IONCSERÉS KROMATOGRÁFIA

Átírás

1 IONCSERÉS KROMATOGRÁFIA Az ioncserélők olyan szerves vagy szervetlen anyagok, amelyek poláris funkciós csoportjaik réven képesek kationjaikat vagy anionjaikat az oldatban lévőkkel kicserélni. Az ioncserélők általában szilárd halmazállapotú anyagok, de lehetnek vízben nem oldódó folyadékok is. Az ioncserélők funkciós csoportjai lehetnek savak (katex - kationcserélő) vagy bázisok (anex anioncserélő).

2 Ioncserélők típusai 1. Ioncserélő gyanta - sztirol és divinilbenzol kopolimere Stabilak és nyomásállók. Gömb alakú részecskék (emulziós polimerizáció). Aromás gyűrűre viszik fel kémiai reakcióval a megfelelő ioncserélő sajátságú funkcióscsoportokat.

3 Ioncserélő gyanta - sztirol és divinil-benzol kopolimere

4 2. Dextránalapú ioncserélők 1,6-α-glükozid kötésekkel felépített lineáris poliszacharid kevés oldallánccal. M 1000 Da DEAE-Sephadex dextránra kötött dietil-amino-etil CM-Sephadex karboxi-metil csoport O CH 2 COOH Stabilak. Vízben és szerves oldószerekben oldhatatlanok.

5 3. Szilikagél alapú ioncserélők a. Módosított szilikagél (2 ph 8). b. Szerves polimerrel fedett szilikagél (üveggyöngy). Az 1. és 3.b fázisok azok, amelyek nyomás alatt alkalmazhatók, így kis szemcseátmérőjű töltettel töltött kolonnákban használhatók, azaz nagy hatékonysággal üzemeltethetők.

6 4. Aluminium-oxid alapú ioncserélők Amfoter jelleg!!! A hidrált alumínium-oxid anion és kationcserélő formája

7 Gyantához kötött funkciós csoportok KATEX típusú: Rgyanta-SO 3 H erősen savas Rgyanta-COOH közepesen savas Rgyanta-OH gyengén savas ANEX típusú: Rgyanta-NR 3 OH erősen bázisos Rgyanta-NH 3 OH közepesen bázisos Ioncserélő kapacitás: megkötött ellentétes töltésű ion mennyiség egységnyi tömegű tölteten (mmol/g vagy mekv./g).

8 Kationioncsere: Rgyanta-SO 3 H + Na + Rgyanta-SO 3 Na + H + Az oldatban lévő Na + ionok a ioncserélő gyantára kötődnek, miközben ekvivalens mennyiségű H + ionok kerülnek az oldatba. Eluensként híg, erős savakat használnak. Anioncsere: Rgyanta-N(CH 3 ) 3 OH + Cl - Rgyanta- N(CH 3 ) 3 Cl + OH - Vagyis a gyantára kötött OH - ionok szabadulnak fel. Eluensként bázisos oldatokat használnak.

9 Anioncserélők - jellemzőjük, hogy az állófázis felületén rögzített pozitív töltések találhatók az elválasztás körülményei között. Kationcserélők - jellemzőjük, hogy az állófázis felületén rögzített negatív töltések találhatók az elválasztás körülményei között. Erős anioncserélők azok, amelyek ioncserélő kapacitása független az eluens ph értékétől. Ilyenek a kvaterner-ammónium vegyületek (pl. trimetil-ammónium, Type I).

10 Gyenge anioncserélők, ezeknél a fázisoknál az ioncserélő kapacitása az eluens ph értékének függvénye. Ilyen csoportok a primer, a szekunder és tercier aminok.

11 Gyenge kationcserélők állófázis szerkezete és kapacitás függése a mozgó fázis ph értékétől

12 Ionok kötödésének erőssége függ: Ionméret (hidrodinamikai) és fajlagos töltés. Eluens jellemzőitől (víz, só, szerves oldószer elegye): puffer ion-koncentrációja, puffer ph-ja, alkalmazott szerves módosítok (metanol, etanol, glicerin, butanol, acetonitril), ellenion, mely a meghatározandó összetevővel verseng és ennek a folyamatnak az eredménye megszabja a visszatartást és a szelektivitást.

13 Retenciós sorrend Anionok: F - < OH - < acetát - < Cl - < SCN - < Br - < NO 3 - < I - < oxalát 2- < SO 4 2- < citrát 3- Kationok: Li + < H + < Na + < NH 4 + < K + < Ag + < Mg 2+ < Zn 2+ < Cu 2+ < Ni 2+ < Ca 2+ < Ba 2+

14 Anionok meghatározásakor többértékű gyenge savakat (pl. benzoesav, o-ftálsav, citromsav, borkősav) teszünk a mozgó fázisba, ezek ionos formái szolgáltatják az ellenionokat., eluenserősség Az o-ftálsav ionizációjának és eluenserősségének függése a mozgó fázis ph értékétől

15 Kationok elválasztásakor többértékű gyenge bázisokat (pl. etilén-diamin, 2-metil-piridin) teszünk a mozgó fázisba, ezek ionos formái szolgáltatják az ellenionokat. A visszatartást megszabó folyamatok komplexképzőt és szerves bázist tartalmazó mozgó fázis alkalmazásakor

16 DETEKTÁLÁSI MÓDSZEREK Az ionkromatográfiában fő detektálási módszer a mozgó fázis vezetésének figyelése, mérése. Az egykolonnás ionkromatográfiában ez egy átfolyó mérőteres vezetőképességi cellát jelent. Meghatározások 95%-ában. 5 ppb 1 ppm, 5 ug/l - 1mg/L kimutatási határ. Ion folyadékkromatográfiában csak néhány ionnak van az UV, vagy a látható fénytartományban fényelnyelése. Ezek például a jodid, nitrit, nitrát, jodát, kromát, permanganát. A kationok meghatározásánál használhatunk kolonna utáni (postcolumn reaction) vagy kolonna előtti (precolumn reaction) származékképzést, s így színes komplexeket kapunk.

17 Két kolonnás ionkromatográfia

18 Ion elnyomás (supressed ion chromatography) ioncserekromatográfiánál két kolonnás módszer cél: a mozgófázis vezetőképességének csökkentése a detektálás előtt Klorid ion mérése Az ionelnyomóban (erős kation cserélő oszlop H formában) lejátszódó folyamatok, ha az eluens puffere NaHCO 3, vagy Na 2 CO 3 : Gyanta-SO 3- H + + Na + Gyanta SO 3 - -Na + + H + H + + HCO 3 - H 2 CO 3 H + + Cl - HCl A mozgófázis vezetőképessége csökken (Na + H 2 CO 3 ). Az elválasztott ion vezetőképessége megnő (NaCl HCl).

19 ELVÁLASZTÁSOK 1. Kationok elválasztása kationcserélő gyantaoszlopon 1=litium, 2=nátrium, 3=ammónium, 4=kálium, 5=magnézium, 6=kalcium

20 2. Kationok elválasztása anioncserélő gyantaoszlopon (Varion AB) Fémionok klorokomplexeinek elválasztása kloridformájú anioncserélő oszlopon. Ni 2+ klorokomplexe [NiCl] + oszlopon nem kötődik Co 2+ [CoCl 4 ] 2- stabil-klorokomplex oszlopon kötődik Klorid koncentráció növelésével eluálható az oszlopról. 3. Vízanalitikában a főbb ionok, különösen az anionok klorid, szulfát, stb. mérésére.!!!! 4. Vízlágyítás: Ca 2+ és Mg 2+ ionok Na + -ra cserélése. 5. Hidrofil szerves anyagok elválasztása

21 Vízanalitika, ásványvízek

22 5. Automatikus aminosav analizátor Erősen savas kationcserélő gyantán történik az aminosavak elválasztása. Az aminosavak kötődését nagyon sok tényező befolyásolja, alapvető szerepe a ph-nak és az ellenion koncentrációnak van. Alacsony ph-n az aminosavak kationként viselkednek. A ph növelésével egyre kevésbé, az izoelektromos pont elérésekor és magasabb ph-n egyáltalán nem kötődnek a gyantához.

23 Az aminosavakat erősen savas oldatban visszük fel az oszlopra, hogy a megkötődés azonnal bekövetkezzék. Az elúcióhoz ph 3-10 közötti pufferek széles skálája használatos. Az elúció leggyakrabban lépcsős gradiens elúció, azaz 3-4, fokozatosan növekvő ph-jú és ellenion koncentrációjú pufferrel történik az elválasztás. Az oszlopról távozó eluátumban az aminosavak mennyiségét általában ninhidrines színreakcióval határozzák meg. A fotometrálás átfolyó küvettás detektorban történik. Az aminosavak többsége (a primer aminok) a ninhidrinnel liláskék színreakciót ad ami 570 nm-en fotometrálható. A szekunder aminok (prolin, hidroxiprolin) a ninhidrinnel sárga színű terméket képeznek, ami 440 nm-en mérhető.

24 Aminosavak reakciója ninhidrinnel

25 Peptidek elemzése H 2 N- Met Ala Asn Cys His Glu Ser Thr Glu Arg-COOH His: 6,0 Glu: 4,1 Arg: 12,5 N-terminális amin: 8,0 C-terminális karboxil: 3,1 A fenti peptidre: pi= pka/n= 6,3 Netto pozítiv töltés ph < 6,3 Netto negatív töltés ph > 6,3

26 Ionkizárásos folyadékkromatográfia

27 Gyanta: nagy ioncserélő kapacitású kationcserélő. Elválasztás alapja: alkoholok, szénhidrátok és szerves savak disszociálatlan formában be diffundálnak a pórusokba hidrofób kölcsönhatás, H-híd a protonált ioncserélő csoportokkal. Mozgófázis: 0,01 0,001 M kénsav, vagy salétromsav, esetenként v/v% acetonitril.

28 Fermentlevek tisztítása Savak, alkoholok és cukrok elválasztása

29 GÉLKROMATOGRÁFIA Szinonim elnevezések: gélszűrés, molekulaszűrés, méretkizárásos kromatográfia, géláthatolási kromatográfia. Egyike a legfontosabb biokémiai eljárásoknak. Elsősorban biológiai makromolekulák tisztítására alkalmazzák. 30 éve alkalmazott technika. Fordított szűrő!

30 Gélképző anyagok 1. Természetes gélképző anyagok Agaróz: D-galaktóz és 3,6-anhidro-L-galaktóz egységekből felépített lineáris poliszacharid. Sepharose 2. Félszintetikus gélképző anyagok Dextrán: glükózegységekből 1,6-α-glükozid kötésekkel felépített lineáris poliszacharid, kevés oldallánccal. Sephadex A nyers dextrán részleges hidrolizsével nyert dextránfrakciók lúgos oldatához epiklórhidrint (CH 2 -CH-CH 2 -Cl) adnak. Végtermék : O Dextrán-O-CH 2 -CHOH-CH 2 -O-dextrán A keresztkötések számával csökken a gélek pórusmérete és annak a molekulaméretnek a határértéke, amely a gél szerkezetébe még éppen behatolhat.

31 3. Szintetikus gélképző anyagok Akrilamid-akrilát kopolimerek: akrilamid és a N,N - metilén-bisz-akrilamid kopolimerizációjával állítják elő. A pórusméretet elsősorban az akrilamid koncentrációja, másodsorban a keresztkötéseket létrehozó N,N - metilén-bisz-akrilamid aránya határozza meg. Kereskedelmi forgalomban a Bio-Gel P típusok vannak. Előnyük, hogy a szemcsék ridegebbek, mechanikai hatásoknak ellenállóbbak, valamint a bakteriális hatások iránt közömbösek.

32

33 A GÉLKROMATOGRÁFIA ALKALMAZÁSI TERÜLETEI 1. Makromolekulák sómenetesítése 2. Puffercsere Minta előkészítése pufferváltással ioncseréhez, vagy affinitás kromatográfiához. 3. Reakciók lezárása makromolekulák és alacsony molekulatömegű reagensek között. 4. Frakcionálás Hasonló molekulaméretű anyagok elválasztása gél (megfelelő frakcionálási tartomány) helyes megválasztása elsődleges. 5. Polimerek móltömeg eloszlása 6. Molekulatömeg meghatározás ismert tömegű fehérje standard oldatokkal kalibráció.

34 A 570 nm Vezetőképesség (μs) Makromolekulák sómenetesítése

35 Álló- és mozgófázisok megválasztása Mágikus háromszögek

36

37 Lg M Lg M V 0 = szemcsék közötti térfogat V i = pórustérfogat teljes kizárási M mérési tömeg teljes áteresztési M V (ml)

38

39 Polimerek elválasztása

40 AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA Az affinitás kromatográfia olyan típusú adszorpciós kromatográfiás eljárás, amelyben a tisztítandó anyag specifikusan és reverzibilisen adszorbeálódik a ligandhoz, amely egy oldhatatlan anyagon (mátrix) van rögzítve. 20 éve alkalmazott technika. Koncentráló hatású. Nagyfokú szelektivitás jellemzi.

41 ALKALMAZÁSA 1. Anyagok tisztítására (enzim, antitest) komplex biológiai elegyekből. 2. Ugyanazon anyag natív formájának elválasztására a denaturált anyagtól. 3. Receptorok, enzimek, DNS fragmensek izolálása. 4. Az ipari biotechnológiai alkalmazásokban monoklonális antitestek gyártása.

42 Mátrix tulajdonságai: Oldhatatlan az alkalmazandó pufferekben és oldószerekben. Mechanikailag és kémiailag stabil, jó átfolyási tulajdonságokkal. Könnyen kapcsolható a ligandhoz. Ligand tulajdonságai: Specifikus és reverzibilis kötődési affinitással kell rendelkeznie a tisztítandó anyaghoz. Megfelelő kémiai csoportokkal kell rendelkeznie a mátrixhoz való kötödés érdekében.

43 1. Agaróz Mátrix fajták D-galaktóz és 3,6-anhidro-L-galaktóz egységekből felépített lineáris poliszacharid. Sepharose (lsd. gélkromatográfia)

44 2. Poliakrilamid (lsd. gélkromatográfia) A poliakrilamid-gyöngyök szintetikus akrilamid polimerek, melyeket bisz-akrilamidos keresztkötésekkel megfelelően szilárd mátrixanyaggá alakítanak. Hátránya: - mechanikailag kevésbé stabil; - erősen tapad az üvegfelületekhez. 3. Szabályozott pórusú üveg Legáltalánosabban alkalmazott szervetlen mátrix. Előnye: nagy mechanikai stabilitása. Használat: enzimek immobilizálása, melyeket biokatalizátorként alkalmaznak a biotechnológiai folyamatokban.

45 Az affinitáskromatográfiás elválasztás lépései: 1, A tisztítandó anyag megkötése. Kialakuló kölcsönhatások: - elektrosztatikus; - hidrofób; - hidrogénhídkötések. Minta oldása megfelelő felvivő pufferben. 2, A nem kötődött anyagok kimosása (10 oszloptérfogat pufferrel). 3, Elució kölcsönhatások megszüntetése 1, Szelektív elució: biospecifikus elució, melyben az eluálószer a, vetélkedik a liganddal a szelektíven kötött anyagért (leoldás) b, vetélkedik a megkötött anyaggal a ligandért (leszorítás)

46 a, Elution of NADP dependent enzymes from Blue Sepharose by adding NADPH b, Elution of HIS tagged proteins from HiTrap Chelating by adding imidazole.

47 Ni-NTA gyanta His tagged proteinek tisztítására Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC)

48 2, Nem szelektív elució, sokszor denaturálódást jelent: a, ph változtatása megváltoztatja a töltéssel rendelkező csoportok ionizáltsági fokát a kötő helyeken deszorpció b, ionerősség változtatása növekvő ionerősségű puffer használatával ( pl. NaCl, 1 mólos végkoncentrációban).

49 Alkalmazás Fenil boronát affinitás kromatográfia - 1,2 és 1,3 cisz-diol csoportot tartalmazó cukrok kőtödnek hozzá borsavkomplexek Lúgos közegben stabil savval, szorbittal megbontható

50 Fetuin elválasztása