának mérésére. Mindezt olyan körülmények között kívántuk elérni, melyben a sejtek saját környezetükben vizsgálhatók, nem elveszítve a más sejtekkel fennálló kapcsolataikat. 33

34 D. Anyag és módszer D.1. Állatok Kísérleteinkhez pigmentált, gramm súlyú, hím tengeri malacot használtunk, melyeket a Humán Rt-től (Gödöllő) szereztünk be. Az állatok felhasználásakor a National Institute of Health erre vonatkozó irányadóját figyelembe véve mindvégig az állatok szenvedésének minimalizálására törekedtünk. A kísérleteket a Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézetének Állateikai Kódexe alapján végeztük. D.2. Felhasznált anyagok Kísérleteinkhez fiziológiáshoz hasonló, perilympha-szerű oldatot használtunk (70), melynek összetétele a következő volt: 150 mm NaCl, 3,5 mm KCl, 1 mm CaCl, 1 mm MgCl, 2,75 mm HEPES, 2,25 mm Tris-OH. Az oldat vegyhatását sósav hozzáadásával 7,4-re korrigáltuk, ozmolaritását 300 mosm/kg H 2 O-re titráltuk,dglükóz hozzáadásával. Kísérleteinket mindvégig 37 o C-on termoregulált körülmények között 100 %-os O 2 szaturáció mellett végeztük. Az alkalmazott tetrodotoxin (TTX), veratridin, dizocilpin (MK-801), GYKI , szulpirid, bromokriptin mezilát, neomycin szulfát, gentamicin szulfát és kanamycin A vegyületeket a Sigma (St.Louis, MO, USA) gyártotta. A [7.8-3 H]- dopamint (specifikus activitás: 1.81 TBq/mmol, 49.0 Ci/mmol) az Amersham International (Anglia) állította elő. Az intracelluláris kalciumkoncentráció méréséhez fura-2/am-et és 0,025% (w/v) Pluronic F-127 detergenst használtunk. D.3. Izolált tengerimalac cochlea preparátum (D/1 ábra) A tengeri malacok dekapitálása után, a nyaki csigolyákat eltávolítottuk. Az occipitális csontot szabaddá preparáltuk, majd a koponyán a foramen magnumból kiinduló sagittalis metszést ejtettünk. Az emberi os temporale pars petrosájának megfelelő csontos bulla tympanit kiemeltük, és felnyitottuk. A további preparálást 34

35 perilympha-szerű oldatban végeztük (összetételét l.d. D.2.). Sztereómikroszkópos szemellenőrzés mellett a cochleáról a borító mucoperiosteumot eltávolítottuk, majd a csiga csontos vázát körkörösen lepattintottuk, a stria vascularist lefejtettük, a modiolust a cochlea bázisánál eltörtük. Az így nyert preparátumunk az alábbi idegi struktúrákat tartalmazta: a ganglion spiralet, az afferens hallórostokat, az efferens idegek axonjait és axon terminálisait, illetve a belső- és külső szőrsejteket. A B C D D/1 ábra A. A kinyitott bulla tympaniban látható a nyálkahártyával fedett csiga. B. A csiga csontos tokjának lepattintásával láthatóvá válnak a csiga kanyarulatai, annak szélén a stria vasularissal (fekete nyíl). C. A stria vascularist lefejtettük. D. A modiolust eltörtük csiga bázisánál, az így létrejött preparátumbanaz érzékhám vizsgálata elérhetővé vált. 35

36 D.4. Dopamin felszabadulásának mérése D.4.1. In vitro, mikrotérfogatú perfúziós módszer (192)(D/2 ábra) A fent leírt módon elkészített preparátumainkat 1 ml perilympha-szerű oldatba helyeztük, melyhez 10 M trícium izotóppal jelölt dopamint adtunk. Egy órás inkubációt követően a cochlea-preparátumokat egyenként 100 M belső térfogatú plexiüveg kamrákba helyeztük. Ezt követően 0,3 ml/perc áramlási sebességgel a kamrákat perilympha-oldattal áramoltattuk át. Egy órás előperfúziót követően a kifolyót 3 perces frakciókba gyűjtöttük, melyek mindegyike így 0,9 ml-t tartalmaz a kifolyóból. Az inkubáció, az előperfúzió és a perfúzió során mindvégig 100% O 2 -nel szaturáltuk az oldatot és a hőmérsékletet 37 o C-on tartottuk. 20 frakció összegyűjtését követően a cochlea preparátumokat a perfúziós kamrákból kivettük és 0,5 ml 10 %-os triklórecetsavba helyeztük egy napra, majd 100 l-t lemértünk szöveti radioaktivitásként. Az egyes frakciók rádióaktivitásának meghatározásához azok 0,5 mlét 2ml szcintilliációs koktéllal (Ultima GOLD, Packard, USA) kevertük össze, majd folyadék szcintillációs spektrometriával mértük meg, melyhez Packard TR 1900 (USA) készüléket használtunk. Az egyes frakciókra jutó dopamin-felszabadulást az egész szövet radioaktivitásának az adott frakcióra jutó aktivitásának arányaként határoztuk D/2 Ábra Az in vitro preparátum mikrotérfogatú perfúziós rendszer 5 (1- perfúziós oldat, 2- perfúziós pumpa, termosztát, 4- mikrotérfogatú kamra, elektromos ingerlő elektródák, 6- meg. mintagyűjtés, az áramlás irányát nyilak jelzik) 36

37 D.4.2. A perfundált szövet ingerlése D Elektromos téringerlés Elektromos téringerlést a szövetet tartalmazó kamra alsó és felső pólusába épített platina elektródokon át alkalmaztunk 3 percen át 60 V feszültséggel, 2 Hz-es frekvenciával 0,5 ms-os időtartamig (Grass S88, USA), így egy ingerlési periódus 360 négyszögimpulzust tartalmazott. Az elektromos téringerlést általában a 3. és 13. mintagyűjtési periódus alatt alkalmaztuk. Egyek kísérletekben kizárólag a 3. periódus alatt ingereltünk, míg bizonyos kísérletek során nem végeztünk elektromos ingerlést. D Veratridin-ingerlés Azokban a kísérletekben, melyekben csak a 3. mintagyűjtési periódus alatt alkalmaztunk elektromos téringerlést, ott a perfundált szövetet a 8-10 periódusok alatt 30 µm veratridint tartalmazó oldattal ingereltük. Azokban az esetekben, mikor nem végeztünk elektromos téringerlést, a szövetet a 3-5. frakció alatt ingereltük veratridinnel. D.4.3. Drogok hozzáadása A kísérletek legnagyobb részében, amikor elektromos téringerlést alkalmaztunk, a vizsgált drogot a két ingerlés között adtuk a perfundáló oldathoz (6. frakció), és azt a mintagyűjtés végéig alkalmaztuk. A glutamát receptor antagonistákat ettől eltérően a mintagyűjtés előtt 6 perccel, tehát még az előperfúzió alatt a rendszerhez adtuk. A veratridin-ingerlés eseteiben az antagonistákat és a TTX-t a stimuláció előtt 2 frakcióval kezdtük alkalmazni és a veratridinnel egyidőben függesztettük fel. D.4.4. A felszabadult dopamin mennyiségének értékelése Az elektromos téringerlés által kiváltott felszabadulását a következők szerint számítottuk ki: az ingerlés előtt (2., 12. frakció) és után (6., 16. frakció) mért bazális kiáramlás átlagát kivontuk a stimuláció hatására létrejött teljes radioaktív kiáramlásból. 37

38 Ezzel a módszerrel görbe alatti területet számoltunk (FRS 1 és FRS 2 ) (D/3 A ábra). A drogok perfundáló oldathoz való adása előtti és utáni stimuláció-kiváltotta dopaminkiáramlások arányit kiszámítottuk (FRS 2 /FRS 1 ), és a kontrollhoz hasonlítottuk. A nyugalmi dopamin-felszabadulásának változását a frakciók átlagának (FRR 2 ) és az 1-2. frakciók átlagának (FRR 1 ) hányadosával fejeztük ki (FRR 2 /FRR 1 )(D/3 A ábra). A veratridinnel történt ingerlés esetén a görbe alatti területet (FRS ver ) a veratridin-hatás alatti és az összes radioaktivitás-kiáramlás különbségéből számítottuk ki (D/3 B ábra). 4 3 fr (%) 2 FRS ver 1 0 S 1 S ver minta fr (%) 8 6 FRS FRR 1 FRS 1 FRR2 minta S 1 S 2 D/3 ábra Stimuláció hatására felszabaduló dopamin mennyiségének értékelése. Az fr(%) a frakcionális felszabadulást jelzi, mely az adott minta radioaktivitását jelenti a szövet radioaktivitásának arányában. Az S 1 és S 2 az elektromos téringerlést, az S ver a veratridin-ingerlést jelzi. Az FRR 1 és FRR 2 a nyugalmi dopamin-felszabadulást jelenti. Az időegység alatt felszabaduló radioaktivitásból kivontuk a nyugalmi kiáramlást, és így megkaptuk a görbe alatti területeket (FRS 1, FRS 2, FRS ver ). 38

39 D.5. Glutamát és dopamin felszabadulásának párhuzamos mérése Ebben a kísérletsorozatban a perfundáló oldatokat baktériumszűrőn áramoltattuk át a kísérletek előtt, majd steril edényekben tároltuk. A perfúziós rendszert sterilizáltuk a kísérletek előtt, a kifolyó mintákat sterilizált kémcsövekbe fogtuk fel, és glutamát meghatározásra szánt mintákat azonnal szárazjégbe helyeztük, majd 70 o C-on tároltuk a magas nyomású folyadékkromatográfiás mérésekig. D.5.1. In vitro, mikrotérfogatú perfúziós módszer módosítása A cochlea-preparátumokat [ 3 H]dopaminnal inkubáltuk, majd előperfúziót követően in vitro mikrotérfogatú perfúziós rendszer kamráiba helyeztük a már leírt módon (l.d. D.4.1.), azzal a különbséggel, hogy a frakciókat csak 24 percig gyűjtöttük (8 minta). A 0,9 ml-es frakciókból (3 perc alatt 0,3 ml/perc sebességgel kifolyó) 0,5 mlt folyadék szcintillációs spektrometriás dopamin-meghatározásra, a fennmaradó 0,4 ml-t pedig magas nyomású folyadékkromatográfiás glutamát meghatározásra használtunk fel. D.5.2. Magas nyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) glutamát meghatározás (158) A kifolyók 0,4 ml-ét használtuk a glutamát tartalom meghatározására, melyhez egy Gilson folyadékkromatográfiás rendszert használtunk (Gilson Medical Electronics Inc., Middleton, WI, USA). Az aminosavak szeparálását egy 3 µm-es Nucleosil C-18 oszlopon végeztük, mely 150 x 4,6 mm nagyságú volt. A koncentrációkat egy belső standardot használó két-pontos kalibrációs görbével határoztuk meg. Az oszlopot ezt követően A oldattal ekvilibráltuk, mely 11,25 % metanol-acetonitrilt (3,5:1 v/v) tartalmazott 0,01 M-os kálium foszfát pufferben (ph=7,2). A mobilis B fázis 22,2 % acetonitrilt tartalmazott metanolban (95). Az analízist 1,0 ml/perc áramlási sebesség mellet végeztük. A perfúziós oldatot 3000 g-vel centrifugáltuk 15 percig 0-4 o C-on, a felülúszót 70 o C-on tartottuk az analízisig. A derivatizációt 50µl OPA (o-ftaldialdehid) és 200 µl minta összekeverésével végeztük, melyhez belső standardként 50µl 2µM-os 39

40 -amino-zsírsavat adtunk 2 perccel az oszlopra injektálás előtt. Az egyensúly beállta után az így kapott származékból 200µl térfogatot az oszlopra töltöttünk, és A pufferrel átmostuk, majd az oszlopot az elemzőbe helyeztük. A derivatizációt és a dúsítást speciális programmal végeztük. D.5.3. Drogok hozzáadása Az glutamát méréses kísérletsorozatban a felhasznált drogokat (TTX, szulpirid, bromokriptin mezilát) 6 perccel a mintagyűjtés előtt (az előperfúzió alatt) adtuk a perfundáló oldathoz és a kísérlet végéig alkalmaztuk. D.5.4. Elektromos téringerlés Azokban a kísérletekben, melyekben a dopamin felszabadulással párhuzamosan glutamát koncentrációmérés is történt, ott az ingerlési paraméterek a következők voltak: 3 perc alatt 60 V feszültséggel, 10 Hz frekvenciával és 2 ms időtartammal 1800 impulzust alkalmaztunk. D.6. Aminoglikozid antibiotikumok hatásának vizsgálata a dopamin felszabadulására D.6.1. Akut hatás vizsgálata Az aminoglikozid antibiotikumok akut hatásának vizsgálatakor a D.4.1. fejezetben leírt módon in vitro, mikrotérfogatú perfúziós módszert alkalmaztunk. A kifolyót 20 x 3 perces frakcióban foguk fel, elektromos téringerlést a 3. és 13. mintagyűjtési periódus alatt alkalmaztunk. Az aminoglikozid antibiotikumokat (neomycin, gentamicin, kanamycin) a 6. frakció alatt adtuk a perfúziós folyadékhoz és a kísérlet végéig alkalmaztuk. Kísérleteink eredményeit a D.4.4. pontban leírtak szerint értékeltük. 40

41 D.6.2. Krónikus neomycin kezelés A krónikus kezelés során a tengerimalacok 14 napon keresztül 50 mg/kg/die neomycint kaptak szubkután, majd a 15. napon a már leírt módon (D.3.) cochleájukat izoláltuk. Ezt követően in vitro mikrotérfogatú perfúziós módszer segítségével, a D.6.1. fejezetben leírtak szerint vizsgáltuk a dopamin felszabadulását elektromos téringerlés hatására, neomycin különböző koncentrációjú (30, 100, 300, 1000 µm) oldatainak a jelenlétében. D.7. Szőrsejtek intracelluláris Ca 2+ -koncentrációjának vizsgálata intakt tengerimalac Corti-szerven D.7.1. Corti szerv preparálása A preparálásnál a D.3. pontban leírtakhoz lényegében hasonlóan jártunk el, azzal a kivétellel, hogy a csiga csontos vázát nem teljesen pattintottuk le, hanem csak a csúcsi részről távolítottuk el a csontot. A stria vascularist nem fejtettük le, és a modiolust a cochlea bázisánál nem törtük el. Az érzékhám felületének óvatos scarificálásával távolítottuk el a Reissner membránt és a membrana tectoriát. D.7.2. Intracelluláris Ca 2+ -mérés A preparátumunkat 10 µm fura-2/am és 0,025% (w/v) Pluronic F-127 detergenst tartalmazó perilympha-szerű oldattal töltöttük szobahőmérsékleten, sötétkamrában, folyamatos rázást biztosítva 60 percig. A töltés alatt 100 % O 2 -nel szaturáltattuk az oldatot. Ezt követően az extracelluláris kalciumfestéket kimostuk, és 20 percig az oldatban hagytuk a preparátumunkat deészterifikálás végett. A preparátumot perfundáló kamrában rögzítettük úgy, hogy a kifejtett cochlea részlet legyen felül, majd ezt Gibraltar BX1 (Burleigh) asztalon rögzítettük, és 40X vízimmerziós objektívvel vizsgáltuk Olympus BX51 WI mikroszkópon. A perfúziós kamrát 2 ml/perc sebességgel áramoltattuk át perilympha-szerű oldattal. A preparátumot 340 és 380 nm-es ultraibolya (UV) fénnyel gerjesztettük, melyet egy T.I.L.L. Polychrome II monokromátorral állítottunk elő. Az UV megvilágítást egy, a fény útjába 41

42 állított, változtatható diafragmával szabályoztuk. Az emittált fényt ( = nm) egy hűtött CCD kamerával (Photometrics Quantix) detektáltuk, melyet az Axon Imaging Workbanch 2.2 software-rel végeztük. Ingerléshez a perfundáló folyadékhoz adott 100 mm koncentrációjú kálium klorid (KCl) oldatot használtunk. Az intracelluláris kalciumion-koncentrációt az alábbi képlet segítségével számítottuk ki: Ca 2+ i = K d x F 380 max /F 380 min x (R-R min )/(R max -R) ahol az R a 340 nm-es és 380 nm-es gerjesztés alatti emisszió-intenzitások hányadosa; az R min a szabad Ca 2+ -mentes közegben számított hányados, az R max a magas Ca 2+ -os közegben mért hányad; az F 380 max a fluoreszcens intenzitás 380 nm-es gerjesztéskor, Ca 2+ -mentes közegben; az F 380 min ugyanez az érték magas Ca 2+ -os közegben. A sejtek intenzitás-értékeit korrigáltuk az fura-2-vel töltött sejt közelében mért aktuális háttérintenzitással. A rendszert jellemző K d, F 380 max /F 380 min, R min and R max paramétereket empirikusan határoztuk meg a Calcium Calibration Buffer Kit with Magnesium #2 alapján, és az alábbi értékekkel számoltunk: K d = 197 ± 7 nm, F max /F min = 8,51 ± 0,27, R min = 0,29 ± 0,01 és R max = 5,14 ± 0,20 (n = 4). D.8. Statisztikai analízis Az értékeket átlag S.E.M.-ként adtuk meg. Az n a cochleák számát jelenti. A statisztikai analízist ANOVA teszttel végeztük. Newman-Keuls vagy Tukey-féle post hoc tesztet alkalmaztunk a szignifikancia meghatározásához A szignifikancia mértékét a következők szerint határoztuk meg: *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,

43 E. Eredmények E.1. Ischaemiás modell hatása a dopamin felszabadulására E.1.1. Kontroll kísérletek A [ 3 H]dopamin nyugalmi felszabadulása (az első két minta átlaga) a kontroll kísérletek kezdetekor ,13 %-a volt a teljes szöveti radioaktivitásnak. A 11. és 12. minták átlaga 1,13 0,08 % volt, ugyanez az érték a a frakciókor 1,06 0,07 % volt, melyből látható, hogy a kísérlet során mindvégig konstans maradt a bazális dopamin kiáramlás. Az elektromos téringerlés hatására a [ 3 H]dopamin felszabadulása szignifikánsan megemelkedett. Az első stimuláció (S 1 ) hatására a szöveti radioaktivitás 4,12 0,22 %- a szabadult fel (FRS 1 ), a másodikra (S 2 ) 3,61 0,35 % (FRS 2 ). Az első és második stimuláció hatásai között nem volt szignifikáns különbség (p>0,05), az FRS 2 /FRS 1 hányados volt, mely azt jelzi, hogy a téringerlés hatása reprodukálható (E/1 ábra). E.1.2. Veratridin hatása különböző koncentrációkban A veratridin egy nátrium-csatorna aktivátor, neurotoxikus szer, mely az ingerelhető sejtek membránját depolarizálja, tehát csak idegi struktúrákon hatásos (21,22,33,175). Korábbi kísérletek bizonyították, hogy ischaemia hatására a sejtekben nátrium koncentrációja jelentősen megemelkedik, mely felelős a transzmitterek kalcium-független felszabadulásáért, illetve az axonális tüzeléssel összefüggő felszabadulás-gátlásért (102). Ebből adódóan feltételezhető, hogy a veratridin az ischaemiához hasonló állapotot hoz létre. Kísérleteinkben a kisebb (10 M) veratridin koncentráció kisebb mértékben emelte meg a [ 3 H]dopamin nyugalmi felszabadulását (FRR 2 / FRR 1 = 1,06 0,13, p>0,05), hatására azonban jelentősen növekedett az elektromos ingerlés hatására létrejött kiáramlás (FRS 2 /FRS 1 = 5,00 0,65, p<0,05). 43

44 arány *** *** 6 kontroll Ver - 10 µm 5 Ver - 30 µm fr (%) 4 3 *** 8 6 ver FRS 2 /FRS 1 FRR 2 /FRR S 1 S 2 ver-10 kontroll minta veratridin E/1 ábra A kontroll kísérletek során jól reprodukálható csúcsokat kaptunk elektromos stimuláció hatására. A 10 és 30 µm-os veratridin perfúziója szignifikánsan megemelte a stimuláció-kiváltotta [ 3 H]dopamin felszabadulást. A nyugalmi kiáramlást szignifikánsan csak a nagyobb koncentrációjú veratridin oldat befolyásolta. Konc. n FRS 2 /FRS 1 p (kontrollal FRR 2 /FRR 1 p (kontrollal ( M) szemben) szemben) Kontroll Veratridin Veratridin E/1 táblázat A kontrollhoz képest mind a két koncentrációjú oldat szignifikánsan megemelte az elektromos téringerlés kiváltotta [ 3 H]dopamin felszabadulást, de csak a 30 µm koncentrációjú veratridin okozott szignifikáns emelkedést a bazális kiáramlásban. 30 M veratridin szignifikánsan hatott a dopamin bazális felszabadulására (FRR 2 /FRR 1 = 2,26 0,06, p<0,05), és az elektromos stimulálás hatására a dopaminkiáramlás még ezt követően tovább emelkedett, így az ingerlés hatására létrejött 44

45 felszabadulás-növekedés szignifikáns volt (FRS 2 /FRS 1 = 4,28 0,75, p<0,05) (E/1 ábra, E/1 táblázat). E.1.3. Veratridin hatásának gátlása tetrodotoxinnal Ebben a kísérletsorozatban a 3. frakció alatt alkalmaztunk belső kontrollként elektromos ingerlést (S 1 ) a fenti paraméterekkel (D ), majd a 8. és 12. mintaszedési periódusban, tehát nem elektromos ingerléssel egyidőben, 30 M koncentrációjú veratridint tartalmazó perfundáló oldattal áramoltattunk át (FRS ver ). Ezekkel a kísérletekkel a veratridin hatására létrejövő, reverzibilis, szignifikáns, nyugalmi dopamin-felszabadulást tanulmányoztuk (FRS ver =5,69 0,54%) fr (%) Ver-30 +TTX S 1 S ver TTX E/2 ábra A kontroll elektromos stimuláció után 30 µm veratridinnel ingereltük a szövetet, melynek hatására ugyancsak szignifikánsan megemelkedett a [ 3 H]dopamin felszabadulás. Ezt az emelkedést teljes mértékben antagonizálta a tetrodotoxin. Ezt követően a fenti ingerlés után tetrodotoxint (TTX) adtunk a perfundáló folyadékhoz 1 M koncentrációban a frakciók alatt, tehát a veratridin alkalmazása előtt 2 frakción át, illetve azzal párhuzamosan. A non-szelektív Na + -csatorna blokkoló TTX teljes mértékben antagonizálta a veratridin hatását, bizonyítva ezzel a dopamin neuronális eredetét (FRS ver =0,16 0,06, p<0,001) (E/2 ábra, E/2 táblázat). Az elektromos téringerlést belső kontrollként használtuk, tekintettel arra, hogy a TTX teljes mértékben meggátolta a veratridin hatását, így bizonyosodtunk meg arról, hogy a szövet válaszadó képessége azonos volt a kontrolléval. 45 minták

46 E.1.4. Glutamát receptor antagonisták hatása a dopamin felszabadulására Ismert, hogy a veratridin képes glutamátot felszabadítani, mely preszinaptikus ionotróp receptorokon hatva más transzmitterek felszabadulását okozza (195). NMDA és non-nmda receptor antagonistákat használtunk, hogy kizárjuk a veratridin indirekt hatását, mely dopamin felszabaduláshoz vezethet. Kísérleteinkben alkalmazott dizocilpin (MK-801) egy szelektív, nem-kompetitív NMDA-receptor antagonista (84). A GYKI bizonyítottan szelektíven gátolja a nem-nmda-receptor-mediálta idegi depolarizációt in vivo és in vitro (195). Ebből következik, hogy a kísérleteink során alkalmazott GluR antagonisták lefedik az ionotróp glutamát receptorok teljes skáláját. A glutamát receptor antagonistákkal (GluR) végzett első kísérletsorozathoz nem használtunk elektromos stimulációt. Kontrollként, a 6-8. frakció alatt áramoltattuk át a cochlea preparátumot 30 M veratridin-tartalmú oldattal, mely a már említett módon megemelte a dopamin kiáramlását. Ezt követően GluR antagonistákat alkalmaztunk a veratridin ingerlés előtt és alatt, a 4-8. frakciók alatt. Azt tapasztaltuk, hogy sem az NMDA-receptor antagonista dizocilpin (3 M) (FRS ver =4,46 0,50, ns), sem pedig a nem-nmda-receptor antagonista GYKI (100 M) (FRS ver =4,68 1,27, ns) nem befolyásolta a veratridin-kiváltotta dopamin-felszabadulást (E/3 A,B ábra, E/2 táblázat). Konc. ( M) n FRS ver p (veratridinnel szemben) Veratridin ,69 0,54 + TTX 1 4 0,16 0, dizocilpin 3 4 4,46 0, GYKI ,68 1, E/2 Táblázat A TTX a veratridin által okozott [ 3 H]dopamin felszabadulás-emelkedést teljes mértékben meggátolta, ezzel szemben a GluR antagonisták szignifikánsan nem változtattak azon. 46

47 A második kísérleti felállásban az E.1.2. fejezetben leírt kísérletsorozathoz hasonlóan elektromos ingerlést a 3. és 13. frakció alatt alkalmaztunk, veratridint a 6. frakciótól a kísérlet végéig adtunk a perfúziós folyadékhoz 30 M koncentrációban. A GluR antagonistákat a frakciószedést megelőzően 6 perccel, azaz még az előperfúzió ideje alatt adtuk az átáramoltató folyadékhoz, és akárcsak a veratridint, a kísérlet végéig alkalmaztuk. Ezekben a kísérletekben szintén hatástalannak találtuk a GluR antagonistákat: sem a bazális sem pedig a veratridin + elektromos ingerlés kiváltotta [ 3 H]dopamin-felszabadulást nem befolyásolták. A veratridin és az elektromos stimuláció kiváltotta felszabaduláshoz (FRS 2 /FRS 1 = 4,28 0,75) képest a dizocilpine (3 M) (FRS 2 /FRS 1 =3,96 0,76, ns), vagy a GYKI (100 M) (FRS 2 /FRS 1 =2,88 0,60, ns) nem okozott szignifikáns változást (E/3 C,D ábra, E/3 táblázat). Konc. ( M) n FRS 2 /FRS 1 p (veratridinnel szemben) Veratridin Dizocilpin GYKI E/3 táblázat A veratridin-kiváltotta [ 3 H]dopamin-felszabadulásra nem volt szignifikáns hatással egyik GluR antagonista sem. 47

48 A 4,0 3,5 3,0 fr (%) Ver-30 GYKI MK801 3,0 2,0 B FRS ver 2,5 2,0 1,0 1,5 1,0 C minta fr (%) Ver-30 MK801 GYKI 0,0 6 4 D arány Ver-30 MK801 GYKI52466 Ver-30 MK-801 GYKI S 1 S 2 minta FRS 2 /FRS 1 FRR 2 /FRR 1 E/3 ábra A GluR antagonisták (dizocilpin (MK-801) és GYKI-52466) szignifikánsan nem változtatták meg sem a [ 3 H]dopaminnak a veratridin-kiváltotta (A,B), sem a bazális, sem pedig az elektromos stimuláció okozta felszabadulását (C,D). E.2. Dopamin és glutmát felszabadulásának szimultán mérése E.2.1. Kontroll kísérletek E Dopamin felszabadulása Kontroll kísérleteink során a kísérletek elején a [ 3 H]dopamin nyugalmi felszabadulása az összes szöveti radioaktivitás 3,15 0,19 % volt (az első két minta átlaga). Elektromos téringerlés (eltér az eddigi ingerlési paraméterektől, l.d. D.5.4.) hatására a [ 3 H]dopamin kiáramlása szignifikánsan megemelkedett, a görbe alatti terület 48

49 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 % S Kontoll TTX TTX minta (számítását l.d. D.4.4.) 0,55 0,22 volt. A kísérlet végére a bazális [ 3 H]dopamin felszabadulás (az utolsó két minta átlaga) 3,17 0,20 %-ra tért vissza, ami szignifikánsan nem tér el a kezdeti értéktől (E/4 ábra). E/4 ábra Az elektromos téringerlés hatására [ 3 H]dopamin kiáramlása szignifikánsan megemelkedett, majd visszatért az eredeti szintre. TTX hatására mind a bazális, mind a stimuláció-kiváltotta felszabadulás szignifikánsan csökkent. E Glutamát felszabadulása A glutamát felszabadulását a bazális glutamát-szint százalékaként adtuk meg. Ebből adódik, hogy az első két frakció átlaga 100 2,99 %. Az elektromos téringerlés szignifikánsan megemelte a glutamát felszabadulását, mely 2,58-szoros növekedést ért el (a görbe alatti terület ,16 volt). A stimulációt követően a felszabadulás közel az alapértékre tért vissza (az utolsó két minta átlaga 131,81 12,23 % volt) (E/5 ábra) % Kontroll TTX S minta TTX E/5 ábra Elektromos téringerlés hatására szignifikánsan megemelkedett a glutamát felszabadulása, melyet az alkalmazott TTX teljes mértékben antagonizált. 49

50 E.2.2. Tetrodotoxin hatása E Dopamin felszabadulása Az mintagyűjtés előtt 6 perccel 1 µm TTX-t tartalmazó oldattal perfundáltuk a preparátumot, melynek hatására nem csak a stimuláció-kiváltotta [ 3 H]dopaminfelszabadulás csökkent szignifikánsan (görbe alatti terület: -0,75 0,39, p<0,01), hanem a nyugalmi kiáramlás is 3,38 0,45 %-ról (1-2. frakciók átlaga) 1,70 0,30 %-ra (7-8. frakciók átlaga) esett (E/4 ábra, E/4 táblázat). E Glutamát felszabadulása Az előzőekhez (E ) hasonlóan alkalmazott TTX blokkolta a stimuláció által okozott glutamát-felszabadulás növekedést (görbe alatti terület: 14,04 54,21, p<0,05) (E/5 ábra, E/5 táblázat). E.2.3. Dopamin receptor agonista és antagonista hatása E Dopamin felszabadulása A specifikusan D 2 dopamin receptor agonista bromokriptin (20 µm koncentrációban, a frakciószedés előtti 6. perctől alkalmazva a kísérlet végéig) hatására nem változott meg a [ 3 H]dopamin nyugalmi felszabadulása (2,61 0,23 %, ns). Ezzel szemben az elektromos téringerlés hatására létrejött [ 3 H]dopamin-kiáramlást szignifikánsan megemelte (görbe alatti terület: 2,58 0,38, p<0,01). A D 2 dopamin antagonista szulpirid 100 µm koncentrációban a bromokriptinhez hasonlóan a nyugalmi [ 3 H]dopamin kiáramlást nem változtatta meg (2,67 0,23 %, ns), viszont a stimuláció-kiváltotta felszabadulás hatását szignifikánsan megnövelte (görbe alatti terület: , p<0.01) (E/6 ábra, E/4 táblázat). 50

51 % S Kontoll Bromokriptin Szulpirid minta DR ag., antag. E/6 ábra A dopamin receptor (DR) agonista (bromokriptin) és antagonista (szulpirid) vegyületek (a frakciószedés előtti 6. perctől alkalmazva) szignifikánsan megemelték a [ 3 H]dopamin stimuláció-kiváltotta felszabadulását. E Glutamát felszabadulása A korábban már leírt módon (l.d. D.5.3.) alkalmazott 20 µm koncentrációjú bromokriptin és a 100 µm koncentrációjú szulpirid oldat egyaránt hatástalan volt a glutamát bazális és a stimuláció-kiváltotta felszabadulására (görbe alatti területek: bromokriptin esetén 399,90 50,46, ns, szulpiridnél 147,27 l78,27, ns). Itt jegyzem meg, hogy ezeknek a kísérleteknek a pontossága nem éri el a dopamin mérésekét, mely a nagy szórásból jól látható (E/7 ábra, E/5 táblázat) % Control Bromokriptin Szulpirid S minta DR ag., antag. E/7 ábra Sem bromokriptin, sem szulpirid (a frakciószedés előtti 6. perctől alkalmazva) nem változtatta meg a glutamát felszabadulását szignifikánsan. 51

52 Koncentráció ( M) n Görbe alatti terület S.E.M. Kontroll 6 0,55 0,22 p (kontrollal szemben) Tetrodotoxin 1 4-0,75 0,39 0,009 Bromokriptin ,58 0,38 0,0003 Szulpirid ,85 0,20 0,0003 E/4 táblázat A [ 3 H]dopamin elektromos téringerlés hatására létrejött felszabadulását a TTX lecsökkentette, a bromokriptin és a szulpirid pedig szignifikánsan megemelte. Koncentráció ( M) n Görbe alatti terület S.E.M. p (kontrollal szemben) Kontroll 6 329,77 44,16 Tetrodotoxin ,04 54,21 0,047 Bromokriptin ,30 50,46 0,54 Szulpirid ,27 178,27 0,13 E/5 táblázat A glutamát stimuláció-kiváltotta felszabadulását a tetrodotoxin teljesen blokkolta, míg a bromokriptin és a szulpirid nem volt szignifikáns hatással. A mérések viszonylagos pontatlanságát a nagy szórásértékek jelzik. E.3. Aminoglikozid antibiotikumok hatása a dopamin felszabadulására E.3.1. Akut hatás Ezekben a kísérletekben az elektromos téringerlést a D pontban leírt paraméterekkel végeztük, a 3. és 13. mintagyűjtési periódus alatt. Az aminoglikozid antibiotikumokat a két ingerlés között (6. frakció alatt) adtuk a perfundáló folyadékhoz. A kontroll kísérletek során a kiáramlott [ 3 H]dopamin mennyiségét az elektromos stimuláció szignifikánsan megemelte, majd az visszatért az alapértékre 4 frakciószedési periódus, azaz 12 perc múlva (E/8 ábra). A kiváltott felszabadulás megfelelően 52

53 stabilnak mutatkozott az első és második stimuláció hatására (az FRS 2 /FRS 1 arány 0,99 0,06, n=12) (E/6 táblázat). A neomycin hatására az elektromos téringerlés kiváltotta [ 3 H]dopaminfelszabadulás koncentráció-függően csökkent (FRS 2 /FRS 1 értékeket l.d. a E/6 táblázatban)(e/8 ábra). A nyugalmi dopamin kiáramlásra kizárólag az 1 mm-os neomycin koncentráció volt hatással, mégpedig a téringerlés-kiváltotta felszabadulással ellentétesen, azaz a [ 3 H]dopamin nyugalmi kiáramlását fokozta. Ezt valószínűleg egy nem-specifikus hatás okozza. Fontos megjegyezni, hogy ez a neomycin hatás nem fordulhat elő fiziológiás körülmények között, hiszen ez a koncentráció a klinikailag előforduló szérum szintet jóval meghaladja. Kísérleteinkben csak azért alkalmaztuk, hogy a stimuláció-kiváltotta dopamin felszabadulás csökkenésében a koncentrációfüggőséget demonstráljuk % kontroll 100 µm neomycin 1 mm neomycin neomycin minta S 1 S 2 E/8 ábra A két ingerlés között a perfúzós folyadékhoz adott neomycin oldat koncentráció-függő módon csökkentette a [ 3 H]dopamin stimuláció kiváltotta felszabadulását. Látható, hogy a fiziológiástól nagymértékben eltérő koncentráció (1 mm) a nyugalmi felszabadulást fokozta (magyarázatát l.d. a szövegben). A fenti kísérleteket megismételtük a gentamycin és a kanamycin több koncentrációjával (10, 30, 100 µm gentamycin és 30, 100 µm kanamycin), de ezek 53

54 közül egyik antibiotikum sem volt hatással sem a nyugalmi, sem az elektromos téringerlés hatására fellépő [ 3 H]dopamin-felszabadulásra (E/6 táblázat). Koncentráció n FRS 2 /FRS 1 p (kontrollal szemben) Kontroll 12 0,99 ± 0,06 Neomycin 30 µm 6 0,88 ± 0,09 0, µm 5 0,73 ± 0,03 0, µm 7 0,72 ± 0,07 0, µm 4 0,32 ± 0,11 0,00011 Gentamicin 10 µm 4 1,01 ± 0,03 0,84 30 µm 4 1,13 ± 0,10 0, µm 4 1,04 ± 0,05 0,64 Kanamycin 30 µm 4 0,99 ± 0,02 0, µm 4 1,02 ± 0,12 0,79 E/6 táblázat A neomycin koncentráció-függően csökkentette a [ 3 H]dopamin elektromos téringerlés által kiváltott felszabadulását, míg a másik két aminoglikozid antibiotikum (gentamicin és kanamycin) nem volt szignifikáns hatássala transzmitter felszabadulására. E.3.2. Krónikus hatás Az állatok D.6.2. pontban leírt neomycin előkezelését követően a cochleákat izoláltuk, és előző pontban leírtak szerint vizsgáltuk a [ 3 H]dopamin felszabadulását elektromos stimuláció és különböző koncentrációjú (100, 300, 1000 µm) neomycin perfúzió hatására. Meglepő módon egyik koncentrációjú neomycin oldat sem okozott az előkezeletlen állatokéhoz hasonló hatást, az FRS 2 /FRS 1 értékek a következők voltak: 100 µm-nál 0,91 0,07; 300 µm-nál 0,97 0,09 és 1 mm-nál 0,93 0,08 (egyik sem szignifikáns a kontrollhoz képest) (E/9 ábra). 54

55 1.2 akut krónikus FRS 2 /FRS *** * *** kontroll 30 µm 100 µm 300 µm 1000 µm E/9 ábra A krónikusan neomycin-kezelt állatok izolált cochleájával végzett kísérletek során nem észleltünk változást a [ 3 H]dopamin elektromos stimuláció kiváltotta felszabadulásában a neomycin bármely koncentrációjú oldatának perfúziójának hatására sem (sötét oszlopok). Ezzel szemben a kezeletlen állatok cochleájából a [ 3 H]dopamin kiáramlása a neomycin hatására koncentráció-függően csökkent (fehér oszlopok). E.4. Intracelluláris kalciumkoncentráció mérése. E.4.1. Az egyes sejttípusok azonosítása A preparátumon DIC mikroszkópiával felkerestük a megfelelő látóteret, melyen felülnézetből láthatóak voltak a támasztósejtek, a külső szőrsejtek három sora, a külső és belső pillérsejtek által alkotott Corti alagút teteje, a belső szőrsejtsor. A gangion spirale sejttestjei általában nehezen voltak azonosíthatóak a modiolus által okozott csonttömeg árnyékolása miatt (E/10 A. Ábra). E.4.2. A sejtek töltődése fura-2/am-mel A megfelelő terület illetve sejtek DIC-vel való azonosítását követően ugyanazt a látóteret UV fénnyel világítottuk meg, és az emittált fényt detektáltuk. Az E/10 B, ábrán látható, hogy a belső szőrsejtsor fluoreszcenciája megfelelő, a pillérsejtek nem töltődtek, a külső szőrsejtek belső sora részben töltődött, míg a második és harmadik sor 55

56 nem (E/10 B. Ábra). Ezzel a kísérletsorozattal elsőként sikerült imn situ a belső szőrsejtek intracelluláris kalcium koncentrációjának változását regisztrálni. TS KSZ CA BSZ GS TS KSZ CA BSZ GS E/10 Ábra. A. A DIC képen láthatóak a halló érzékhám azonosított sejtjei (Rövidítések: TS: támasztósejt; KSZ: külső szőrsejt; CA: Corti alagút; BSZ: belső szőrsejt; GS: gangion spirale) B. Ugyanez a látótér UV fénnyel megvilágítva, a körberajtolt területen, illetve kiemelve, számozva mellette látható a kiválasztott 5 belső szőrsejt melyek kalciumion koncentráció-változását mértük. 56