Budapesti Corvinus Egyetem, ÉTK Mikrobiológia és Biotechnológia Tanszék 2010

Átírás

1 Élelmiszer-biotechnológia I Maráz Anna e. tanár Budapesti Corvinus Egyetem, ÉTK Mikrobiológia és Biotechnológia Tanszék 2010 Mikrobiológia és Biotechnológia Tanszték

2 A biotechnológia fogalma, értelmezése Biotechnológia: olyan folyamatok, amelyekben élı organizmusokat (baktériumokat, gombákat, növényeket, állatokat, ill. ezek szövettenyészeteit) vagy termékeiket (enzimeket, szerves savakat, antibiotikumokat, stb.) használják fel ipari termelési célra. Új vagy modern biotechnológia: a molekuláris klónozás (génsebészet) alkalmazása törzsnemesítési célra annak érdekében, hogy a klónozó gazda segítségével teljesen új terméket állítsanak elı.

3 A biotechnológia színei Vörös biotechnológia: a biotechnológia alkalmazása orvosi (gyógyászati) célra Fehér (szürke) biotechnológia: a biotechnológia alkalmazása ipari termelésben Zöld biotechnológia: a biotechnológia alkalmazása mezıgazdasági termelében (Kék biotechnológia: a biotechnológia alkalmazása tengeri és vízgazdálkodási célra)

4 Mikrobiális biotechnológia Nagy mennyiségben elıállított mikroorganizmusok alkalmazása értékes termékek elıállítására vagy környezetvédelmi célra. Az elıállítás elsısorban fermentációval történik, melynek során sejteket (általában mikroorganizmusok) szaporítanak el ipari léptékben aerob, ritkábban anaerob körülmények között. Szabályozott elıállítás: fermentorban

5 Fermentációs ipari biotechnológia Nagy mennyiségben elıállított mikroorganizmusok alkalmazása értékes termékek elıállítására vagy fontos biokémiai transzformációk megvalósítására. Az ipari mikrobiális biotechnológiai folyamatokban olyan mikróbákat alkalmaznak, amelyek az adott metabolikus folyamat elvégzésére alkalmasak. Általában a cél túltermelı törzsek alkalmazása.

6 Miért hasznosak a mikróbák a biotechnológiában? A mikróbák gyakorlatilag mindenütt megtalálhatók a földön Túlélnek és szaporodnak extrém meleg, hideg, sós és savas környezetben, Jól tőrik a sugárzást, nagy nyomást, nem igényelnek fényt. Ilyen környezetben általában más élılények nem élnek meg és csak szervetlen tápanyagok állnak rendelkezésre. Ezeket a mikróbákat extremofil (extrém környezetet kedvelı) mikróbáknak hívjuk. Endolitikus (kı belsejében élı) baktériumok

7 Miért hasznosak a mikróbák a biotechnológiában? A mikróbák sokfélesége és a környezethez való adaptálódásuk ( stressztőrésük ) azt mutatja, hogy a mikróbák már sok olyan kérdést megoldottak, amelyeken most a kutatók dolgoznak. A kutatások eddig csak a mikróbák sokféleségének ( biodiverzitásának ) a felszínét tárták fel. A mikróbák képességeinek, tulajdonságainak, genomjainak megismerése be nem látható lehetıségeket jelent az ipari, egészségügyi, energiatermelési és környezeti területeken.

8 EZÉRT: Nem szükséges génsebészeti eszközökkel új tulajdonságokat mutató mikróbákat elıállítani, mert ezeket különbözı élıhelyeken meg lehet találni, csak jó helyen kell keresni! Probléma: a mikroorganizmusok zöme nem, vagy csak nehezen tenyészthetı, ezért biotechnológiai célra közvetlenül nem alkalmazható. Megoldás: az extrém tulajdonságokért felelıs géneket (pl. termofil enzimek génjei) jól tenyészthetı (fermentálható) mikróbákba kell átvinni génsebészeti eszközökkel, amelyek megtermelik a hasznos fehérjét.

9 Mikroorganizmusok ipari hasznosítása 1. Sejttömeg (biomassza) termelés - pl. sütıélesztı, takarmányélesztı, mikoprotein, élesztıkivonat, nukleotidok elıállítása 2. Összetett anyagcserefolyamatok hasznosítása - Tejsavasan és alkoholosan erjesztett termékek elıállítása - Biodegradáció, szenyvíztisztítás - Fémkinyerés (biometallurgia) 3. Kis molekulatömegő termékek fermentációs elıállítása - Elsıdleges metabolitok elıállítása - Másodlagos metabolitok elıállítása - Biokémiai (enzimes/sejtes) transzformációk 4. Makromolekulák termelése - Poliszacharidok elıállítása - Lipidek elıállítása - Fehérjék elıállítása

10 Anyagcsere termékek metabolitok jellemzıi Elsıdleges metabolitok: aktív anyagcseréhez/szaporodáshoz (idiofázishoz) kötötten termelıdnek. 1. A sejtek lebontó (katabolikus) folyamataiban (energianyerés) szükségesek. Pl. polimer szénhidrátokat (keményítı) bontó enzimek, laktózt bontó β galaktozidáz enzim, citromsav 2. A sejtek felépítı (anabolikus) folyamataiban szükségesek. Pl. aminosavak Másodlagos metabolitok: szaporodás befejezése után (stacioner) fázisban termelıdnek. A sejt számára általában nem szükségesek. Pl. antibiotikumok, mikotoxinok.

11 Új metabolitot (anyagcsere-terméket) termelı mikróbatörzs és eljárás kifejlesztése Mikróba törzs izolálása Tenyészet szelektálása Fermentációs eljárás kidolgozása Termékek kinyerése Nyers preparátum termék screenelése (szőrése) Fermentációs eljárás optimalizálása termék(ek) tisztítása, izolálása, karakterizálása Kémiai szerkezet meghatározása (módosítása) Toxikológiai vizsgálat Hatósági engedélyeztetés Piackutatás TERMELÉS

12 MIKROORGANIZMUS TÖRZSEK SZŐRÉSE (SCREENING) Szőrés célja: ipari termelésre alkalmas mikroorganizmus törzsek izolálása, más, felesleges mikróbák eltávolítása, illetve gátlása Pl. enzimtermelı vagy antibiotikum termelı mikróbák izolálása talajból

13 Talajszuszenzió szélesztése táptalajon Baktérium telepek kifejlıdése Gátlóanyagot termelı törzs szélesztése Gátlóanyag a táptalajba diffundál Antibiotikum termelı mikróbák szelektálása Törzs kinövése a táptalajon Vizsgálandó törzsek leoltása Gátlóanyagot termelı telepek Inkubálás Szaporodás Gátlóanyagot termelı telepek Gátlás Streptomyces coelicolor telepek Antibiotikum (aktinorodin, metilenomicin) termelı faj

14 Biotechnológiai folyamatokban alkalmazható mikroorganizmusok jellemzıi Fı elvárások: 1. Tiszta tenyészet legyen (vírus- és fágmentesség) 2. Jó szaporodási képességgel rendelkezzen 3. Lehetıleg csak a kívánt anyagot termelje 4. Ne termeljen toxikus anyagokat 5. Minél jobban védve legyen a fertızésekkel szemben - pl. savas ph-nál jól szaporodjon, - pl. más mikroorganizmusokat gátló metabolitokat termeljen) 8. Hosszú ideig eltartható legyen.

15 Törzsek izolálása, beszerzése Izolálás: Közvetlenül a talajból pl. talajszuszpenzió higításával Jellemzı élıhelyekrıl pl. keményítıbontó enzimeket termelı mikróbákat burgonya vagy kukoricafeldolgozó üzemek szennyvízébıl Beszerzés: Törzsgyőjteményekbıl Törzsgyőjtemények: Azonosított és jellemzett mikroorganizmus törzsek fenntartása tartósított tenyészetek formájában (szabadalmaztatáskor is ezekben kell elhelyezni a törzseket). Pl. nemzetközi törzsgyőjtemények: ATCC (USA), DSMZ (Németország), CBS (Hollandia), NCAIM (Budapest)

16 Mikróba törzsek szelektív feldúsítása Talaj kezelése (szárítás, hıkezelés, szőrés, detergensekkel, oldószerekkel való kezelés) Szelektív gátlóanyagokkal való kezelés (pl. antibakteriális anyagokkal gombák, antifungális anyagokkal baktériumok feldúsítása) Speciális tápanyagok alkalmazása Pl. keményítı szénforrás esetén keményítıbontó enzimek indukálódnak Hımérséklet, ph, levegıztetés szabályozása (pl. 40 o C felett csak a hıtőrı (termotróf) mikróbák szaporodnak)

17 Tenyészetek tartósítása 1. talaj víztelenítése 2. élı (agaros) tenyészetek (4 o C-on) 3. ferdeeagaros tenyészetek paraffin olajjal való leöntése (4 o C-on) 4. sejtek szuszpendálása steril vízben (4 o C-on) 5. liofilezés 6. fagyasztás (-80 o C-on) 7. folyékony nitrogénben való tárolás (-196 o C)

18 TÖRZSNEMESÍTÉS és MÓDSZEREI Törzsnemesítés célja: A mikroorganizmus genomjának (DNS-ének, génjeinek) olyan öröklıdı megváltozása, ami az adott biotechnológiai folyamat céljából hasznos (pl. több gátlóanyagot vagy enzimet termel, jobban erjeszt, jobb az aromatermelése). Törzsnemesítés módszerei: 1. Mutáció biotechnológiában eredményesen alkalmazható 2. Rekombináció A/ Természetes biotechnológiai alkalmazhatósága csekély - baktériumoknál: konjugáció, transzformáció és transzdukció - gombáknál: szexuális (ivaros) és paraszexuális (ivartalan) keresztezés B/ Meterséges: biotechnológiai alkalmazhatósága kiváló - protoplaszt fúzió, - rekombináns DNS technika (molekuláris klónozás, génsebészet)

19 Mutáció, mutagének Mutáció: A genomban (DNS-ben) bekövetkezı öröklıdı bázissorrend (szekvencia) változás Genom: az adott élılény sejtjei (ill. vírusrészecske) által hordozott örökítıanyagok összessége Prokarióta genom alkotói: kromoszómális genom és plazmidok kettısszálú (ds) DNS Eukarióta genom alkotói: sejtmagi (kromoszómális), mitokondriális, kloroplasztisz genom dsdns és plazmidok (dsdns vagy dsrns) Vírusgenom alkotói: egyszálú (ss) vagy dsdns, illetve egyszálú (ss) vagy dsrns molekulák

20 DNS elsıdleges szerkezete A nukleinsavak szerkezete 5 (P) vég DNS másodlagos szerkezete Egyszálú RNS (elsıdleges szerkezet) Kétszálú RNS (másodlagos szerkezet) Bázispárok 3 (OH) vég

21 A kettısszálú (ds)dns szerkezete 1. A T és G C bázispárok 2. Foszfát 3. Dezoxiribóz észterkötés B (jobbmenetes) konformáció Szabály: A:T=1 és G:C=1

22 A prokarióta genom szerkezete Kromoszóma (cirkuláris DNS) Szuperspirál DNS a kapcsolódó bázikus fehérjékkel Plazmid

23 A baktérium genom Kromoszóma (kettısszálú DNS) Plazmidok (kettısszálú DNS)

24 A DNS-en a nukleotidok meghatározott sorrendben helyezkednek el, és ez a sorrend meghatározza az öröklıdı tulajdonságokat, jellemzıket. A bázishármasok (tripletek) egy-egy aminosavat kódolnak. Az egyetlen fehérjét meghatározó (kódoló) DNS szakasz a gén. A kromoszómák több ezer gént hordoznak

25 Extrakromoszómális elemek- Plazmidok Plazmid: Kör alakú (cirkuláris), önálló, a kromoszómától független replikációra képes duplaszálú DNS molekula Általában több, mint 1 plazmid/sejt (sok-kópiás DNS molekulák) - kivétel az F plazmid Mérete a kromoszóma 1-5%-át teszi ki.

26 Eukarióta sejtmag elektronmikroszkópos képe A sejtmag komponensei közül a kettıs sejtmagmembrán, a rajta lévı magpórusok (vastag nyilak), a belsı magmembránhoz kapcsolódó kondenzálódott heterokromatin, valamint a magvacska látható.

27 Élesztıgomba genom Kromoszómák 16 kromoszóma (kettısszálú DNS) gélelektroforézissel elválasztva és fluoreszkáló festékkel megfestve

28 Az öröklıdı tulajdonságok megváltozása: Mutáció Mutáció: a DNS bázissorendjében bekövetkezı öröklıdı változás

29 Mutánsok típusai 1. A DNS-ben bekövetkezı változás szerint: A/ bázisok kicserélıdése B/ bázisok kiesése (deléció) C/ bázisok betoldása (inzerció) 2. Gyakoriság szerint: A/ spontán mutáció: oka ismeretlen, kis gyakoriságú B/ indukált mutáció: mutagénkezelés hatására jönnek létre, mutánsok gyakoriság megnı (ált % között) 3. Fenotípus szerint: A/ Morfológiai mutánsok: szín, telep-, sejt-morfológia megváltozik. C/ Rezisztens (ellenálló) mutánsok: gátló hatásokkal szemben ellenálló (rezisztens) mutánsok keletkeznek. Pl. antibiotikum-, konzerválószer-, UV-rezisztens mutánsok.

30 Serratia marcescens Vad típus-piros Mutáns - fehér

31 Mutáns típusok (példa) Vad típus (fekete konídium) Aspergillus niger penészgomba színmutánsai Rezisztens mutánsok gátlóanyag Gátlási zóna Vad típus Telepmorfológiai mutánsok

32 Mutánsok típusai (folyt.) 3. Fenotípus szerint (folyt.): C/ Biokémiai mutánsok: lebontó (katabolikus) vagy felépítı (anabolikus) anyagcsere folyamatokban résztvevı egy vagy több gén inaktiválódik vagy szabályozásuk megváltozik. Pl. a lizin aminosav nem termelıdik, a mutáns lizin auxotróf lesz (lizint igényel a növekedéséhez). Vad típus: protoróf jelölés: liz - (auxotróf mutáns), liz + (vad, prototróf)

33 Mutagének: A DNS-re hatva kémiai változást idéznek elı Mutagének csoportosítása hatásmód szerint: A/ Fizikai mutagének 1. Nem ionizáló sugárzások: UV sugárzás (T-T kovalens kötéssel dimerek keletkeznek, replikációkor ez kiesik deléció 2. Ionizáló sugárzások: röntgen sugárzás, γ-sugárzás (pl. 60 Co). A cukor-foszfát gerincet eltörik nagy deléciók.

34 Az UV mutagén hatása P dr P dr A DNS-ben a szomszédos timin bázisok között kovalens kötés jön létre. A szerkezet eltorzul, replikáció során a timin dimer kiesik (deléció) P dr P dr

35 B/ Kémiai mutagének 1. Bázisanalógok: Meghatározott bázisok (A,T,C,G) helyére épülnek be, itt azonban más bázissal párosodnak, mint az eredeti. Replikáció során pontmutáció jön létre. Pl. bróm-uracil (Bu) a timin helyére épül be, de nem az adeninnel, hanem a guaninnel párosodik. Eredmény: T =A Bu G DNS replikáció C G 2. Alkilezıszerek: A bázisokra alkil (metil-, etil-csoportot) kapcsolnak, ami hibás bázispárosodást okoz. Pl. MNNG (metil-nitro-nitrozo-guanidin) hatására általában A = T G C tranzíció jön létre

36 3. Interkaláló szerek: Beépülnek a DNS két szála közé, eltorzítják a DNS szerkezetét. Ez replikáció során deléciókat okoz. Pl. etidium-bromid, akridin-narancs 4. Dezamináló-szerek: A bázisokban az amino-csoport helyett oxo-csoport lesz, ami hibás bázispárosodást okozhat. Pl. salétromossav/nitritek hatása: dezaminálás C G C U U =A DNS replikáció T =A

37 INTERKALÁLÓ VEGYÜLETEK Benzo-a-pirén - kipufogógázban (fıként dizelmotoroknál) - cigaretta füstben - faszénen sütött ételekben

38 Ames teszt: Mutagén hatás kimutatása Salmonella Typhimurium mutáns törzzsel. A mutagén hatást az auxotróf (minimálon nem szaporodó) teszt-törzseknek prototróffá történı visszamutációja (backmutációja) jelzi. Ennek következtében a mutánsok minimál táptalajon telepeket képeznek. A megjelenı telepek száma arányos a mutagén hatás erısségével. A rákos megbetegedések hátterében jelentıs mértékben mutáció húzódik meg, ezért az emberi szervezetet érı mutagén hatásokat minimalizálni kell. A mutagének a táplálékláncon keresztül, illetve élelmiszer adalékok formájában kerülnek többnyire az élelmiszerbe. Az elsı szintő mutagén kimutatás az Ames teszt (környezeti mintáknál is).

39 TÖRZSNEMESÍTÉS MUTÁCIÓVAL 1. Spontán mutánsok izolálása 2. Mutánsok indukálása A/ Kicsi gyakoriságú mutációk indukálása: kis mutagén dózis alkalmazása (> 50% túlélıbıl való izolálás) B/ Nagy gyakoriságú mutációk indukálása nagy mutagén dózis alkalmazása (20% alatti túlélıbıl való izolálás). Dózis: a mutagén hatás erıssége Függ: - mutagén mennyiségétıl (sugárzás erıssége, mutagén anyag koncentrációja) - mutagén hatás idejétıl Túlélés % dózis

40 KÜLÖNBÖZİ MUTÁNS TÍPUSOK IPARI MIKROORGANIZMUSOK ESETÉBEN ORGANIZMUS ALKALMAZOT T MUTAGÉN MUTÁCIÓ TÍPUSA TERMÉK Aspergillus niger UV- és röntgensugárzás Regulációs: citromsav termelés növekedése citromsav Hansenula anomala Micrococcus glutamicus Brevibacterium flavum Corynebacterium glutamicum UV-sugárzás Regulációs: antranilsavrezisztencia Adenin auxotrófia MNNG Regulációs: 5- (aminoetil)-cisztein rezisztencia UV-sugárzás Homoszerin auxotrófia triptofán MNNG (N-metil- N -nitro-nnitrozo-guanidin) Inozinmonofoszfát lizin lizin

41 Élesztıgomba hibridek elıállítása protoplaszt fúzióval His - Ade - Auxotróf mutáns szülıi törzsek protoplaszt képzés sejtfaloldó enzimmel Protoplasztok keletkezése izoozmózisos oldatban (pl. 0,6 mol KCl, 1 mol szorbit) Protoplasztok aggregáltatása (fúziója) PEG+ Ca-oldattal Fúziós termékek szelektív regenerációja minimál táptalajon Protoplaszt: sejtfalától (álltában enzimes kezeléssel) megfosztott sejt. Protplaszt fúzió: sejtek mesterségesen egyesítése

42 TÖRZSJAVÍTÁS A REKOMBINÁNS DNS TECHNIKA (MOLEKULÁRIS KLÓNOZÁS) SEGÍTSÉGÉVEL

43 Molekuláris klónozás (rekombináns DNS technika) = génsebészet Cél: idegen gén bejuttatása egy új gazdasejtbe, majd a kódolt tulajdonság megjelenése, kifejeztetése, (klónozott géntermék = heterológ fehérje termeltetése)

44 Molekuláris klónozás (rekombináns DNS technika) Cél: idegen gén bejuttatása új gazdasejtbe, a kódolt tulajdonság megjelenése (géntermék termeltetése=heterológ fehérje) A molekuláris klónozás lépései 1/ A klónozáshoz használt DNS izolálása, fragmentálása restrikciós endonukleázokkal 2/ A DNS fragmentum beépítése a klónozó vektorba: a rekombináns DNS molekula (rdns) in vitro elıállítása 3/ A rekombináns DNS bejuttatása a gazdasejtbe (transzformáció) 4/ A rekombináns DNS-t tartalmazó klón (genetikailag módosított organizmus =GMO) kimutatása, izolálása 5/ A GMO molekuláris és fiziológiai jellemzése

45 Restrikciós endonukleázok Specifikus felismerési és hasítási hellyel rendelkezı, DNS-t hasító enzimek (pl. HindIII a Haemophylus influenzae d és az EcoRI az Escherichia coli R törzsbıl) HindIII enzimes hasítás Tompa végek keletkeznek Eco RI enzimes hasítás Ragadós végek keletkeznek

46 Restrikciós endonukleázok, specifikus felismerési és hasítási helyeik Hae III Sal I A restrikciós endonukleáz jelölése Bam HI Eco RI Eco RII Termelı mikroba Bacillus amyloliquefaciens H Escherichia coli R Escherichia coli R Hemophilus aegyptius Streptomyces albus Hasítási hely 5, -G-G-A-T-C-C-3, 3, -C-C-T-A-G-G-5, 5, -G-A-A-T-T-C-3, 3, -C-T-T-A-A-G-5, 5, -C-C-T-G-G-3, 3, -G-G-A-C-C-5, 5, -G-G-C-C-3, 3, -C-C-G-G-5, 5, -G-T-C-G-A-C-3, 3, -C-A-G-C-T-G-5,

47 2. 1. A molekuláris klónozás lépései 1/ A klónozáshoz használt DNS izolálása, fragmentálása restrikciós endonukleázokkal 2/ A DNS fragmentum beépítése a klónozó vektorba: a rekombináns DNS molekula (rdns) in vitro elıállítása 3/ A rekombináns DNS bejuttatása a gazdasejtbe (transzformáció) 3. 4/ A rekombináns DNS-t tartalmazó klón (genetikailag módosított organizmus =GMO) kimutatása, izolálása 5/ A GMO molekuláris és fiziológiai jellemzése 4.

48 2. 1. A molekuláris klónozás lépései 1/ A klónozáshoz használt DNS izolálása, fragmentálása restrikciós endonukleázokkal 2/ A vektor hasítása ugyanezzel a restrikciós endonukleázzal 3. 2/ A DNS fragmentum beépítése a klónozó vektorba: a rekombináns DNS molekula (rdns) in vitro elıállítása / A rekombináns DNS bejuttatása a gazdasejtbe (transzformáció) 4/ A rekombináns DNS-t tartalmazó klón (genetikailag módosított organizmus =GMO) kimutatása, izolálása 5/ A GMO molekuláris és fiziológiai jellemzése

49 A génsebészet gyakorlati alkalmazása 1. Mikróbás fermentációk enzimtermelés új gazdasejtben (pl. rekombináns kimozin, β-glükanáz, celluláz) erjedésipari géntechnológiailag módosított élesztıtörzsek 2. Vírusellenes vakcinák (antigének) termelése Vírus köpenyfehérjét kódoló gén klónozása, antigen termeltetés baktériummal vagy élesztıgombával (pl. kanyaró, veszettség, hepatitis B vírusok). 3. Emlıs proteinek termelése vérfehérjék termeltetése (pl. véralvadást elısegítı faktorok, véralvadékot oldó proteinek) emberi hormonok termelése (sárgatest stimuláló hormon, insulin, méh relaxin) immunitást növelı fehérjék termelése (interferonok, lizozim, tumor nekrózis factor) 4. Transzgénikus növények elıállítása Bt. (Bacillus thuringiensis) rovarölı toxint termelı növények elıállítása (pl. gyapot) vírusellenálló növények elıállítása virus köpenyfehérje gén klónozásával lassan érı (nem puhuló) Favr savr paradicsom elıállítása

50 4. Transzgénikus állatok elıállítása Gyógyászati jelentıségő fehérjék termeltetése állatokkal (pl. antitripszin kiválasztása juh tejben, véralvadékot oldó fehérje termeltetése kecskében) 5. Géntechnológiailag módosított mikroorganizmusok felhasználása a környezeti biotechnológiában klórozott növényvédıszereket (pl. 2,4,5-T) bontó enzimek génjeinek klónozása halogénezett aromás vegyületek (pl. klórbenzén), egyéb aromas vegyületek (anilinek, toluene), szénhidrátok bontása génklónozással 6. Génterápia Öröklıdı betegségek kezelése génsebészeti eszközökkel

51 Gyógyászati célra elıállított heterológ humán fehérjék Fehérje Funkció Rekombináns gazda inzulin diabetes gyógyítása E. coli és Saccharomyces cerevisae relaxin szüléskönnyítı E. coli somatotropin törpeség gyógyítása E. coli calcitonin csontgyengeség gyógyítása Saccharomyces cerevisae VIII véralvadási faktor hemophilia (vérzékenység) gyógyítása E. coli plazminogén aktivátor véralvadás gátló E. coli tumor nekrózis faktor rák gyógyítása β-interferon sclerosis multiplex gyógyítása, AIDS ellenes hatás γ- interferon rákellenes hatás, reuma gyógyítása E. coli E. coli lizozim gyulladásgátló Saccharomyces cerevisae α-amiláz keményítı lebontása Saccharomyces cerevisae

52 Fehérje mérnökség útján módosított proteinek Fehérje mérnökség: A fehérjét kódoló gén célzott, pontmutációs megváltoztatása génsebészeti eszközökkel. Cél: enzimaktivitás növelése, specifikusság szélesítése, ellenállóság javítása. A módosított tulajdonság Eljárás Glükóz izomeráz hıstabilitásának növelése Biopeszticid hatás kifejtése vedlést szabályozó hormon módosításával α-antitripszin oxidációval szembeni rezisztenciájának növelése hirudin hatékonyságának növelése Az enzimben a 253-as argininnek lizinre való kicserélése hormon módosítása a LacZ gén inszerciójával metioninnak valinra való kicserélése a 47-es aszparaginnak lizinre vagy argininre való kicserélése

53 A génsebészet mérföldkövei Az elsı rekombináns DNS molekula létrehozása Humán szomatosztatin hormon elıállítása rekombináns DNS (rdns) technikával Inzulin elıállítása rdns technikával Génsebészeti úton (E. coli-val) elıállított humán inzulin kereskedelmi forgalomba hozatala Glifozát gyomírtószerrel szemben toleráns (transzgénikus) dohány elıállítása A polimeráz láncreakció (PCR) technika kidolgozása Az elsı genetikailag stabil transzgénikus haszonnövény (Glifozát toleráns szója) elıállítása Genetikailag módosított vírus (baculovirus) szabadföldi kibocsátása a vírusrezisztencia növelése céljából Humán proteineket termelı transzgénikus malacok és kecskék kifejlesztése Elsı teljes baktérium genomok megszekvenálása Az elsı eukarióta élılény teljes genomjának megszekvenálása (élesztı genom projekt) Az elsı növény (Arabidopsis thaliana) teljes genomjának megszekvenálása Humán genom szekvenálásának befejezése (humán genom projekt)

54 Enzimek elıállítása és biotechnológiai alkalmazása

55 Mikróbákkal történı enzimelıállítás elınyei 1. Gyors növekedés, ipari körülmények között jó tenyészthetıség 2. Olcsó növekedési szubsztrátumok alkalmazása (természetes táptalajok, mezıgazdasági melléktermékek) 3. Nagyszámú mikróbafaj és törzs sokféle enzimet termel, ami törzsjavítással tovább fokozható, illetve növelhetı 4. Nem mikrobiális enzimek génjei mikróbákban klónozhatók, génsebészeti úton expressziójuk javítható

56 Enzimelıállítás lépései 1. Megfelelı enzimet termelı törzs szelektálása Szelektív táptalaj alkalmazása pl. amiláz - keményítı proteáz - kazein. 2.Izolált mikróba jellemzése, rendszertani besorolása (legalább nemzetség szintig), lehetıleg GRAS - biztonságosnak elfogadott - legyen 3. Mikróbák elszaporítása környezeti feltételek optimalizálása, léptéknövelés 4. Enzimek kinyerése, tisztítása, minısítése

57 Enzimek ipari elıállítása mikroorganizmusokkal Enzim neve Termelı mikroorganizmus α amilázok glükoamilázok Bacillus subtilis Bac. amyloliquefaciens Bac. licheniformis Aspergillus oryzae Aspergillus niger Asp. awamori Rhizopus niveus pullulanázok Aerobacter aerogenes Pseudomonas amylodermatosa Amilázok β-amilázok Bacillus polymixa Bac. cereus Rhizopus japonicus

58 Élesztıgomba amiláz aktivitásának kimutatása Keményítıs táptalaj lugollal vagy jódgızben megfestve Saccharomycopsis fibuligera Feltisztulási zóna (lebontott keményítı) Amiláz aktivitást mutatja

59 glukózizomerázok PROTEÁZOK Pektinázok Lipázok Enzim neve Alkalikus proteázok Neutrális proteázok Savanyú proteázok Oltóenzim (rennin) Termelı mikroorganizmus Bacillus coagulans Streptomyces sp. Arthrobacter sp Bac. licheniformis B. amyloliquefaciens Streptococcus fradiae Bac. subtilis Pseudomonas aeruginosa Aspergillus oryzae Aspergillus niger Asp. awamori Mucor miehei Mucor pusillus Endothia parasitica Aspergillus niger Asp. wentii Rhizopus sp. Aspergillus spp. Mucor spp. Rhizopus sp. Candida sp

60 PROTEOLITIKUS és LIPOLITIKUS aktivitás vizsgálata Proteolitikus aktivitású mikróba telepek Lipolitikus aktivitású mikróba telepek Kazeinos táptalajon részleges fehérje hidrolízis (denaturálás) TWEEN 80-as táptalajon - kicsapódás Tejporos táptalajon teljes hidrolízis (feltisztulási zóna) PCA-tributirines táptalajon teljes hidrolízis (feltisztulási zóna)

61 Proteázkészítmények jellemzıi Mikróba Enzim Optimális Hımérséklet ( o C) Aspergillus saitoi Optimális ph Savas proteáz 45 2,4-4,0 9 Asp. oryzae Neutrális proteáz 45 4,5-7,0 9 Elhasított kötések száma Asp. oryzae Alkalikus proteáz 45 8,0-9,0 5 Mucor miehei Tejalvasztó proteáz (rennin) 55-2 Bac. subtilis Neutrális proteáz 50 5,0-7,5 6 Bac. licheniformis Alkalikus proteáz 55 8,0-9,0 7

62 Lipázkészítmények jellemzıi Mikróba Enzim Optimális Hımérséklet ( o C) Optimális ph Asp. niger Lipáz ,0-5,5 90 Maximális hidrolízis fok Asp. niger Lipáz ,5 70 Rhizopus sp. lipáz 40 6,5-7,0 80 Mucor miehei lipáz 40 7,8-8,2 94 Candida sp. lipáz 37 5,5-6,5 90

63 Enzimek alkalmazása az élelmiszer feldolgozásban Enzim α-amiláz β-amiláz Glükoamiláz Glülóz izomeráz Invertáz Laktáz (béta-galaktozidáz) Celluláz Pektináz Lipáz Savas proteáz Neutrális proteáz Alkalikus proteáz Rennin Termelı mikróba Bac. subtilis, Bac. amyloliquefaciens Bacillus subtilis Asp. niger Bacillus coagulans Sacch. cerevisiae Kluyv. lactis Trichoderma viride Asp. niger Asp. niger Asp. niger Bac. Subtilis, Bac. amyloliquefaciens Bac. Subtilis, Bac. amyloliquefaciens Mucor miehei Alkalmazás keményítı cukorszirup, detergens Sörgyártás, maltóz szirup keményítı cukorszirup Keményítıbıl invert cukorszirup Invert cukorszirup tejtermékek Gyümölcslevek, kávé Gyümölcslevek sajtgyártás sütıipar Sörgyártás Mosószergyártás, hús puhítása sajtgyártás

64 ENZIMTERMELİ MIKROORGANIZMUSOK TÖRZSNEMESÍTÉSE. Törzsnemesítés szempontjai: - ne termeljen káros anyagcsere termékeket (pl. antibiotikum, mikotoxin) - ipari szinten gazdaságos legyen - enzim minısége megfelelı legyen (szennyezı enzim minimális legyen) Módszerek: - mutáció - rekombináció - in vitro rekombináns DNS technika

65 E. coli A. niger Rekombináns kimozin elıállítása a) Szarvasmarha kimozin génbıl cdns elıállítása (nem tartalmaz intronokat) b) A kimozin cdns beépítése plazmid vektorba Rekombináns DNS elıállítása) A rekombináns DNS transzformálása E. coli-ba. Továbbklónozása Aspergillus nigerbe Továbbklónozása Kluyveromyces lactis-ba. Termelés: USA E. coli és Aspergillus niger Hollandia: Kluyveromyces lactis A sajtgyártáshoz használt kimozinnak kb. 80%-a rekombins DNS termék (GMO) Miért nem kell jelölni: Mert mennyisége nem éri el a termékben a 0,9%-ot.

66 Aminosavak termelésének alapjai Aminosavak ipari fermentációjának kezdete: 1957 a Corynebacterium glutamicum L-glutaminsav túltermelı törzsének izolálása (Japán). Aminosavak felhasználása: 1. Élelmiszeripar - glutaminsav- ízfokozó - aszparaginsav, alanin győmölcslevekben ízjavító - glicin édesség fokozó - metionin szójatermékek aminosav kiegészítése - cisztein kenyér minıségét javítja, antioxidáns - triptofán, hisztidin tejpor avasodását gátolja 2. Takarmányok kiegészítése - lizin, metionin (treonin, triptofán) növényi fehérjék komplettálása 3. Gyógyászat - aminosavkeverék infúziós oldatokban - betegség gyógyítására (cisztein, glutamin) 4. Vegyipar - polimerek alapanyagai (pl. polialanin, lizin-izocianát gyanta)

67 Aminosavak elıállítása mikroorganizmusokkal a/ Glutaminsav elıállítása: Corynebacterium glutamicum-mal vagy Brevibacterium flavum-mal A biotin mennyiség alacsony szinten tartásával, zsírsav származék felhasználásával a termelt glutaminsav kiválasztódik a közegbe. Citrátkörön keresztül keletkezik: izocitrát-dehidrogenáz glutamát-dehidrogenáz izocitrát α-ketoglutarát glutamát CO2 glutamin-szintetáz NH 3 glutaminsav b/ L-lizin elıállítása: Corynebacterium glutamicum regulációs mutánsaival (pl. homoszerin auxotróf törzs).

68 Szervessavak elıállítása mikroorganizmusokkal Legnagyobb mennyiségben fermentációval állítják elı. Termék Termelı mikróba Felhasználás Fermentáció körülményei Ecetsav Acetobacter fajok Élelmiszeripar, vegyipar Etanol szubsztrátum oxidálása 15%-os termék keletkezik 90-95%-os kihozattal Citromsav Aspergillus niger Élelmiszeripar, vegyipar, gyógyszeripar Melasz alapú tápközeg Fémek mikromenyiségben gátolják 60-80% kihozatal Tejsav Homofermentatív tejsavbakt. Élelmiszeripar, vegyipar, Tisztított táptalaj (extrakció elısegítése) Lb. delbrueckii gyógyszeripar Glükonsav Aspergillus niger Ca, Na megkötése Glükóz-sók tápközeg Egylépéses oxidáció Kevertetett fermentáció 95% kihozatal Fumársav Rhizopus nigricans Gyanták készítése Cukor szénforrás Erıs levegıztetés 60% kihozatal

69 1. Citromsav Elsısorban az Aspergillus niger túltermelı (mutáns) törzseivel álllítják elı. Citrátkörbıl lép ki. A vas és mangán még nyomokban is gátolja a termelést. Fermentáció típusai: a/ Felületi eljárás, amelynél használnak szilárd táptalajt és folyékony táptalajt (a termelés kb. 20 %-át adja). b/ Szubmerz eljárás (a termelés kb. 80 %-át adja). Legnagyobb felhasználó az élelmiszeripar, de a vegyipar fémipar, gyógyszeripar, mosószergyártás is jelentıs.

70 2. Ecetsav Étkezési és ipari célra állítják elı fermentációval. Az ecetsavas fermentációt fıként az Acetobacter aceti végzi. Aerob anyagcserefolyamat, az etanol oxidációja. Ecetsav gátló hatású. alkohol-dehidrogenáz Etanol acetaldehid acetaldehid-hidrogenáz ecetsav NAD(P) NAD(P)H2 NAD(P) NAD(P)H2 3 ATP 3 ATP a/ Borecet elıállítása: orleansi (francia) eljárással borból. Kádakban felszíni ecetsavbaktérium hártya alakul ki. b/ Étkezési ecet elıállítása: - ecetsav-baktériumok faforgácson történı immobilizálásával. A cefrét a bükkfaforgáccsal megtöltött tartályon áramoltatják át, az ecetet az alsó tartályban győjtik össze (német eljárás). - szubmerz eljárással, kevert-levegıztetett fermentorban (Frings eljárás) - 90%-os kihozatal - automatizált

71 Antibiotikumok Mikroorganizmusok által termelt olyan másodlagos anyagcsere termékek (szekunder metabolitok), amelyek más mikroorganizmusok szaporodását kis koncentrációban, specifikusan gátolják. Hatás: sztatikus megállítja a szaporodást vagy cidikus - megöli a sejteket Legfontosabb antibiotikum termelı mikróbák: 1. Streptomyces genus (pl. S. griseus, S. venezuelae, S. fradiae) 2. Bacilllus genus (pl. B. polymmyxa, B. licheniformis) 3. Fonalasgombák (pl. Penicillum chrysogenum, Cephalosporium acremonium)

72 Antibiotikumok (és más gátlóanyagok) kimutatása diffúziós gátlózónával Gátlóanyag (pl. antibiotikum) Mikróba telep vagy fermentlé Érzékeny mikróba Diffúziós gátlózóna

73 A penicillin felfedezése: Flemming 1929, 1942 Penicillium chrysogenum gátló hatásának felfedezése-1929 Ipari gyártás: 1942 A/ Penicillium chrysogenum telep körül kialakult gátlási zóna. Érzékeny baktérium: Staphylococcus aureus B/ Penicillium chrysogenum konidiumtartók mikroszkópos képe

74 Antibiotikumok jellemzése Kémiai szerkezet alapján pl. szénhidrát, makrociklusos, peptid, aromás antibiotikumok Termelı mikróba(k) szerint pl. Streptomyces griseus, Penicillium chrysogenum Hatásspektrum alapján pl. antibakteriális, antifungális, antivirális Hatásmechanizmus alapján pl. sejtfalszintézis gátló, fehérjeszintézis gátló

75 A legfontosabb antibiotikumok (példák) Antibiotikum β-laktám antibiotikumok penicillin cefalosporin Aminoglükozid antibiotikumok sztreptomicin Tetraciklin antibiotikumok oxitetraciklin klórtetraciklin Makrolid antibiotikumok eritromicin Polién antibiotikumok amfotericin B Termelı mikróba Penicillium chrysogenum Cephalosporium acremonium Streptomyces griseus Streptomyces rimosus Streptomyces aureofaciens Streptomyces erythraeus Streptomyces nodosus Hatásspektrum Gram-pozitív baktériumok Sokféle baktérium (széles spektrum) Gram-pozitív baktériumok Sokféle baktérium Gram-pozitív baktériumok Gram-pozitív baktériumok Gombák

76 Antibiotikumok felhasználása 1. Humán gyógyászat - patogén mikróbák ellen - antitumor antibiotikumok 2. Állatgyógyászat - patogén mikróbák ellen - takarmányadalékok (EU rendelet tiltja) 3. Növényvédelem - patogén mikróbák ellen 4. Kutatás (biokémia, mikrobiológia, molekuláris biológia)

77 BAKTERIOCINEK Antibakteriális (bakteriosztatikus vagy baktericid) peptidek és fehérjék, amelyeket Gram-negatív és Gram-pozitív baktériumok termelnek. Hatásspektrumuk szők (csak közelrokon fajok ellen hatásosak). A bakteriocin termelés a termelı baktérium számára szelekciós elınyt biztosít. Bakteriocin gátlási zóna Nincs bakteriocin termeles

78 Bakteriocinek jellemzıi Extracelluláris fehérjék, peptidek Hıstabilok vagy hıre érzékenyek Már kis koncentrációban is kifejtik hatásukat Az ember emésztıenzimei (proteázok) lebontják Általában plazmid kódolja

79 Bakteriocinek és hatásuk (példák) Bakteriocin neve Colicin Termelı mikroorganizmus Escherichia coli Gátolt mikroorganizmusok Eneterobacteriaceae Leukocinek Megacin Nizin (kereskedelmi forgalomban van) Pediocinek Plantanicin Reuterin Szakacin Leuconostoc fajok Bacillus megaterium Lactococcus lactis Pedicoccus acidilactici Lactobacillus plantarum Lactobacillus reuteri Lactobacillus sake Enterococcus faecalis Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Bacillus törzsek Lactobacilllus bulgaricus L. monocytogenes Bacillus törzsek Clostridium botulinum L. monocytogenes Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus Lactobacillus törzsek Salmonella, Clostridium L. monocytogens Lactobacillus, Pediococcus Leuconostoc

80 Bakteriocinek felhasználása 1. Ipari fermentációval történı elıállítás, forgalmazás pl. Nizin (kereskedelmi forgalomban van) 2. Természetes élelmiszer fermentációkban (pl. tejtermékek) a starter kultúrának szelekciós elınyt biztosít 3. Természetes élelmiszer fermentációkban (pl. sajtgyártás) a starter kultúra gátolja a patogéneket (pl. Listeria monocytogenes-t)

81 MIKOCINEK, ZIMOCINEK A mikocinek gombák által termelt kis molekulatömegő, szők hatásspektrumú fehérjék, amelyek más gombákat gátolnak. Az élesztık által termelt mikocint zimocinnek (killer toxinnak) hívják. Érzékeny élesztıgomba metilénkékes táptalajra leoltva Zimocin termelı (Killer) élesztıgomba Gátlási zóna kék peremmel

82 A zimocinek jellemzıi Extracelluláris fehérjetermészető (protein vagy glikoprotein) molekulák Hıérzékenyek ph-érzékenyek (általában 5,5 alatti ph-n inaktiválódnak) Proteázok lebontják Gombavírusok (pl. Saccharomyces cerevisiae, Hanseniaspora uvarum fajoknál) vagy plazmidok (Kluyveromyces lactis faj esetében) kódolják

83 Killer élesztık gyakorlati jelentısége 1. Etanolos erjedési folyamatoknál Killer fajélesztık (borélesztık): Szelekciós elıny a must erjesztése során 2. Természetes élesztıközösségekben a killer törzsek gátolják az érzékenyeket (pl. Pichia) 3. Növényvédelemben: patogén gombák gátlása 4. Gyógyászatban: felszíni mikózisoknál (Hansenula mrakii)