SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA KLINIKAI ORVOSTUDOMÁNYOK

Átírás

1 SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA KLINIKAI ORVOSTUDOMÁNYOK 1-es típusú cukorbetegség és egypontos nukleotid polimorfizmusok közötti összefüggések vizsgálata Doktori Értekezés Dr.Krikovszky Dóra Témavezeto: Prof. Dr. Madácsy László Programvezeto: Prof. Dr. Tulassay Tivadar Készült: Semmelweis Egyetem I.sz Gyermekklinika Budapest,

2 Ph.D. Doktori Értekezés 1-es típusú cukorbetegség és egypontos nukleotid polimorfizmusok közötti összefüggések vizsgálata Krikovszky Dóra Témavezeto: Prof. Dr. Madácsy László, egyetemi tanár Semmelweis Egyetem I.sz Gyermekklinika, 2004 ÖSSZEFOGLALÓ Az 1-es típusú diabetes (T1DM) és a betegség során fellépo szövodmények kialakulásában egyaránt fontos szerepet játszanak genetikai faktorok. A T1DM kialakulásához vezeto gyulladásos folyamatban szerepet játszó fehérjék génjein olyan polimorfizmusok helyezkedhetnek el, melyek a gén által kódolt fehérje mennyiségi, vagy minoségi változása révén játszhatnak fontos szabályozó szerepet a betegség kialakulásában. Munkánkban a TNFa G -308 A - és G -238 A -, IL-1ß C 3954 T -, TNFß A 252 G -, IL-6 C G -, IL-18 G -137 C - és C -607 A -, HSP72 G 1267 C -, TLR A 896 G -, D-vitamin receptor FokI, BsmI, TaqI, ApaI, TruI hasító enzimmel kimutatható -, illetve Gbéta3 C 825 T egypontos nukleotid polimorfizmusának (SNP) meghatározását végeztük el. A vizsgálatba összesen 326 T1DM-ban szenvedo gyermeket vontunk be. A T1DM kialakulásával a TNFa G -308 A -, IL-1ß -, TNFß -, IL-18 C -607 A - és a HSP72 polimorfizmus mutatott összefüggést. T1DM betegek között azon allélek prevalenciája volt nagyobb, melyek nagyobb mennyiségu proinflammatorikus citokin elválasztással (TNFa, IL-1ß, TNFß és IL-18), illetve csökkent mennyiségu anti-inflammatorikus fehérje termelésével járnak (HSP72), így a ß-sejtek pusztulásához vezeto autoimmun folyamat kialakulásában, illetve fenntartásában egyaránt szerepet játszhatnak. Az IL-6 G -174 C polimorfizmus a T1DM kialakulásának idejével (életkor) mutatott összefüggést. A nagyobb mennyiségu IL- 6 elválasztással járó -174 G allélt hordozókban idosebb életkorban diagnosztizálták a betegséget. A TNFa G -308 A polimorfizmusa összefüggést mutatott a diabeteses gyermekek 24 órás vérnyomás monitorozás során nyert vérnyomás standard deviációs pontértékekkel (SDS). A nagyobb mennyiségu TNFa elválasztással járó A allél jelenléte alacsonyabb vérnyomás értékekkel társult. A munkánkban talált összefüggések hozzájárulhatnak a T1DM-re, illetve a T1DM betegeknél kialakuló magas vérnyomásra való genetikai hajlam megismeréséhez. 2

3 Ph.D. Thesis Investigation of association between single nucleotide polymorphisms and Type 1 diabetes Dóra Krikovszky, MD Supervisor: László Madácsy, MD, PhD, DSc I. Department of Paediatrics, Semmelweis University, 2004 SUMMARY Genetic factors play an important role in the pathogenesis of both type 1 diabetes mellitus (T1DM) and its complications. The genes of the inflammatory proteins which contribute to the development of T1DM may contain certain polymorphisms. These polymorphisms might play an essential role in the pathogenenesis and progression of T1DM by influencing the quality or the quantity of the protein coded by the gene. In our study we investigated the association between TNFa G -308 A - and G -238 A -, IL-1ß C 3954 T -, TNFß A 252 G -, IL-6 C -174 G -, IL-18 G -137 C - and C -607 A -, HSP72 G 1267 C -, TLR A 896 G -, vitamin D receptor - and Gbeta3 C 825 T single nucleotide polymorphisms (SNP) and T1DM and its complications in 326 T1DM children. The TNFa G -308 A, IL- 1ß, TNFß, IL-18 C -607 A and HSP72 polymorphisms were associated with T1DM. The alleles which had a higher prevalence among the patients were those associated with a higher secretion of proimflammatory cytokines (TNFa, IL-1ß, TNFß és IL-18) or a lower production of anti-inflammatory protein (HSP72). Thus these alleles can play a role in both the development and the maintenance of an autoimmune process leading to the destruction of ß-cells. The IL-6 G -174 C polymorphism correlated with the age at the onset of T1DM. T1DM was diagnosed at an older age in those patients who carried the G allele associated with a higher IL-6 secretion. TNFa G -308 A polymorphism has shown significant correlation with the standard deviation score (SDS) values of the ambulatory blood pressure monitoring (ABPM) results of T1DM children. The presence of the -308 A allele, associated with a higher secretion of TNFa corresponded to lower blood pressure values. The associations found in our work can contribute to the detection of the genetic risk for T1DM and also for the genetic risk of hypertension among T1DM patients. 3

4 RÖVIDÍTÉSEK: ABPM BB C AMC GADA HbA 1C HLA HSP72 IAA IA-2 ICA ICSA IL-1ß IL-6 IL-18 inos NK NO NOD PCR RPLP SDS SNP T1DM TLR TNFa TNFß 24 órás vérnyomás monitorozás biobreeding (patkány) citotoxikus szigetsejt ellenes antitest glutaminsav dekarboxiláz ellenes antitest hemoglobin A 1C humán leukocita antigén hosokk-(stressz)fehérje inzulin ellenes antitest tirotin-foszfatáz ellenes autoantitest szigetsejt-ellenes antitest szigetsejt ellenes felszíni antitest interleukin-1ß interleukin-6 interleukin-18 indukálható nitrogén-oxid-szintáz természetes ölosejt nitrogén-monoxid non-obese diabetic (egér) polimeráz láncreakció restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus standard deviációs pontérték egypontos nukleotid polimorfizmus 1-es típusú cukorbetegség toll-like receptor tumor necrózis factor-a tumor necrózis factor-ß 4

5 TARTALOMJEGYZÉK: 1. BEVEZETÉS T1DM patomechanizmusa T1DM-re való örökletes hajlam A T1DM genetikai háttere genome wide scan A T1DM genetikai háttere single nucleotid polymorphism (SNP) Tumor necrosis factor-a (TNFa) Interleukin-1ß (IL-1ß) Tumor necrosis factor-ß (TNFß) Interleukin-6 (IL-6) Interleukin-18 (IL-18) Heat shock protein 72 (HSP, stresszfehérje) Toll-Like receptor-4 (TLR) D-vitamin receptor G-fehérje (GTP(guanozin-trifoszfát)-köto fehérje) CÉLKITUZÉS MÓDSZEREK Vizsgált populáció Betegek Kontroll csoport Polimeráz láncreakció (PCR) - restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus (RFLP) módszer Statisztikai elemzés EREDMÉNYEK A Hardy-Weinberg egyensúly (HWE) fennállásának vizsgálata T1DM és kontroll populációk allélgyakoriságának összehasonlítása A vizsgált polimorfizmusok és a betegek klinikai adatai közti kapcsolat vizsgálata Nemi különbségek T1DM kezdete ICA pozitivitás Fizikális jellemzok Testsúly Testmagasság Testtömeg-index (body mass index, BMI) Inzulinigény Átlagos HbA 1C érték Cöliákia Vérnyomás - ABPM (ambulatory blood pressure monitoring) eredmények MEGBESZÉLÉS A vizsgált polimorfizmusok és a T1DM, illetve a szövodményeként kialakuló magas vérnyomás közötti kapcsolat TNFa G -308 A és G -238 A SNP összefüggése a T1DM kockázatával és a betegek vérnyomás értékeivel IL-1ß C 3954 T SNP összefüggése a T1DM kockázatával TNFß A 252 G SNP összefüggése a T1DM kockázatával IL-6 C -174 G SNP összefüggése a T1DM kockázatával

6 IL-18 G -137 C és C -607 A SNP összefüggése a T1DM kockázatával HSP72 G 1267 C SNP összefüggése a T1DM kockázatával TLR-4 A 896 G SNP összefüggése a T1DM kockázatával VDR FokI, BsmI, TaqI, ApaI, TruI hasítóenzimmel kimutatható SNP-k összefüggése a T1DM kockázatával Gß3 C 825 T SNP összefüggése a T1DM kockázatával és a betegek vérnyomás értékeivel KÖVETKEZTETÉSEK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS: IRODALOMJEGYZÉK: SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE.., Az értekezés témájában Az értekezés témájához részben kapcsolódó Az értekezés témájától független 69 6

7 1. BEVEZETÉS január 11-én Frederick Grant Banting és Charles Herbert Best az általuk tisztított inzulin elso klinikai alkalmazása során sikerrel kezeltek egy reménytelen állapotban kórházba szállított - 14 éves cukorbeteg gyermeket 1. Az inzulin eloállítása kezelhetové tette az addig egyértelmuen halálos betegséget. A további klinikai tapasztalatok azonban felfedték, hogy az inzulinnal kezelt betegeknél látszólag elháríthatatlan, hosszú távú szövodmények alakulnak ki vaksághoz, veseelégtelenséghez, perifériás és szívérbetegséghez vezetve. Az 1-es típusú cukorbetegség (T1DM) krónikus betegséggé vált, jelentos morbiditással és korai halálozással T1DM patomechanizmusa A T1DM a hasnyálmirigy ß-sejtjeinek folyamatos pusztulását okozó autoimmun folyamat következménye. A ß-sejtek károsodása a betegség diagnosztizálása elott évekkel kezdodik és az inzulin hiánya csak a sejtek kb.80%-ának elpusztulása esetén lesz olyan fokú, hogy a hiperglikémia okozta klinikai tünetek a T1DM diagnózis felállításához vezetnek 2 és exogén inzulin adása válik szükségessé (1. ábra). ß-sejt állomány 100% 1 Genetikai hajlam 2 ß-sejtek autoimmun károsodásának kezdete 3 ß-sejtek fokozatos pusztulása 4 T1DM kialakulása 50% 5 Klinikai remisszió 15% 0% Ido (év) ábra A diabetes kialakulásának folyamata 7

8 A ß-sejtek pusztulásához vezeto folyamat autoimmun természetét számos vizsgálat támasztja alá. Újonnan diagnosztizált cukorbetegek Langerhans-szigeteinek mononukleáris limfocitás beszurodését (inzulitis) eloször Gepts 3 írta le (2. ábra). 2. ábra Egészséges hasnyálmirigy ß-sejtjei (balra) és a Langerhans sziget limfocitás infiltrációja (jobbra). Ezt követte az ICA (islet cells autoantitest) felfedezése 4. A betegek 85-90%-ában a diagnózis felállításakor ß-sejt fehérjékre specifikus keringo autoantitestek mutathatók ki (1. táblázat) 5,6. Rövidítés Diagnosztikus Prediktív értéke Szenzitivitás Specificitás Elsofokú rokonokban Átlagpopulációban ICA 80-90% 96-99% 20-50% 20-30% ICSA 30-60% 95% nem ismert nem ismert C AMC 40-60% 95% nem ismert nem ismert IAA 40-70% 99% <50% nem ismert GADA 70-90% 99% >50% nem ismert 1. táblázat Különbözo, ß-sejt fehérjékre specifikus keringo autoantitestek. ICA: Szigetsejt ellenes antitestek; ICSA: Szigetsejt ellenes felszíni antitestek; C AMC: Citotoxikus szigetsejt ellenes antitestek; IAA: Inzulin autoantitestek; GADA: Glutaminsav dekarboxiláz ellenes antitestek Solow és mtsai 7 és Sachs és mtsai 8 a betegség HLA (Human Leukocita Antigén) II osztályú allélekkel való összefüggését írta le. Harrison és mtsai 9 és Silverstein és mtsai 10 immunszupresszív szerek adásával csökkenteni tudták a betegek inzulin szükségletét. A betegség autoimmun természetét támasztja alá a T1DM gyakori társulása egyéb, ismert 8

9 autoimmun betegséggel 11 (thyreoiditis, cöliákia, Addison kór, myasthenia gravis, autoimmun gastritis, vitiligo). Bár teljes mértékben nem lehet kizárni, hogy az autoimmun folyamatot a ß-sejt hibás volta indítja el 12, semmilyen bizonyíték nem utal az autoantigén abnormalitására. Ezzel szemben az immunrendszer kóros muködését számos kutatómunka támasztja alá. Cukorbetegek csontvelejébol származó sejtek átültetésével emberben 13,14 és egérben 15,16,17,18 is átviheto volt a betegség nem cukorbetegekre. Az immunfolyamatban dönto szerepet játszanak a T limfociták (3. ábra). A ß-sejt antigénre specifikus immunválasz során autoreaktív CD8 + T-sejtek kapcsolódnak a ß- sejtekhez. A T-sejtek felismerik a ß-sejtek felszínén MHC I által bemutatott ß-sejt antigéneket. Ezt követoen citotoxikus T-sejtek aktiválódnak, amik receptor közvetítette úton (Fas/FasL), vagy citotoxikus molekulák elválasztásával (perforin, granzimfehérjék) 19 pusztíthatják el a ß-sejteket. Szintén a ß-sejtek pusztulását okozhatja a nem-specifikus immunválasz, amit a T-sejtek és macrofágok által elválasztott vegyületek - a gyulladásos (proinflammatorikus) citokinek és a szabadgyökök - közvetítenek. Rabinovitch és mtsai 20 igazolták, hogy a ß-sejtek érzékenyek az oxigén szabadgyökök és a nitrogén-monoxid (NO) okozta károsodásra. 9

10 FasL IFN-? Inzulin IFN-? IL-12 TNF IFN-? TNF Fas HSP72 IL-1 IFN-? FasL IL-10 IL-10 TGF-ß IL-10 IFN-? TNF-a IL-2 IL-4 FasL 3. ábra A hasnyálmirigy gyulladásos beszurodése cukorbetegségben. A ß-sejtek károsodását okozhatják citokinek, Fas-FasL kapcsolódás, vagy perforin és granzimfehérjék. MO: monocita; T c : citotoxikus T-sejt; T H : T-helper sejtek (segíto T-sejtek); NK: természertes ölosejtek; DC: dendritikus sejt; B: B-limfocita 1.2. T1DM-re való örökletes hajlam A T1DM multifaktoriális betegség, azaz a megfelelo környezeti faktorok és a hajlamosító gének együttes hatása felelos a kialakulásáért. Genetikai faktorok szerepét számos vizsgálat igazolta. Családvizsgálatok kimutatták, hogy T1DM-ben szenvedo betegek elsofokú rokonai között gyakoribb a megbetegedés (5-6%) 21,22, mint az átlagpopulációban (0.4%). Egypetéju ikreknél 30-40%-os a konkordancia 23,24, míg HLA identikus testvéreknél kb.10-16% 25,26. 10

11 A T1DM genetikai háttere genome wide scan Genom wide scan eljárással számos kromoszóma szakaszt összefüggésbe hoztak a betegséggel (2. táblázat), azonban az e szakaszokon elhelyezkedo gének és a hozzájuk tartózó fehérjék funkciója többségében még nem ismert. Lokusz Kromoszóma Gén Hivatkozás IDDM1 6p21.3 HLA DR/DQ IDDM2 11p15.5 INSULIN VNTR 28,29,30 IDDM3 15q26 31,32 IDDM4 11q13.3 MDU1, ZFM1, RT6, ICE, LRP5, FADD, CD3 33,34,35,36,37 IDDM5 6q25 MnSOD 33,34,38,39,40 IDDM6 18q12-q21 JK (Kidd), ZNF236 41,42 IDDM7 2q31-33 NEUROD 34,43 IDDM8 6q ,33,34 IDDM9 3q IDDM10 10p11-q11 34,45 IDDM11 14q24.3-q31 ENSA, SEL-1L 46 IDDM12 2q33 CTLA-4 47 IDDM13 2q34 IGFBP2, IGFBP5, NEUROD, HOXD8 48 IDDM15 6q21 39 IDDM17 10q25 49 IDDM18 5Q IL12B táblázat - T1DM-re való hajlamot hordozó lokuszok (ismert gén) 27 A HLA II osztályú (IDDM1) gének (6p21 kromoszóma szakaszon, 4. ábra), a DRB1 és DQB1 mutatják a legszorosabb összefüggést a T1DM-val (3. táblázat). Feltehetoen ennek egyik oka, hogy az általuk kódolt MHC II molekulák jól tudják kötni és a T- sejtek felé prezentálni a betegség kialakulásában szerepet játszó trigger faktorokat. Ezen kívül a DR és DQ gének által kódolt molekulák valószínuleg központi szerepet játszanak a ß-sejtek pusztulását okozó, autoreaktív T-sejtek thymusban való kiválasztódásában és aktiválódásában. 11

12 HLA-DR DQA1 DQB1 DRB1 Hajlam DR Véd DR Hajlamosít DR Nincs hatása DR Erosen hajlamosít DR Erosen hajlamosít DR Hajlamosít DR Nincs hatása DR Hajlamosít DR Erosen hajlamosít DR Nincs hatása DR Nincs hatása DR Véd DR Véd DR Hajlamosít 3. táblázat - HLA II osztályú DR-DQ kapcsoltsági minták és T1DM-re való hajlam kaukázusi rasszban. Tel Hosszú kar Cen Rövid kar Tel 6-os kromoszóma HLA régió 6p II osztály III osztály I osztály Bf DP DM DQ DR C4 C2Hsp70TNF B C E A G F Humán Leukocita Antigén (HLA) régió géntérképe 4. ábra A Humán Leukocita Antigén (HLA) régió géntérképe 12

13 Az inzulin génjén található variable number tandem repeat (VNTR) régió (11p15 kromoszóma szakaszon) szintén T1DM-re hajlamosító faktornak bizonyult (IDDM2 gén, 2. táblázat), bár a pontos hatásmechanizmus nem ismert. A HLA identikus testvérek egypetéju ikreknél alacsonyabb konkordanciája arra utal, hogy további, nem-hla gének is szerepet játszanak a betegség kialakulásában A T1DM genetikai háttere single nucleotid polymorphism (SNP) A T1DM kialakulásához vezeto autoimmun folyamatban számos fehérje szerepét igazolták 20. Ezen fehérjék génjein olyan polimorfizmusok (single nucleotid polymorphism. SNP) helyezkedhetnek el, amik a kódolt fehérje mennyiségi, vagy minoségi változásán keresztül befolyásolhatják a T1DM kialakulását, vagyis a genetikai hajlam hordozói lehetnek. Ezen gének által kódolt információk azonban nem csak a betegség kialakulását, de annak klinikai lefolyását is jelentosen befolyásolhatják (5. ábra) GÉN VDR FokI, BsmI, TaqI, ApaI, TruI HSP A IL-1ß 3954 T IL C IL G TNFß 252 G TNFa -238 A IL G TLR4 896 A TNFa -308 A FEHÉRJE VDR HSP72 IL-1ß IL-18 IL-6 TLR4 TNFß TNFa TNFa Gß3 Gß3 825 T Hipertónia A polimorfizmus hatása a fehérje termelésre, illetve a fehérje hatása a T1DM kialakulására: serkenti, fokozza gátolja, csökkenti nem ismert a hatása. 5. ábra T1DM kialakulásában szerepet játszó egyes fehérjék és az oket kódoló gének polimorfizmusainak hatása az elválasztott fehérje mennyiségére. Az ábrán az általunk vizsgált polimorfizmusokat tüntettem fel. 13

14 Tumor necrois factor-a (TNFa) A citokint elsosorban makrofágok termelik. Az immunregulációs folyamatok és ezek anyagcsere hatásainak egyik legfontosabb mediátora; gyulladást elosegíto (proinflammatorikus) és citotoxikus hatása révén pedig számos betegség patogenezisében meghatározó szerepet játszik. Kis koncentrációban aktiválja a védekezo gyulladásos reakciókat. Az ér endotél sejtjeiben adhéziós molekulák elválasztását serkenti, ezáltal neutrofilek, monociták és limfociták megtapadását segíti elo. Részt vesz a specifikus immunválasz koordinálásában is, hatására fokozódik a B limfociták immunglobulin termelése. A spontán kifejlodo diabetes két állatmodeljének, (non-obese diabetic (NOD) 51 egér és biobreeding (BB) patkány 52 ) szigetsejtjeiben jelenléte a ß-sejtek pusztulásához vezeto insulitis kialakulásával összefüggést mutatott. Izolált human ß-sejtekre pedig in vitro toxikusnak bizonyult. Génje a 6-os kromoszóma rövid karján, a 21:3 lokuszon helyezkedik el 53, az MHC III.osztályú régiójában (4. ábra). Több DNS szintu polimorfizmusa ismert. A promoter régió 308-as helyén leírt G/A polimorfizmus (G -308 A) befolyásolja a - különbözo stimulusokra - termelodo TNFa mennyiségét. Az A allélt hordozó ( -308 GA) sejtek 20-40%-kal több TNFa-t termelnek, mint a -308 GG genotípusúak 54,55. Pociot 56, Cox 57 és Deng 58 a T1DM-ben szenvedo betegeknél a -308 A allél gyakoribb elofordulását írták le, amit többségében a polimorfizmus HLA-DR3-mal való kapcsolt öröklodésének tulajdonítottak. Több tanulmány talált összefüggést a TNFa gén promoter régió 238-as helyén található G/A polimorfizmus (G -238 A) és autoimmun 59,60,61, -, illetve gyulladásos 62,63,64 betegségek között, bár a polimorfizmus TNFa elválasztásban betöltött szerepe vitatott 61, Interleukin-1ß (IL-1ß) Az IL-1 a TNFa-hoz hasonlóan a proinflammatorikus citokinek közé tartozik. Elsosorban a makrofágok és monociták termelik. Gyulladást elosegíto hatásai a TNFa- 14

15 hoz hasonlóak, de nem vált ki daganatszövet-necrosist. Két alcsoportja ismert, az IL-1a és az IL-1ß. Az IL-1ß központi szerepet játszik a ß-sejtek károsodásában és pusztulásában 66, 67 : patkány szigetsejtekhez adva növeli az indukálható nitrogén-oxid-szintáz (inos) expresszióját, a NO elválasztás mértékét és gátolja az inzulin szekrécióját 68,69,70,71,72. Mind NOD egerekben, mind BB patkányok szigetsejtjeiben a citokin összefüggést mutatott a ß-sejtek pusztulásához vezeto insulitis kialakulásával, izolált human ß- sejtekre pedig in vitro toxikusnak bizonyult 73. Az IL-1ß-t kódoló gén a 2q14-es kromoszóma szakaszon található. Az exon 5 régiójában található C 3954 T polimorfizmus befolyásolja a - különbözo stimulusokra - elválasztott IL-1ß mennyiségét: a 3954 T allél hordozás nagyobb mennyiségu IL-1ß elválasztással jár együtt 74. A polimorfizmus T1DM-ben betöltött szerepérol korlátozott adatok állnak rendelkezésre 74, Tumor necrosis factor-ß (TNFß) A TNFß-t, vagy más néven limfotoxint kizárólag az aktivált T-sejtek (Th 1 -sejtek) termelik. Az 1-es típusú citokinek közé tartozik, amelyekre elsosorban a sejtes immunválasz aktiválása a jellemzo. A TNFa-hoz hasonlóan képes daganatsejtek lízisét kiváltani, normális sejteket azonban nem lizál. Aktiválja a neutrofil granulocitákat, fokozza a vascularis adhéziót és a leukociták kilépését az érpályából. A TNFa-val közös receptorhoz kötodik és szerepet játszik a limfoid szövetek fejlodésében is. NOD egerek szigetsejtjeiben az insulitis kialakulásával összefüggést mutatott és izolált human ß-sejtekre in vitro toxikusnak bizonyult. A TNFß-t kódoló gén a TNFa-hoz hasonlóan a 6p21.3. kromoszóma szakaszon, az MHC III. osztályú helyén található (4. ábra). Az 1. intronjában (TNFB) található polimorfizmus (A 252 G) Nco I nevu restrikciós endonukleázzal vizsgálható. Az enzim hasítása esetén a 252 G allél (TNFB * 1), ellenkezo esetben a 252 A allél (TNFB * 2) van jelen G allél fehér populációkban ritkábban fordul elo és a nagyobb mennyiségu TNFß elválasztás mellett a TNFa termelés mértékét is növeli 77,78. 15

16 Interleukin-6 (IL-6) Az IL-6 számos funkciót ellátó citokin. Szerepe van az immunválasz szabályozásában, az akut fázis válaszban és a gyulladásos folyamatokban. Elsosorban a humorális immunitást indukálja, a sejtes immunválaszra pedig gátló hatást fejt ki. Termelését a makrofágokból származó IL-1 és TNFa indukálja, az IL-6 viszont negatív visszacsatolásként gátolja a makrofágok IL-1 és TNFa termelését. A citokin a NOD egerek hasnyálmirigyében kialakuló insulitissel összefüggést mutatott. Erbagci és mtsai 79 újonnan diagnosztizált, gyermekkorban jelentkezo T1DM-ban magasabb IL-6 szintet találtak, míg Foulis és mtsai 80 a T1DM diagnózisa után nem sokkal meghalt betegek hasnyálmirigy szigeteiben mutatták ki IL-6 jelenlétét. Génje a 7p21-es kromoszóma szakaszon található. A promoter régiójában található C G polimorfizmus befolyásolja a citokin elválasztás mértékét, a -174 G allélt hordozó sejtek in vitro és in vivo is nagyobb mennyiségu IL-6-t választanak el, mint a -174 C allélt hordozó sejtek Interleukin-18 (IL-18) Az IL-18 egy nemrégiben felfedezett, interferon-gamma indukáló faktorként leírt és a gyulladásos folyamatok kialakulását elosegíto citokin 82. Szerkezete az IL-1-hez hasonló. Elsosorban makrofágok termelik és hatását döntoen a T-sejtekre és az Natural Killer (NK) sejtekre fejti ki. Részt vesz a veleszületett és az adaptív immunválasz kialakításában is. Szerepet játszik a Th 1 /Th 2 egyensúly szabályzásában, illetve fokozza a CD8+ T-sejtek és NK sejtek citotoxicitását. Humán és állat kísérletes adatok számos autoimmun betegségben emelkedett IL-18 szintet találtak 83,84,85,86. NOD egerekben a diabetes akut kialakulását IL-18 szint emelkedés kísérte 87, a T1DM kialakulására nagy kockázatú populációban pedig magasabb IL-18 szintet mértek 83. Génje a 11q22.2-q22.3 kromoszóma szakaszon található. A promoter régiójában talált SNP-k az IL-18 termelés mértékét befolyásolhatják 88. Perifériás vérbol nyert mononukleáris sejt kultúrákban a -607 CC és a -137 GG homozigótaság emelkedett IL-18 16

17 mrns szinttel járt együtt. T1DM-ben szenvedo betegeknél Kretowsky és mtsai az IL- 18 G -137 C heterozigóták gyakoribb elofordulásáról számoltak be Heat shock protein 72 (HSP, stresszfehérje) A heat shock protein nevét onnan kapta, hogy eloször hohatásnak kitett sejtekben mutatták ki. A késobbiekben kiderült, hogy egyéb srtesszállapotok (gyulladás, fertozés, ischaemia, toxinok, NO) is kiváltják a termelodését. A HSP70 család a sejtet ért stresszre legnagyobb mennyiségben termelodo protein. Két alcsoportja ismert: a folyamatosan termelodo HSP73, illetve a stressz indukálta HSP72. A HSP72 megtalálható egyrészt az extracelluláris térben (pl. a szigetsejtek is választanak el HSPt), ahol immunmoduláns, gyulladást elosegíto hatást fejt ki, másrészt az intracellulásis térben, ahol fontos szerepet tölt be a sejtek különbözo káros (stressz-) hatásokkal szembeni védelmében: csökkenti a fehérjék, zsírok és nukleinsavak oxidációját; megelozi az apoptosist; gátolja a proinflammatorikus citokineket és megjavítja a károsodott ioncsatornákat 90. A HSP72 a T1DM kialakulásához vezeto szigetsejt károsodásban szerepet játszó NO ellen védi a ß-sejteket 91. Abulafia-Lapid és mtsai 92 újonnan diagnosztizált cukorbeteg gyermekeknél HSP70 ellenes autoantitesteket mutatott ki. A környezeti hatásokon kívül a HSP72 genetikai polimorfizmusai (HSP72 A 1267 G) is szerepet játszanak a termelodo stresszfehérje mennyiségében. A HSP GG homozigótákban csökkent mennyiségu HSP72-t mértek Toll-Like receptor-4 (TLR) A Toll-Like receptorok az immunsejtek -, szívizom sejtek -, légúti epithel sejtek - és a vérben keringo sejtes elemek felszínén találhatók és központi szerepet játszanak a mikroorganizmusok felismerésében. A humán TLR-k felépítése evolúciós szempontból konzervatív és a pathogén mikróbák konzervatív építoelemeit ismeri fel (baktérium sejtfalának lipopoliszaccharid (LPS) összetevoje, bakteriális DNS és virális dupla-szálú RNS) 94. A TLR stimulációjával elindított folyamat a proinflammatorikus citokinek szekréciójához vezet. Az elsoként felfedezett humán TLR a TLR-4 volt, ami elsosorban 17

18 a Gramm-negatív baktériumok LPS-t felismero receptor, de vírusok elleni immunitásban is kimutatták szerepét 95. A T1DM kialakulásában a kutatók jelentos szerepet tulajdonítanak a vírus okozta fertozéseknek 96. A vírusok a TLR-khoz való kötodés révén hozzájárulhatnak a proinflammatorikus citokinek szekréciójához és így a gyulladásos folyamat elindításához/fenntartásához. A TLR-4 génje a 9q32-q33 kromoszóma szakaszon helyezkedik el. A 896 G polimorfizmusa a fehérje Asp299Gly cseréjét eredményezi, ami a receptor extracelluláris szerkezetének megváltozásán keresztül a TLR-4 által közvetített jelátvitelt blokkolja. Kiechl és mtsai 97 a mutáns allélt hordozókban a keringo gyulladásos citokinek koncentrációját alacsonyabbnak találták, ami együtt járt a súlyos fertozések gyakoribb elofordulásával, ugyanakkor csökkentette az atherosclerosis kockázatát D-vitamin receptor A D-vitamin aktív formája az 1,25-dihydroxi-D 3 (1a,25-(OH) 2 D 3 ) hatását a sejtmagban található D-vitamin receptorhoz (VDR) kötve fejti ki, amely szteroid hormonok, pajzsmirigy hormon és retinolsav receptorként is muködik. Szerepet játszik a kálcium és csont metabolizmusban, a sejtek proliferációjának és differenciálódásának szabályozásában, illetve az immunfolyamatok szabályozásában. In vitro vizsgálatok a D-vitamin immunszuppresszív hatásáról számoltak be: csökkentette a limfocita aktivációt, proliferációt és a citokin elválasztást 98,99. Citokinekkel (TNFa+IL1ß+IFN?) kezelt humán szigetsejtek károsodásának mértékét szintén csökkentette 100 A hasnyálmirigy ß-sejtjei is termelnek VDR-t 101. NOD egerek diabetese 1,25-(OH) 2 D 3 adásával megelozheto volt 102. Hypponen és mtsai 103 vizsgálata szerint a csecsemo és kisgyermekkori D vitamin adás a késobb kialakuló T1DM kockázatát csökkenti. A VDR funkcióját számos polimorfizmus befolyásolja. Az exon 2 szakaszon található FokI hasítási hely mutációja a gén transzkripciójának kezdopontját eltolja és f allél jelenlétekor három aminósavval hosszabb VDR molekula képzodik 104. A BsmI ( b ), ApaI (a) és Tru9I ( u ) által hasított mutációs helyek a gén intronján belül helyezkednek el. Az exon 9 T 1055 C néma mutációja a TaqI hasítási helye 105,106. A VDR polimorfizmus inzulin elválasztásra gyakorolt hatását mutatták ki Hitman és mtsai 107. A 2-es típusú 18

19 diabetes BsmI polimorfizmussal való összefüggése vitatott 108, a TaqI, ApaI és Tru9I pedig nem mutatott összefüggést a betegséggel 108,109. Pani és mtsai 105, illetve McDermott és mtsai 110 vizsgálataiban a VDR BsmI, ApaI és TaqI polimorfizmusának együttes hatása növelte a T1DM kialakulásának kockázatát G-fehérje (GTP(guanozin-trifoszfát)-köto fehérje) A G-fehérje család az intracelluláris jelátviteli folyamatok fontos résztvevoje. Három alegysége (a, ß és?) ismert. Hormonok, kemokinek és neurotranszmitter anyagok hatására a G- fehérje GTP-t köt meg (aktiválódik), az a-alegység leválik a ß?- alegységrol és a sejten belüli jelátviteli folyamat szabályozásában vesznek részt. A ß?-alegység számos ioncsatorna és (second messenger molekulákat aktiváló) enzim muködését befolyásolja (pl. adenil-cikláz, foszfolipáz A 2, foszfolipáz C, Ca ATP-áz), többek között a sejthártyán keresztül történo Na + /Li + cserét, a Na + /K + -ATP-áz és a Ca + - ATP-áz enzim muködését is befolyásolja. T1DM-ben szenvedo betegeknél alacsonyabb Na + /K + -ATP-áz 111 és Ca 2+ -ATP-áz aktivitást és fokozottabb Na + /Li + cserét 113 mértek. Ez utóbbi elváltozást a diabeteses nephropathia korai jelének tekintik 114,115,116. A G fehérje ß3 alegységét kódoló génszakasz 10 exonjának C 825 T polimorfizmusa ismert. A 825 T allél jelenléte a G protein fokozott aktivitását eredményezi és a magas vérnyomás kialakulására hajlamosító tényezonek bizonyult

20 2. CÉLKITUZÉS Munkánkban olyan fehérjék génjeit vizsgáltuk (5. ábra), melyek szerepet játszanak a T1DM kialakulásában. A vizsgált gének ismert polimorfizmusait (single nucleotid polymorphism, SNP) határoztunk meg, amik a kódolt fehérje mennyiségi, vagy minoségi változása révén befolyásolhatják a T1DM kialakulását, vagyis a genetikai hajlam hordozói lehetnek. Ezen gének által kódolt információk azonban nem csak a betegség kialakulását, de annak klinikai lefolyását is jelentosen befolyásolhatják. A vizsgált polimorfizmusokat így a rendelkezésre álló klinikai adatokkal (diabetes kialakulásakor életkor, fejlodési adatok, inzulinigény, HbA 1C, vérnyomás értékek) is összevetettük. Munkánk során elsosorban az alábbi kérdésekre kerestünk választ: 1. A TNFa G -308 A polimorfizmus összefügg-e a T1DM kialakulásával, illetve T1DM betegek vérnyomás értékeivel? A TNFa G -238 A polimorfizmus összefügg-e a T1DM kialakulásával? 2. Az IL-1ß C 3954 T SNP összefügg-e a T1DM kockázatával? 3. A TNFß A 252 G polimorfizmus összefügg-e a T1DM kialakulásával? 4. Az IL-6 C -174 G SNP összefügg-e a T1DM kockázatával? 5. Az IL-18 G -137 C és C -607 A SNP-k összefüggnek-e a T1DM kockázatával? 6. A HSP72 G 1267 C polimorfizmus összefügg-e a T1DM kialakulásával? 7. A TLR-4 A 896 G SNP összefügg-e a T1DM kockázatával? 8. A VDR FokI, BsmI, TaqI, ApaI, TruI hasítóenzimmel kimutatható SNP-k összefüggnek-e a T1DM kockázatával? 9. A Gß3 C 825 T SNP összefügg-e a T1DM betegek vérnyomás értékeivel? 20

21 3. MÓDSZEREK 3.1. Vizsgált populáció Betegek A vizsgálatba háromszázhuszonhat, a klinikán kezelt és T1DM-ban szenvedo gyermeket vontunk be. A gyermekek klinikai adatait Microsoft Access adatbázis felhasználásával dolgoztuk fel. Rögzítettük a betegek születési adatait (dátum, születés módja, születési súly, hossz), dátum szerint (életkor, diabetes fennállása így ismert) az összes klinikán történt bentfekvéskor a kezelés okát, a betegek testsúlyát, magasságát (és az ezekbol számított BMI értéket), vércukor és ph értékeit, az inzulin dózisát, a szemészeti, illetve 24 órás vérnyomás monitorozás (ambulatory blood pressure monitoring - ABPM) vizsgálat eredményeit (amennyiben volt ilyen). Az ambuláns kartonokból az elvégzett összes HbA 1C, autoantitest, albuminuria, illetve szemfenéki vizsgálatok eredményeit rögzítettük. Mivel a fejlodésre, illetve vérnyomásra jellemzo normál értékek a gyermekek életkorától függnek, ezen vizsgálati eredményeket standard deviációs pontértékkel (standard deviation score SDS) jellemeztük (referencia értékek 118,119 ). A gyermekek klinikai adatait tartalmazza a 4. táblázat. Fiú/Lány 166/160 Életkor 4 év - 22 év (medián: 15 év) T1DM kezdetekor életkor 8 hó - 18 év (medián: 8 év) ICA pozitív/negatív (n=158) 95/62 Testsúly SDS±S.D ± 0.90 Testmagasság SDS±S.D ± 1.23 BMI SDS±S.D ± 0.91 Inzulinigény (E/tsúlykg/nap) 0.70 ± 0.27 Átlagos HbA 1C (%) 7.66 ± táblázat A vizsgálatban részt vett T1DM betegek klinikai adatai 21

22 Kontroll csoport A genetikai vizsgálatokhoz kontroll csoportként egészséges magyar véradók eredményeit használtuk fel (saját mérések, illetve az irodalom alapján). A kontroll csoport a vizsgálati csoporttól nemi megoszlásban nem különbözött. A vizsgálatok elvégzését a Semmelweis Egyetem Etkai Bizottsága engedélyezte Polimeráz láncreakció (PCR) - restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus (RFLP) módszer A vérminták fehérvérsejtjeibol a DNS-t Miller és mtsai 120 szerint vontuk ki. A vizsgálandó génszakaszt PCR segítségével amplifikáltuk. Az amplifikációt 50µl végtérfogattal végeztük el, ami 3 µl DNS-t, 1 µl primert, 0.2 mmol/l-t minden dntpbol, az adott reakcióhoz optimális mennyiségu MgCl 2 -t, 2 U Promega Taq polymeraset és a hozzá való buffert tartalmazta. A kapott terméket különbözo - az adott SNP-nél hasító - restrikciós endonukleázzal emésztettük az enzim muködéséhez optimális homérsékleten, megfelelo ideig. Az így keletkezett terméket 0.4 mg/l ethidium bromiddal megjelölve agaróz gélen futtattuk meg és UV fény alatt értékeltük. Az elvégzett PCR reakciók a használt primerek, a PCR körülmények és az alkalmazott hasító enzim tekintetében tértek el egymástól. A különbözo vizsgálatok körülményeit az 5. táblázatban foglaltam össze. Az IL-18 polimorfizmus vizsgálata multiplex Touch Down PCR technikával történt, Giedraitis és mtsai 88 protokolljának módosításával. A PCR mastermix összetétele: 20 mm TRIS HCl ph 8,4, 50 mm KCl, 2,0 mm MgCl 2, 0,25 mm dntp, 2 U Taq polimeráz (Invitrogen, UK), a kontroll primert 0,13?M, a többi primert 0,4? M koncentrációban adtuk az 50? l-es mastermixhez. A PCR reakciót 30 ng templát DNS hozzáadásával végeztük. A mastermix végtérfogata 60? l volt, melybol 10? l-t a Guthrie program lefutttása után, a Taq polimeráz hozzámérésével adagoltunk az elokezelt mintákhoz. 22

23 Vizsgált gén TNFa IL-1ß TNFß Polimorfizmus G -308 A és G -238 A Exon 5 C 3954 T Intron 1 A 252 G Alkalmazott 5 -ATCTGGAGGAAGCGGTAGTG-3 5 -TTCAGTTCATATGGACCAGA-3 5 -AGAAGACCCCCCTCGGAACC-3 primerek 5 -GTTGTCATCAGACTTTGACC-3 5 -AATAGGTTTTGAGGGCCATG-3 PCR körülmények Ciklusszám Denaturáció 94 C-10 mp 94 C-30 mp 94 C-30 mp Annealing 55 C-60 mp 55 C-30 mp 55 C-30 mp Extenzió 72 C-30 mp, 72 C-30 mp 72 C-30 mp 5 -CCGTGCTTCGTGCTTTGGACTA-3 5 -AGAGCTGGTGGGGACATGTCTG-3 Emésztés NcoI és MspI TaqI NcoI Vizsgált gén IL-6 IL-18 Polimorfizmus Promoter C -174 G Promoter G -137 C Alkalmazott primerek PCR körülmények Ciklusszám Denaturáció Annealing Extenzió 5 -TTGTCAAGACATGCCAAGTGCT GCCTCAGAGACATCTCCAGTCC C-30 mp 62 C-45 mp 72 C-60 mp C specifikus forward primer:5 -GTTGCAGAAAGTGTAAAAATTATTAC-3 A specifikus forward primer:5 -GTTGCAGAAAGTGTAAAAATTATTAA-3 kontroll forward primer 5 -CTTTGCTATCATTCCAGGAA-3 reverz primer: 5 -TAACCTCATTCAGGACTTCC-3 7 majd 94 C-20 mp 64 C-40 mp 72 C-40 mp Emésztés NlaIII Nincs 5.a táblázat A vizsgált polimorfizmusok PCR-RFLP körülményeinek jellemzo C-20 mp 57 C-40 mp 72 C-40 mp 23

24 Vizsgált gén IL-18 HSP72 Polimorfizmus Promoter C -607 A G 1267 C Alkalmazott primerek PCR körülmények Ciklusszám Denaturáció Annealing Extenzió G specifikus forward primer: 5 -CCCCAACTTTTACGGAAGAAAAG-3 C specifikus forward primer: 5 CCCCAACTTTTACGGAAGAAAAC-3 kontroll forward primer: 5 -CCAATAGGACTGATTATTCCGCA-3 reverz primer: 5 -AGGAGGGCAAAATGCACTGG-3 5 majd 94 C-20 mp 68 C-60 mp C-20 mp 62 C-20 mp 72 C-40 mp 5 -ACCCTGGAGCCCGTGGAGAA-3 5 -CACCCGCCCGCCCCGTAGG C-30 mp 61 C-60 mp 72 C-60 mp Emésztés nincs PstI Vizsgált gén TLR-4 VDR VDR Polimorfizmus A 896 G FokI ( f ) BsmI ( b) Alkalmazott primerek PCR körülmények Ciklusszám Denaturáció Annealing Extenzió 5 -GATTAGCATACTTAGACTACTACCTCCATG-3 5 -GATCAACTTCTGAAAAAGCATTCCCAC C-20 mp 55 C-60 mp 72 C-60 mp 5 -AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC C-30 mp 60 C-30 mp 72 C-30 mp 5 -AGTGTGCAGGCGATTCGTAG-3 5 -ATAGGCAGAACCATCTCTCAG C-30 mp 62 C-30 mp 72 C-30 mp Emésztés NcoI FokI BsmI 5.b táblázat A vizsgált polimorfizmusok PCR-RFLP körülményeinek jellemzo 24

25 Vizsgált gén VDR VDR Polimorfizmus TaqI ( t ) ApaI ( a ) Alkalmazott primerek PCR körülmények Ciklusszám Denaturáció Annealing Extenzió 5 -CAGAGCATGGACAGGGAGCAA-3 5 GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC C-30 mp 70 C-30 mp 72 C-30 mp 5 -CAGAGCATGGACAGGGAGCAA-3 5 -GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC C-30 mp 70 C-30 mp 72 C-30 mp Emésztés TaqI ApaI Vizsgált gén VDR Gbéta3 Polimorfizmus TruI ( u ) C 825 T Alkalmazott primerek PCR körülmények Ciklusszám Denaturáció Annealing Extenzió 5 -TGAGGTTTCTTGCGGGCAGGGTA-3 5 -CAGGGCCGCCCCTCTTTGGA C-30 mp 72 C-30 mp 72 C-30 mp 5 -TGACCCACTTGCCACCCGTGC-3 5 -GCAGCAGCCAGCGCTGGC C-60 mp 60 C-45 mp 72 C-60 mp Emésztés Tru9I BseDI 5.c táblázat A vizsgált polimorfizmusok PCR-RFLP körülményeinek jellemzo 25

26 3.3. Statisztikai elemzés Vizsgáltuk, hogy az egyes genotípusok megoszlása teljesíti-e a Hardy-Weinberg kritériumokat. A normál eloszlású változókat átlag ± S.D.-vel, nem normál eloszlású változókat pedig minimum-maximum és mediánnal jellemeztük. A testsúly, magasság, BMI, illetve az ABPM-mel mért vérnyomás eredményeit SDS (standard deviation score) értékekben adtuk meg. Kategórikus adatok összehasonlításánál (két populáció közötti allél gyakoriság, polimorfizmus és nemi különbségek)? 2 próbát alkalmaztunk. A polimorfizmusok és folyamatos változók közti kapcsolatot normál eloszlás esetén (HbA 1C, inzulin igény, vérnyomás SDS értékek) kétmintás t-teszttel, illetve egyszempontos variancia analízissel (ANOVA) -; nem normál eloszlás esetén (diabetes kezdetekor életkor, diabetes tartama) pedig Mann-Whitney, illetve Kruskal-Wallis teszttel vizsgáltuk. Két folyamatos változó közötti kapcsolatot (két normál eloszlású csoport között) Pearson-féle korreláció-, illetve (legalább egy nem normál eloszlás esetén) Spearman-féle korreláció vizsgálattal végeztük. A polimorfizmusok vérnyomás SDS-re gyakorolt független hatásának kimutatásához többszörös regressziót alkalmaztunk. A statisztikai számításokat Statistica 6.0 szoftverrel végeztük el. 26

27 4. EREDMÉNYEK 4.1. A Hardy-Weinberg egyensúly (HWE) fennállásának vizsgálata A kritériumoknak megfelelo kontroll csoport mellett szignifikáns eltérést tapasztaltunk az IL-1ß és az IL-18 G -607 C polimorfizmus tekintetében. A TNFa promoter regió G -308 A és a TNFß eredményei a kontroll csoportban teljesítették HWE-t, míg a cukorbeteg csoport közel szignifikáns eltérést mutatott (p=0.052, illetve p=0.068) (6. táblázat). A HSP72 és a VDR TagI vizsgálat eredményei mind a kontroll csoportban, mind a cukorbeteg populációban a HWE-tól jelentosen különböztek. Vizsgált polimorfizmus Vizsgálati csoport p érték TNFa G -308 A T1DM p= Kontroll N.S. TNFa G -238 A T1DM N.S. Kontroll N.S. IL-1ß C 3954 T T1DM p<0.0001* Kontroll N.S. TNFß A 252 G T1DM p= Kontroll N.S. IL-6 G -174 C T1DM N.S. Kontroll N.S. IL-18 G -137 C T1DM N.S. Kontroll N.S. IL-18 C -607 A T1DM p<0.0001* Kontroll N.S. HSP72 A 1267 G T1DM p<0.0001* Kontroll p<0.0001* TLR-4 A 896 G T1DM N.S. Kontroll N.S. VDR FokI T1DM N.S. Kontroll N.S. 27

28 Vizsgált polimorfizmus Vizsgálati csoport p érték VDR BsmI T1DM N.S. Kontroll N.S. VDR TaqI T1DM p<0.05* Kontroll p<0.0001* VDR ApaI T1DM N.S. Kontroll N.S. VDR Tru9I T1DM N.S. Kontroll N.S. Gß3 C 825 T T1DM N.S. Kontroll N.S. 6. táblázat A Hardy-Weinberg egyensúly vizsgálatának eredményei * szignifikáns különbség; + közel szignifikáns különbség 4.2. T1DM és kontroll populációk allélgyakoriságának összehasonlítása A kontroll csoporthoz képest cukorbetegek között szignifikánsan gyakoribb volt a TNFa -308 A, az IL-1ß 3954 T, a TNFß 252 G allél, az IL CA heterozigótaság és a HSP G allél. A TNFa -238 A, IL G, IL C, TLR G, Gß3 825 T.és a VDR allélek prevalenciája nem mutatott lényeges eltérést (7. táblázat). 7. táblázat - Az elvégzett SNP vizsgálatok eredményei. Gén Polimorfizmus n (%) Allélgyakoriság TNFa G -308 A -308 AA -308 AG -308 GG -308 A allél* T1DM n= (4) 133 (42) 171 (54) 0.25 Kontroll n=339 (irodalom 121,122 ) 3 (0.9) 90 (26.5) 246 (72.6) 0.14 p< ; OR=2.029 (95% CI: ) TNFa G -238 A -238 AA -238 AG -238 GG -238 A allél T1DM n=308 1 (0.3) 20 (6.5) 287 (93.2) 0.03 Kontroll n=248 (irodalom 121 ) 0 23 (9.3) 225 (90.7) 0.04 N.S. 28

29 IL-1ß C 3954 T Gén Polimorfizmus n (%) Allélgyakoriság 3954 TT 3954 CT 3954 CC 3954 T allél* T1DM n= (7) 170 (54) 121 (39) 0.34 Kontroll n=171 (saját mérés) 13 (8) 62 (36) 96 (56) 0.26 p<0.001; OR=2.02 (95% CI: ) TNFß A 252 G 252 GG 252 GA 252 AA 252 G allél* T1DM n= (16) 71 (59) 31 (25) 0.45 Kontroll n=92 (irodalom 122 ) 4 (4) 42 (46) 46 (50) 0.27 p<0.001; OR=2.196 (95% CI: ) IL-6 G -174 C -174 CC -174 CG -174 GG -174 C allél T1DM n= (17) 72 (44) 65 (39) 0.38 Kontroll n=124 (irodalom 122 ) 18 (14) 52 (42) 54 (44) 0.35 N.S. IL-18 G -137 C -137 CC -137 GC -137 GG -137 C allél T1DM n= (8) 82 (50) 68 (42) 0.33 Kontroll n=167 (saját mérés) 12 (7) 75 (45) 80 (48) 0.30 mérés) N.S. IL-18 C -607 A -607 AA -607 CA* -607 CC -607 A allél T1DM n=163 5 (3) 117 (72) 41 (25) 0.38 Kontroll n=167 (saját mérés) 29 (17) 80 (48) 58 (35) 0.41 p< ; OR= (95% CI: ) HSP72 A 1267 G 1267 GG 1267 GA 1267 AA 1267 G allél* T1DM n= (22) 137 (65) 27 (13) 0.55 Kontroll n=194 (saját mérés) 25 (13) 127 (65) 42 (22) 0.46 p<0.01; OR=1.454 (95% CI: ) TLR-4 A 896 G 896 GG 896 AG 896 AA 896 G allél T1DM n= (9) 184 (91) Kontroll n=192 (saját mérés) 0 14 (7) 178 (93) 0.36 N.S. VDR FokI ff Ff FF f allél T1DM n= (17) 55 (55) 28 (28) 0.44 Kontroll n=102 (saját mérés) 21 (21) 47 (46) 34 (33) 0.44 N.S. 29

30 Gén Polimorfizmus n (%) Allélgyakoriság VDR BsmI bb Bb BB b allél T1DM n= (39) 43 (43) 18 (18) 0.60 Kontroll n=101 (saját mérés) 34 (34) 51 (50) 16 (16) 0.60 N.S. VDR TagI tt Tt TT t allél T1DM n=98 25 (25) 32 (33) 41 (42) 0.42 Kontroll n=101 (saját mérés) 32 (31) 27 (26) 42 (41) 0.45 N.S. VDR ApaI aa Aa AA a allél T1DM n=98 25 (26) 51 (52) 22 (22) 0.52 Kontroll n=101 (saját mérés) 26 (25) 43 (42) 32 (31) 0.47 N.S. VDR Tru9I uu Uu UU u allél T1DM n= (21) 77 (79) 0.11 Kontroll n=102 (saját mérés) 0 19 (18) 83 (81) 0.09 N.S. Gß3 C 825 T 825 TT 825 CT 825 CC 825 T allél T1DM n= (1) 77 (44) 88 (50) 0.28 Kontroll n=97 (saját mérés) 9 (9) 49 (51) 39 (40) 0.34 N.S. 7. táblázat - Az elvégzett SNP vizsgálatok eredményei. *A két csoport között szignifikáns a különbség 4.3. A vizsgált polimorfizmusok és a betegek klinikai adatai közti kapcsolat vizsgálata Nemi különbségek A cukorbeteg populációban a VDR Tru9I allélek megoszlása szignifikáns eltérést mutatott a két nem között (p<0.01), a lányok gyakrabban hordozták a u allélt. Az Uu genotípus prevalenciája T1DM-ben szenvedo lányoknál magasabb volt, mint a kontroll 30

31 csoportban (lány/fiú: kontroll csoport 7/18, míg T1DM-esetén 16/5; p<0.01). Cukorbeteg lányoknál - egészséges lányokhoz képest - gyakoribb volt a b, a és u allélek együttes elofordulása ( b + a + u jelen van/nincs jelen: DM 13/37; egészségesek 0/53 arányban; p<0.005). Fiúk esetében a polimorfizmus nem mutatott összefüggést a betegséggel. A többi polimorfizmus a nemek tekintetében nem mutatott eltérést T1DM kezdete Az IL-6 G -174 C promoter polimorfizmus összefüggést mutatott a betegség diagnosztizálásakor fennálló életkorral. Az IL CC homozigótáknál fiatalabb életkorban alakult ki a T1DM, mint az IL GC heterozigótáknál (medián: 4, illetve 6 év) A betegség diagnosztizálása idején az IL GG homozigóták voltak a legidosebbek (medián: 10 év). A többi vizsgált polimorfizmus nem mutatott összefüggést a diagnóziskor fennálló életkorral ICA pozitivitás A vizsgált polimorfizmusok nem mutattak összefüggést a gyermekek ICA eredményeivel Fizikális jellemzok Testsúly A testsúly SDS értéke egyik vizsgált polimorfizmussal sem mutatott összefüggést Testmagasság A VDR gén TaqI polimorfizmusa összefüggött a testmagasság SDS értékével: TT : 0.16 ± 1.21, Tt : 0.20 ± 0.79 és tt : ± 1.11 (p<0.05). 31

32 A többi polimorfizmus nem mutatott lényeges eltérést a testmagasság tekintetében Testtömeg-index (body mass index, BMI) A BMI értékek egyik vizsgált polimorfizmussal sem mutattak összefüggést Inzulinigény A vizsgált polimorfizmusok és a betegek inzulin igénye között nem találtunk összefüggést Átlagos HbA 1C érték Az átlagos HbA 1C érték vizsgált polimorfizmusok egyikével sem mutatott összefüggést Cöliákia A vizsgált gyermekek közül 28-nál (8.6%) a T1DM-hez cöliákia is társult. Közülük 13 gyermeknél végeztük el az IL-18 C -607 A polimorfizmus vizsgálatát. Az eredményeket 114 cöliákiában nem szenvedo cukorbeteg gyermek eredményeivel vetettük össze. (A kétes cöliakiás eseteket a vizsgálatból kihagytuk.) Az eredményeket mutatja a 8. táblázat. T1DM+Cöliákia T1DM n=13 (%) n=114 (%) IL AA 0 4 (4) IL CA 5 (38) 86 (75) IL CC 8 (62) 24 (21) IL C allél gyakorisága* táblázat - IL-18 C -607 A polimorfizmus és T1DM-hez társuló cöliákia vizsgálat eredménye 32

33 A cöliákiás csoportban gyakoribb a -607 C allél elofordulása, mint a cöliákiában nem szenvedo csoportban (p<0.01). A többi vizsgált polimorfizmus nem mutatott összefüggést a T1DM-hez társuló cöliákiával Vérnyomás - ABPM (ambulatory blood pressure monitoring) eredmények A vizsgálathoz a 24 órás vérnyomás monitorozás eredményeinek SDS értékeit használtuk fel (referencia értékek 119 ). A vérnyomás napszaki ingadozása alapján két csoportot különítettünk el: dipper (megtartott napszaki vérnyomás ingadozás) és non dipper (<10% a nappali és éjszakai vérnyomás átlaga közötti különbség). A 126 betegbol 18 (14%) volt non-dipper. A diurnalitással egyik vizsgált polimorfizmus sem mutatott összefüggést. A betegek vizsgált klinikai jellemzoi nem mutattak összefüggést a TNFa G -308 A polimorfizmusa eredményeivel (9. táblázat). Klinikai jellemzok GG (n=66) GA/AA (n=60) p Nem (Fiú/Lány) 30/36 35/25 N.S. Életkor (év) 15? ? 2.5 N.S. Életkor a DM diagnózisakor (év) 7.7? ? 4.2 N.S. T1DM tartama (év) 7? 4 6? 3 N.S. SDS BMI 0.27? ? 0.7 N.S. HbA 1C (%) 8.1? ? 1.2 N.S. Insulin dózisa (E/tsúly kg/nap) 0.8? ? 0.3 N.S. 9. táblázat. A vizsgálatban részt vett gyermekek klinikai adatainak eredményei. Az adatok átlag ± S.D. értékben vannak megadva A vizsgált 126 gyermek közül emelkedett (=2SDS) volt az éjszakai szisztolés vérnyomás 24 gyermeknél, az éjszakai diasztolés vérnyomás 15 gyermeknél; a nappali szisztolés vérnyomás 4 gyermeknél és a nappali diasztolés vérnyomás 4 gyermeknél. A vérnyomás átlagok a normál tartományon belül mozogtak, az életkori átlagnál kicsit alacsonyabb nappali és kissé magasabb éjszakai értékekkel. 33

34 A TNFa promoter regió G -308 A polimorfizmusa szignifikáns összefüggést mutatott a gyermekek ABPM eredményeivel (10. táblázat). A -308 A allél jelenléte alacsonyabb szisztolés és diasztolés vérnyomás értékekkel járt együtt, mint a -308 GG genotípus. Ez az összefüggés független volt a betegség tartamától és a betegek HbA 1C - és BMI SDS értékeitol. Átlagos SDS± SD (n=126) Átlagos SDS± SD GG (n=66) Átlagos SDS± SD GA/AA (n=60) p 24 órás vérnyomás értékek ssds ± ? ?1.28 <0.01* dsds ± ? ?1.31 <0.01* Nappali vérnyomás értékek ssds ± ? ?1.29 <0.01* dsds ± ? ? Éjszakai vérnyomás értékek ssds 0.56 ± ? ?1.41 <0.05* dsds 0.14 ± ? ?1.34 <0.05* 10. táblázat - Az ABPM vizsgálat eredményeinek TNFa G -308 A polimorfizmussal való összefüggése. ssds: szisztolés vérnyomás értékek SDS-e; dsds: diasztolés vérnyomás értékek SDS-e *A két csoport között szignifikáns a különbség A többi vizsgált polimorfizmus nem mutatott összefüggést a gyermekek vérnyomás SDS értékeivel. 34

35 5. MEGBESZÉLÉS Munkánkban a T1DM kialakulásában és/vagy lefolyásában szerepet játszó fehérjék genetikai polimorfizmusait vizsgáltuk. Olyan SNP-kat határoztunk meg, melyek funkcionális jelentoséggel bírnak, a gén által kódolt fehérje mennyiségi, vagy minoségi változása révén játszhatnak szabályozó szerepet a T1DM kialakulásában A vizsgált polimorfizmusok és a T1DM, illetve a szövodményeként kialakuló magas vérnyomás közötti kapcsolat A vizsgálatunk során nyert eredményeket összegzi a 6. ábra. GÉN IL-1ß 3954 T, IL CA, TNFß 252 G, TNFa -308 A, HSP A TNFa -308 A, Gß3 825 T Ép ß-sejtek Insulitis Diabetes Hipertónia GÉN VDR polimorfizmusok, IL G, IL G, TLR4 896 A, TNFa -238 A A polimorfizmus összefüggése T1DM-mel, illetve a magas vérnyomás kialakulásával: hajlamosít véd nem függ össze 6. ábra A diabetes kialakulásában a betegeknél mért vérnyomásértékekkel összefüggést mutató polimorfizmusok - eredményeink Állatkísérletek és in vitro szigetsejteken végzett vizsgálatok szerint a ß-sejt pusztuláshoz vezeto inulitis kialakulásában elsosorban a Th 1 sejtek által termelt citokinek (IFN?, IL-2, TNFß és IL-12), a Th 1 sejtek által termelt citokinek elválasztását serkento IL-12 és IL-18, illetve a makrofágok által termelt proinflammatorikus citokinek (IL-1a, IL-1ß, TNFa és IL-6) vesznek részt. A 2. osztályú (IL-4 és IL-10) - és 3-as osztályú citokinekrol (TGF-ß) feltételezik, hogy a cukorbetegség kialakulása ellen hatnak 67,73. 35

36 Munkánkban a TNFa, IL-1ß, TNFß, IL-6 és IL-18 citokint kódoló gének SNP-ait határoztuk meg. A diabetes fennállásával összefüggést mutatott: a TNFa -308 A allél, az IL-1ß 3954 T allél, a TNFß 252 G allél és az Il CA heterozigótaság. A talált összefüggéseket támasztja alá, hogy ezen polimorfizmusok esetében a Hardy-Weinberg kritériumok csak a kontroll populációkban teljesültek maradéktalanul. A cukorbeteg populációban nagyobb prevalenciájú allélek mindegyike a gén által kódolt citokin fokozott elválasztásával jár, ami (1-es osztályú, ezek elválasztását segíto, illetve proinflammatorikus citokinekrol lévén szó) hozzájárulhat a ß-sejtek pusztulásához vezeto autoimmun inzulitis kialakulásához, illetve fenntartásához. Számos tanulmány igazolta a gyulladásos markerek kardiovaszkuláris betegségek kialakulásában betöltött szerepét 123,124. A gyulladásos folyamatok kialakulását, illetve fenntartását elosegíto fehérjék polimorfizmusait tehát a T1DM során kialakuló kardiovaszkuláris betegségek (így a magas vérnyomás) hátterében is érdemes vizsgálni TNFa G -308 A és G -238 A SNP összefüggése a T1DM kockázatával és a betegek vérnyomás értékeivel Munkánkban összefüggést találtunk a TNFa -308 A allél jelenléte és a T1DM között. Több tanulmány leírta a TNFa -308 A allél gyakoribb elofordulását T1DM-ben szenvedo betegeknél 56,57,58, azonban ezt az összefüggést elsosorban az allél HLA-DR3-mal való kapcsolt öröklodésének tulajdonították. HLA-meghatározásra a PhD munkám keretében nem volt lehetoség, így ezt sem megerosíteni, sem megcáfolni nem tudom. A TNFa termelésben - a -308 GG és -308 GA genotípusú sejtek között - mutatkozó különbség azonban nem magyarázható a HLA-val való kapcsolt öröklodéssel. Bár a HLA-DR3 magasabb TNFa termeléssel jár együtt 125, Bouma és mtsai 55 kimutatták, hogy a -308 GA genotípusú DR3 + és DR3 - egyének egyaránt nagyobb mennyiségu TNFa-t választanak el. Marokkói T1DM populációban pedig a TNFa G -308 A polimorfizmus és a betegség közötti összefüggést az MHC II osztályú génektol függetlennek találták 126 Munkánkban TNFa promoter regió - nagyobb mennyiségu TNFa elválasztással járó -308 A allélja és az ABPM során mért alacsonyabb szisztolés és diasztolés vérnyomás értékekkel is összefüggést mutatott. Az összefüggés független volt az életkortól, a T1DM tartamától, az átlagos HbA 1C - és a BMI SDS értékektol. Az eredmény azért 36