ELTE TTK Analitikai Kémiai Tanszék Műszeres analitika gyakorlat. Készülék: Perkin-Elmer Lambda 15 spektrofotométer.

Átírás

1 MOLEKULA SPEKTROFOTOMETRIA Spektrofotometriás gyakorlatok során spektrumok felvétele, majd ezek segítségével, illetőleg figyelembevételével mennyiségi meghatározás képezi a feladatokat. A mérésekhez az alábbi készüléket lehet alkalmazni. A Perkin-Elmer lambda 15 spektrofotométer optikai felépítése a következő ábrán látható: Több komponensű rendszerek egymás melletti meghatározásának lehetőségét ha azoknak nincs zavarásmentes abszorpciós maximuma- tanulmányozzuk a kálium-permanganát, -bikromát keverékek analízise során. A moláris abszorpciós koefficiensek hullámhosszfüggését a tiszta komponensek esetében határozzuk meg, majd az abszorbancia additívitását ismert koncentrációjú keverékek mért és számolt abszorbancia értékeinek összehasonlításával ellenőrizzük. A mérés során az abszorbancia értékek additivitását használjuk ki. Feladat: Adott hígításoknál megmérjük a KMnO 4, valamint a K 2 Cr 2 O 7 abszorbanciáját 525 és 440 nm-en, 0,5 M-os kénsavban. Referencia: 0,5 M-os kénsavoldat. Ki kell számítani az ε-t, a moláris abszorpciós koefficienst mindkét anyagnál, mindkét hullámhosszon és meg kell adni két ismeretlen KMnO 4 K 2 Cr 2 O 7 oldatkeverék KMnO 4 illetve K 2 Cr 2 O 7 -tartalmát mmol/dm 3 -ben. Készülék: Perkin-Elmer Lambda 15 spektrofotométer. Törzsoldatok: 3,0 mm KMnO 4 10,0 mm K 2 Cr 2 O 7 1. A hígításokhoz 0,5 M kénsavoldatot használunk. A következő koncentrációjú oldatokat készítjük el az alábbi hígítási táblázat szerint: Sorozat: KMnO 4 + K 2 Cr 2 O 7 Jele Hígítás Koncentráció (mm) HL=halogénlámpa, DL=deutériumlámpa, SA=be- és kilépő rés, G1= optikairács, C=optikai szaggató, S=minta-, R=referenciatartó, PM= fotonelektron sokszorozó, M(1-10)=tükrök KMnO 4 és K 2 Cr 2 O 7 egymás melletti meghatározása spektrofotometriás módszerrel (Sp. I.) 1 10,0 cm 3 3 mm KMnO 4 50 cm 3 + 4,0 cm 3 10 mm K 2 Cr 2 O 7 2 7,5 cm 3 3 mm KMnO 4 50 cm 3 + 6,0 cm 3 10 mm K 2 Cr 2 O 7 3 5,0 cm 3 3 mm KMnO 4 50 cm 3 + 8,0 cm 3 10 mm K 2 Cr 2 O 7 4 3,5 cm 3 3 mm KMnO 4 50 cm ,0 cm 3 10 mm K 2 Cr 2 O 7 5 2,0 cm 3 3 mm KMnO 4 50 cm ,0 cm 3 10 mm K 2 Cr 2 O 7 0,60 + 0,80 0,45 + 1,20 0,30 + 1,60 0,21 + 2,00 0,12 + 2,40 1

2 Vas(II)-ionok meghatározása uv-látható spektroszkópiával (Sp. II.) 2. Pásztázó (scan) üzemmódban vegyük fel a KMnO 4 és a K 2 Cr 2 O 7 oldatok spektrumát nm hullámhossztartományban a koncentráció növekvő sorrendjében. Referencia oldat: 0,5 M kénsavoldat. Az oldatokkal 2-3-szor öblítsük át a küvettát, majd kívülről töröljük szárazra. Nyomtassuk ki a spektrumokat a grafikus (4.) oldalról, valamint az abszorbancia értékeket az adat (3.) oldalról. 3. A készüléket állítsuk át hullámhossz üzemmódra, állítsuk be a megfelelő hullámhossz értékeket és mérjük meg a keverék oldatok, valamint az ismeretlen minták elnyelését. Az adatokat nyomtassuk ki. Kiértékelés: Jelek: ε = 440 nm-hez tartozó moláris abszorpciós koefficiens ε = 525 nm-hez tartozó moláris abszorpciós koefficiens A 440 = abszorbancia 440 nm-en A 525 = abszorbancia 525 nm-en C Cr = bikromát koncentráció C Mn = permanganát koncentráció 1. A tiszta komponensek spektrumaiból a Lambert-Beer-törvény alapján kiszámoljuk az ε és ε értékeket. Célszerű ezt mind a négy koncentráció esetében elvégezni, és átlagot képezni. 2. A moláris abszorpciós koefficiensek, valamint a koncentrációk ismeretében kiszámoljuk a keverékek abszorbancia értékeit mindkét hullámhossz esetében: A 440 = ε Cr * C Cr + ε Mn * C Mn A 525 = ε Cr * C Cr + ε Mn * C Mn 3. Az ismeretlen oldatokra a mért abszorbancia, valamint a moláris abszorpciós koefficiensek ismeretében a fenti egyenletek segítségével a két komponens koncentrációját ki lehet számolni. Segítségül Windows alatt futó kiértékelő program áll rendelkezésre. A program neve: Uj-SPEKTRO. A Fe 2+ -ionok molekula spektroszkópiai mérése jól példázza az átmeneti fémek kvantitatív meghatározásának lehetőségét látható tartományban. Ennek alapja az átmeneti fémek színessé tétele komplexképzésen keresztűl.. A Fe 2+ -ionok gyengén savanyú közegben érzékeny színreakciót adnak α-α, -dipiridillel. A vörös színű komplexben a Fe 2+ -ion köré három molekula α-α, -dipiridil ligandum koordinálódik: Az ajánlott ph intervallum általában ph = 5 7 között van. Savas közegben a ligandum protonálódása miatt nem teljes a komplexképzés, így a szín lassabban és gyengébben fejlődik ki. Semleges vagy gyengén lúgos ph kedvez a Fe 2+ oxidációjának. A reakció felhasználható kvantitatív célokra, mivel a szín intenzitása széles koncentrációtartományban követi a Lambert-Beer törvényt. A reagens feleslege nem befolyásolja a szín intenzitását. A komplex színe nem fejlődik ki azonnal, ezért félóra várakozási idő szükséges. A mérést az előhívástól számított két órán belül kell elvégezni. A fényelnyelés maximuma 520 nm-nél van. A mérés során vas(ii)-t tartalmazó Mohr-sót, az alkalmas ph beállítására pedig ammónium-acetátot használunk. A vas(ii)-ionok oxidációját hidroxilamin-hidroklorid hozzáadásával akadályozzuk meg. Oldatok: Fe(NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2 6 H 2 O 1,404 mg/cm 3 oldata, 5,0 g/dm 3 -os α-α, -dipiridil etanolos (96 %-os) oldata 50,0 g/dm 3 -os hidroxilamin-hidroklorid-oldat 200,0 g/dm 3 -os ammónium-acetát-oldat 0,20 mg/cm 3 koncentrációjú Fe 2+ -ionokat tartalmazó törzsoldatból hígítással 20 µg/ cm 3 oldatot készítünk. Ebből az oldatból 5,0, 10,0, és 15,0 cm 3 oldatrészletet 50 cm 3 -es mérőlombikba pipettázunk. 3-3 cm 3 hidroxilamin-hidroklorid-oldatot adunk hozzá, 2

3 majd 10 percig állni hagyjuk. 0,50 cm 3 α-α, -dipiridil-oldatot és 5 cm 3 ammónium-acetát-oldatot mérünk be a mérőlombikokba. Vakoldatot is kell készíteni Mohr-só nélkül. Desztillált vízzel jelre töltjük a mérőlombikokat, és egy félórát állni hagyjuk. A várakozási idő elmúltával fotometráljuk a vak oldattal szemben a kalibráló oldatokat és az ismeretlent tartalmazó oldatunkat. Megadandó: az ismeretlen Fe(NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2 -oldat koncentrációja mg/dm 3 -ben. Derivatív spektrofotometria alkalmazása gyógyszerek aktív hatóanyagtartalmának meghatározására (Sp. II.) A derivatív spektrofotometria hatásosan alkalmazható a zavaró spektrális átfedések kiküszöbölésére és segítségével pl. a tablettázott gyógyszerek aktív hatóanyagtartalmát határozhatjuk meg. A tablettázott gyógyszerek és többkomponensű rendszerek közvetlen UV spektrofotometriás analízisét gyakran zavarja az oldódott mátrix, valamint egyéb hatóanyag interferenciája spektrális átfedéssel. Szemben az abszorbancia additív jellegén alapuló módszerrel, ahol több komponenst határozunk meg, a derivatív spektrofotometriával általában csak egy kiválasztott komponenst. A feltétele az alkalmazásnak, hogy a zavaró komponensek széles átlapoló csúcsához képest élesebb csúccsal rendelkezzen a mérendő komponens. Az utóbbi időben számos irodalmi közlemény bizonyította, hogy a derivatív spektrofotometria az előbbiekkel szemben hatásosabban alkalmazható a zavaró spektrális átfedések kiküszöbölésére. Leggyakrabban a gyógyszer iparban alkalmazzák. Egy derivatív spektrum a következő differenciálok megjelenítése: da/dλ d 2 A/dλ 2 d n A/dλ n első derivatív második derivatív n-ik derivatív A derivatív spektrum ordináta értéke az eredeti spektrum adott hullámhoszszánál mért meredekségtől függ. Ezért ez a módszer különösen alkalmas kis, éles elnyelési sávoknak a széles sávoktól való elkülönítésére. Ha a nagyobb átlapoló csúcs a minta egyéb komponenseitől származik, a derivatív spektrum alkalmas a mérni kívánt alkotórész kvantitatív analitikai meghatározására. A mérés erősen függ a két sáv relatív félértékszélességétől. Ha a zavaró sáv félértékszélessége legalább kétszerese a mérni kívánt komponensének, akkor lehet hatásosan alkalmazni a derivatív spektrofotometriát. Bizonyítható, hogy ha egy λ hullámhosszon a minta egy komponensének elnyelése a 0-ad rendű spektrumban követi a Lambert-Beer törvényt, akkor a spektrum n-ed rendű deriváltjának amplitúdója szintén arányos a komponens koncentrációjával: D n = d n A/dλ n = d n ε/dλ n * c* l ahol D n-ik derivált amplitúdója (abszorbancia egység * nm -n ) A abszorbancia λ hullámhossz (nm) ε moláris abszorpcióképesség (dm 3 * mol -1 * cm -1 ) c koncentráció (mol * dm -3 ) l küvettahossz (cm) Az elsőrendű derivatív spektrumban a 0-ad rendű görbe abszorpciós maximuma zéró értéket vesz fel és az inflexiós pontok maximum, illetve minimum értéket mutatnak. A másodrendű derivatív spektrumot a gradiensváltozás sebességének lehet tekinteni. A 0-ad rendű spektrum abszorpciós maximuma minimumként jelenik meg és az inflexiós pontok maximumot mutatnak. A harmad- és negyedrendű derivatív spektrumok alkalmazása általában már nem előnyös, mivel a rendűséggel egyenesen nő az információs jelek száma is és nemcsak a felbontás, hanem a zaj is növekszik a deriválás rendjével. A derivatív spektrofotometria gyógyszeranalízisben való alkalmazásának főbb előnyei: A tablettázott mintákból kioldódó egyéb komponensek (töltőanyag, tabletta máz, stabilizátor stb.) zavaró háttérabszorpciójának kiküszöbölése. A spektrum felbontásának növelése. Többkomponensű rendszerek kvalitatív és kvantitatív meghatározásának lehetősége. Feladat: Libexin tabletták hatóanyagtartalmának meghatározása. Készülék: Perkin-Elmer Lambda 15 spektrofotométer, kétfényutas, számítógépvezérelt, nm hullámhossz-tartományban dolgozó rácsos spektrofotométer. Az UV-fényforrás: deutérium lámpa. 3

4 Minta: 1. Prenoxdiazin hidroklorid, 3-β,β-difenil-etil-5-β-piperidinetil/-1,2,4-oxidiazol hidroklorid; kiszerelt formája: Libexin kombinatum tabletta Etanolos oldatban az analitikai koncentráció tartomány: mg/cm 3. A második derivált spektrum adott hullámhosszon mért csúcsmaximum értékéből szerkesztjük meg a kiértékelő egyenest. 1. Az adott tiszta hatóanyagú mintából 5 mg/cm 3 koncentrációjú /50 cm 3 / törzsoldatot készítünk. Bemérés analitikai mérlegen folyik, az oldószer etanol. 2. A törzsoldatból büretta segítségével, hígítással elkészítjük a következő kalibrációs sorozatot (25 cm 3 mérőlombik, oldószer etanol): 0,25; 0,50; 0,75 és 1,00 mg/cm Egy tablettát porcelán mozsárban elporítunk, átkaparjuk, majd átmossuk egy főzőpohárba és 15 percig kevergetés mellett oldjuk. Ezután szűrőpapíron szűrve 100 cm 3 -es mérőlombikba visszük át a szűrőpapír többszöri átmosásával, végül a lombikot jelig töltjük /oldószer etanol/. 4. A kalibráló sorozat legtöményebb oldatával felvesszük az abszorpciós, valamint a D1-D2 derivatív spektrumokat nm tartományban. Referencia etanol. Tanulmányozzuk az egyes spektrumok tulajdonságait, azokból nyerhető információkat. 5. Állítsuk át a spektrofotométert D2 spektrum felvételére az adott paraméterekkel /melléklet/. Mérjük meg az oldatokat nm tartományban. A kiértékelő görbe megszerkesztésére a 268,3 nm illetve a 268,2 nm-es minimum amplitúdóit használjuk fel. 6. A kalibrációs egyenesből (d 2 A/dλ 2 vs. c) határozzuk meg a tabletta, valamint a kapott ismeretlen hatóanyag tartalmát mg/cm 3 -ben, illetve a tabletta esetén mg-ban kiszámítva. Paraméterek a derivatív spektrumok felvételéhez: Libexin Ordinate Mode D2 Slit 1 nm Scan Speed 60 nm/min Response 2 s Lamp uv Cycles/Time 1 / 0,05 min Delta Wavelength 1 nm Peak Threshold 2 D2 Recorder ON Ord min/max -50,00 / 40,00 Absc min/max 250,0 / 280,0 MOLEKULÁRIS FLUORESZCENCIA Tonik üdítőital kinin tartalmának meghatározása (Sp. I.) Kinin (C 20 H 24 N 2 O 2, M = 324,41) fehér, keserű, amorf vagy kristályos por, lumineszcens tulajdonságú. Vízben alig, tömény alkoholban és kloroformban jól oldódik. Alkaloid természete folytán, savakkal kristályosodó, vízben jól oldódó sókat alkot, pl. kinin-szulfát, kinin-citrát, kinin-hidroklorid, stb. Sok mikrobára már kis töménységben mérgező. Több országban üdítő italokban is használják (Tonic, Quinine Waters). HO CH 3 O H N N Kini(di)n: C 20 H 24 N 2 O 2, (Mt = 324,41) 4

5 Feladat: Tonik üdítőital kinin tartalmának meghatározása fluoreszcenciásan, kalibráló oldatsorozat segítségével. Spektrofluoriméter elvi vázlata: 1: xenonlámpa, 3: gerjesztőfény monokromátora, 4: mintatartó, 5: fluoreszcenciás fény monokromátora, 6: detektor, 7: adatfeldolgozó Készülék: Hitachi F-4500 spektrofluoriméter. Törzsoldatok: Eszközök: 0,05 mg/cm 3 koncentrációjú kinin törzsoldat (készítése: 0,050 g kinin cm 3 víz + 13,5 cm 3 cc. H 2 SO 4 -oldat, desztillált vízzel 1 dm 3 -re kiegészíteni) 0,5 N H 2 SO 4 (0,25 mol/dm 3 ) 5 db 100 cm 3 -es mérőlombik 3 db 100 cm 3 -es főzőpohár 1 db 5 cm 3 -es pipetta 1 db büretta 1. Kalibráló sorozat készítése: A kinin törzsoldatot bürettába töltjük. Ebből 2,0; 4,0; 6,0 és 8,0 cm 3 -t egy-egy 100 cm 3 -es mérőlombikokba mérünk. A mérőlombikokat 0,5 N kénsavoldattal jelig töltjük, majd gondosan összerázzuk. 2. Ismeretlen koncentrációjú kininoldatok előkészítése: A törzsoldatból kapott ismeretlent 100 cm 3 -es mérőlombikban szintén 0,5 N kénsavoldattal hígítjuk, a lombikot jelre töltjük és összerázzuk. 3. Tonik üdítőitalból kiveszünk kb. 20 cm 3 -t, és a szénsav eltávolítására pár percig forraljuk. Lehűtés után ebből a tonikos oldatból 5 cm 3 -t pipettával bemérünk 100 cm 3 -es mérőlombikba, majd a lombikot 0,5 N kénsavoldattal jelig feltöltjük. 4. Mérés: Spektrofluoriméterrel (elvi vázát ld. az ábrán) felvesszük a kalibráló sor legtöményebb oldatát használva a kinin 3D spektrumát (3D Scan alprogram).. A spektrum tanulmányozása alapján kiválasztjuk a gerjesztési és a fluoreszcenciás fény optimális hullámhosszát. 5. A Photometry alprogram segítségével felvesszük a kalibráló görbét és meghatározzuk az ismeretlen kinin oldatban, valamint a tonikban a kinin koncentrációját (mg/cm 3 ). A monokromátorok elrendezése a mintatartóhoz képest mindig derékszögű, így elkerülhetővé válik a gerjesztő fény zavarása az emittált fény mérésekor. Fluoriméterrel meg lehet határozni mind a gerjesztési, mind a fluoreszcenciás spektrumot. A készülék bekapcsolási sorrendje: Power Xenon lamp Main Számítógép Printer. A készülék működtetését részletesebben a gyakorlatvezető mutatja be. A program Windows alól az f4500 ikonnal indítható. 5