Genetikailag módosított organizmusok kimutatása és meghatározása élelmiszerekben

Átírás

1 ÉLELMISZERIPARI BIOTECHNOLÓGIÁK Genetikailag módosított organizmusok kimutatása és meghatározása élelmiszerekben Tárgyszavak: élelmiszer; szabályozás; GMO; kimutatás. Az USA-ban az 1999-ben kukoricával, gyapottal és szójababbal bevetett területek több mint 40, 50, ill. 45%-án a növények genetikailag módosított változatát termesztették, a szupermarketek élelmiszer-kínálatának pedig legalább 60%-a tartalmaz genetikailag módosított szervezetet (genetically modified organism, GMO). Az érdekelt ágazatok intenzív PR-programjainak köszönhetően az amerikai fogyasztók általában nem idegenkednek az új ételektől, szemben a világ más részeire jellemző bizalmatlansággal, sőt élénk, olykor szervezett visszautasítással. Az egészségügyi fenntartások mellett felmerültek a szellemi tulajdonjog problémái és a nem transzgénikus vetőmagok GMO-fertőződésének lehetősége is. Mindez arra késztette az EU illetékeseit, hogy egyrészt korlátozzák a GMO-tartalmú élelmiszerek importját, másrészt előírják ezek hagyományos árutól megkülönböztető megjelölését, a jelöletleneknél csupán 1%-os GMOtartalmat megengedve. Ugyanígy járt el a nem EU-tag Svájc és Norvégia is. Az USA legújabb szabályozása nem teszi kötelezővé a jelölést (címkézést), csak azt, hogy a GMO-tartalmú élelmiszer forgalmazásának szándékát a tervezett piaci megjelenés előtt legalább 120 nappal be kell jelenteni az illetékes szövetségi szintű hatóságnál (Food and Drug Administration, FDA). A nemzetközileg elfogadott évi Biológiai-biztonsági jegyzőkönyv (Cartagena Biosafety Protocol), amely a GMO-k országhatárokat keresztező szállítását szabályozza, megengedi a kormányoknak a határátlépés megtiltását, ha felmerül a fertőzöttség gyanúja. A GMO-vizsgálati módszerek típusai, mintavétel, referenciaanyagok Mindezen fenntartások, teljes vagy részleges tilalmak a kormányok, az élelmiszer-termelők, -feldolgozók és -forgalmazók számára egyaránt nélkülözhetetlenné teszik a GMO-k mennyiségi meghatározására alkalmas laboratóriumi módszereket.

2 Ezek a módszerek a terményben és az élelmiszerben a genetikai módosításként beültetett DNS vagy az általa kódolt új fehérje jelenlétének kimutatására vagy mennyiségi meghatározására alkalmasak. A vizsgálati anyagok gyakran inhomogén volta miatt kényes probléma mind a minta mérete és reprezentativitása, mind a mintavétel módja, így voltaképpen minden GMO-vizsgálati minta a módszer érzékenysége, megbízhatósága és költsége közötti optimálás (bizonyos kompromisszumok) eredménye. Ezért ez esetben különösen kívánatos volna a nemzetközi egyeztetés, pl. az USA Codex Alimentarius Bizottságának irányításával. Az elemző módszerek és laboratóriumok hitelesítéséhez a pozitív, ill. negatív eredményt igazoló referencia-anyagokra van szükség. E célra ismert GMO-tartalmú, stabil gabonamagvak, a génexpresszió folytán termelődött fehérjék és a módosított DNS egyaránt megfelelnek. Olykor használnak genom- és plazmid-dns-t is. A fehérjekimutatással ellentétben, amely könnyen viszonyítható egyetlen standard-hez, a DNS-alapú módszereket jobb több pozitív kontroll kombinálásával elvégezni. A referencia-anyagok beszerzését jelenleg megnehezítik a szellemi tulajdonnal összefüggő jogi és financiális gondok. Ilyen anyagok szójából, kukoricából korlátozott számban rendelhetők a Referencia-anyagok és -mérések Intézetétől (Geel, Belgium). Fehérjealapú vizsgálati módszerek Komplex mátrixba ágyazott fehérjék minőségi és mennyiségi meghatározására egyaránt kiválóan alkalmasak az immunvizsgálatok. A szükséges mennyiségtől, a detektáló rendszer specifikusságától, a vizsgálat megengedett időtartamától és költségétől függően használandók igen specifikus monoklonális vagy érzékenyebb poliklonális antitestek. A növényi szövetek tipikus GMO-koncentrációját (>10 µg/g) alapul véve, az immunvizsgálat 1% nagyságrendű GMO-t tud jelezni módosított fehérje formájában. Immunvizsgálatokat szilárd fázishoz kötött antitesttel két formában végeznek: az egyikben a detektáló és a kimutatandó anyag versenyez a befogó antitesthez való kötődésért,

3 a kettős ( szendvics -) próbában detektáló és a befogó antitest a közéjük zárt kimutatandó anyaggal szendvicset képez. A Monsanto Roundup Ready márkanevű transzgénikus szójaváltozatának vizsgálatára alkalmazták az ún. western blot módszert és az ELISA (enzimhez kötött immunszorbens próbát). Az új szójabab (Roundup Ready soybean, RRS) nem érzékeny a glifozát nevű gyomirtóra és egy Agrobacterium alfaj CP4-törzsében található, az 5-enol-piruvil-sikimát-3-foszfát-szintáz (EPSPS) enzimet kódoló gént tartalmazza. Western blot A western blot próbával nagy specifikussággal lehet megállapítani, hogy egy mintában a vizsgálandó fehérje koncentrációja kisebb vagy nagyobb-e egy adott értéknél. A különösen oldhatatlan fehérjék elemzésére alkalmas módszer inkább tudományos, mint rutin vizsgálatokra vált be, és a célfehérje nátrium-dodecilszulfát-poliakrilamid gélben történő elektroforézisén alapszik. Az elektroforézis nitrocellulóz membránra juttatja a fehérjét, ahol immunoglobulint megkötő helyeit szárított zsírtalan tej blokkolja. Az antitesttel felkutatott és megkötött speciális helyeket végül megjelölik színezékkel vagy szekunder immunológiai reagenssel. A western blot módszerrel elérhető kimutatási határ sült tésztában 1%, magvakban 0,25%. ELISA-módszer Az ELISA-módszer eszközei antitesttel bevont lemez, csík vagy cső. Alkalmas nagy volumenű, emellett nagy érzékenységű laboratóriumi vizsgálatok elvégzésére. A 90 perces lemezes vizsgálat eredményét: a minta koncentrációját optikai lemezen lehet leolvasni. Az EPSPS-t transzgénikus szójababban szintén 0,25%-ig, készítményekben 1%-ig lehet kimutatni. Az antitestbevonatú csővel terepen végezhetők perces kvalitatív vizsgálatok. Az ELISA-vizsgálathoz szilárd hordozófelületként mágneses részecskék is használhatók. A részecskéket bevonják a befogó antitesttel, és a reakció tesztcsőben megy végbe. A megkötött reakciópartnereket mágnes segítségével különítik el az oldatban maradtaktól. Ennek a módszernek a előnye a részecskék szabad mozgásának és egyenlő méretének tulajdonítható pontosság, valamint a kombinálás lehetősége immunvizsgálati tömegspektrometriával és az antitestnek a célmolekulához való kötődését megfigyelő bioérzékelőkkel. A GMO-vizsgálatokhoz való egységes és szabályozott alkalmazás megkívánja az ELISA- és DNS-alapú módszerek optimálását és hitelesítését. Az igen különböző anyagú élelmiszerek esetében az optimálás tényezői:

4 a paraméterválasztás (pl. a tesztkészlet minősége, módosított fehérjék választott vizsgálati módszere, inkubálás időtartama), a küszöbérték, vagyis a pozitív és negatív eredmény közötti határ megválasztása, a kereskedelmi forgalomban levő és a házi használatú tesztkészletek összehasonlítása, valamint a munkakörnyezet (a laboratórium vizsgálati gyakorlata esetleges fertőzési lehetőségek a környezet vagy a vizsgálandó személyzet oldaláról). A hitelesítésben szerepet játszó tényezők: az extrahálás hatékonysága, az eredmények pontossága két szoros eredmény megkülönböztetésének képessége, érzékenység, kimutathatósági határ, specifikusság, reprodukálhatóság, a kimutatás megbízhatósága. A legcélszerűbb referenciaként a vizsgálandó anyaghoz hasonló, ismert GMO-koncentrációjú mátrixot használni. 13 EU-állam és Svájc 38 laboratóriumának részvételével 2000-ben hitelesítő vizsgálatot végeztek az ELISA-módszer pontosságának ellenőrzése céljából. Ehhez szójalisztben RRS-nek a CP4-EPSPS-fehérje elleni monoklonális antitesttel és poliklonális antitesttel történő kimutatását választották. Az élelmiszerjellegű referenciaanyag 1,25% GMO-t tartalmazott. Az eredmények a vizsgálati mintában egységesen 0,35% körüli GMOkoncentrációt mutattak ki. Az ELISA-módszer a legjobb választás egy speciális GMO szűrővizsgálatára nyersanyagokban, félig feldolgozott élelmiszerekben és feldolgozott komponensekben, viszont a PCR-módszereknél kevésbé érzékeny több öszszetevőjű készételek vizsgálatára, különösen, ha alacsony a kimutathatósági határ. DNS-alapú vizsgálati módszerek Jóllehet a fehérjealapú vizsgálatok viszonylag egyszerűek és hatékonyak, néhány genetikailag módosított élelmiszerben a génexpresszió nem produkál kimutatható mennyiségű fehérjét. Ilyenkor használható a DNSkimutatás, amely a DNS kettős spiráljának két szála közti komplementaritáson és azon alapszik, hogy a spirál a szekvenciára jellemző módon hibridizálódik. A beültetett DNS különböző elemei promoterszakasz, szerkezeti gén, a génfunkciót leállító szakasz kimutathatók southern blot- és PCR-elemzéssel.

5 Southern blot A southern blot eljárás szerint az izolált DNS-mintát nitrocellulóz vagy nylon membránon rögzítik, a GMO-ra specifikus, kettős szál jelölésű nukleinsavval reagáltatják, és a hibridizálódást radiográfiás, fluorometriás úton vagy kemilumineszcenciával detektálják. A mintákat kezdetben 32 P-vel jelölték, de utóbb áttértek a DNS nem radioaktív, de hasonló érzékenységű dioxigenines vagy biotinos jelölésére, amellyel ráadásul 24-ről 1 órára rövidült a vizsgálat ideje. Egy évi közlemény a southern blot elvén két közeli infravörösben fluoreszkáló színezék használatáról számol be, amelyek 5 perces reakcióval közvetlenül kötődnek a DNS-hez. A színezék jelét két detektor egyidejűleg észleli. Kvalitatív PCR A PCR-módszer szintén a DNS-polimeráz specifikusságát használja fel olyan speciális DNS-szakszok megsokszorozására, amelyek egy több szekvenciát tartalmazó keverékben kis számban találhatók. Ezek elektroforézissel vagy nagy teljesítőképességű folyadékkromatográfiával választhatók ki. PCR-rel különféle élelmiszereket (búzát, kukoricát, rizst, burgonyát, paradicsomot) elemeztek. A vizsgálat mennyiségét korlátozó lépése a DNS kivonása és tisztítása. Az extrahálás elterjedt módszerei: az élelmiszerminta inkubálása egy detergens: cetil-trimetil-ammóniumbromid (CTAB) jelenlétében és DNS megkötése szilikongyantán. Az extrahálás során túlhevítés, alacsony ph (élelmiszergyártás közben gyakori) elősegíti a DNS degradálódását. Az élelmiszer-komponensek fehérjék, zsírok, szénhidrátok gátolhatják a DNS-polimerázt, ami azért figyelemre méltó, mert a sikeres PCR-elemzéshez minimálisan 400 bp (Mrd bázispár) DNS-átlagméret szükséges. Az EU-országokban kapható GMO-k többsége tartalmazza három genetikai elem valamelyikét: a karfiol-mozaikvírus, CAMV 355 promoterét és a nopalinszintáz (NOS-) terminátor vagy a kanamicin-rezisztencia marker gén. Ezek természetes módon is előfordulnak néhány növényben és talajbaktériumban, így a PCR-teszttel hamis pozitív eredményt adhatnak. Ezért minden pozitív eredmény esetében termékspecifikus PCR-viszgálatot kell végezni, amilyet számos élelmiszerre kidolgoztak. A kimutatási határ a cél-dnsre 20 pg és 10 ng között, a GMO tömegének 0,0001 és 1%-a között változik. A kvalitatív PCR nemzetközi hitelesítési vizsgálatát ezúttal 1998-ban 29 laboratóriumban végezték el, a GM szójababból származó 35S promoter és a

6 NOS-terminátor kimutatásával szójababban, kukoricában és feldolgozott élelmiszerekben. A 2% RRS-t tartalmazó minták mindegyikét minden laboratórium azonosította, ezenkívül hibátlanul azonosították CaMV 35S promoter elemzése alapján a 0,5%-nyi transzgénikus szóját. A NOS-terminátor vizsgálata nem ilyen megbízható, 3-7 hamisan negatív eredményt adott. Egy Svájcban ben a fenti két genetikai elem kimutatásával végzett hasonló körvizsgálat az egyes laboratóriumok eredményei közötti tízszeres különbségekkel végződött. A GeneScan Europe (Bremen, Németország) 2001-ben ismertetett, katalógusszámmal szereplő, élelmiszer-készítményekben GMOk összetett PCR-rel történő kimutatására alkalmas tesztkészlete ( GMO Chip: test kit for the detection of GMOs in food products ) specifikusan detektálja növényfajok és genetikai módosítási jegyek szekvenciáit. A mintából kiválasztott és megtisztított DNS speciális szakaszait két PCR-reakcióval megsokszorozzák, a reakcióterméket összekeverik, majd exonukleáz hozzáadásával egyszálas DNS-t készítenek. Ezután a mintát hibridizáló pufferrel vegyítve, a csipre terítik. Ekkor a csiphez kovalensen kötött cdns-mintákkal hibridizálódó, megsokszorozott szakaszokat megjelölik Cy5 fluoreszkáló színezékkel és Biodetect 654 biocsip-olvasóval elemzik őket. A GMO Chip Kit kimutatási határa kb. 250 másolat a PCR minden DNS-célszekvenciájában. Kvantitatív végpont PCR Mivel az EU-ban előírt élelmiszer-címkézés alapja a megengedett GMOtartalom, feltétlenül szükség van mennyiségi PCR-módszerre, amihez egy belső DNS-standard-et együtt kell megsokszorozni a cél-dns-sel. Ilyen a svájci kutatók által 1998-ban publikált kvantitatív-kompetitív (QC-) PCR módszer, amelynek lépései: az említett együttes sokszorozás közös reakciócsőben, a termékek szétválasztása pl. elektroforézissel, a gél elemzése denzitometriásan (sűrűség alapján), a standard és a cél-dns arányának becslése regresszióelemzéssel. Az ekvivalenciapontban a belső standard és a cél-dns induló koncentrációja egyenlő, vagyis a regressziós egyenes meredeksége 1, a regressziós együttható >0,99. A QC-PCR-módszerben a standard és a cél-dns közötti verseny következtében csökken az érzékenység, ennek ellenére a svájci közlés szerint megengedi 0,1% GMO-DNS kimutatását, és ez az arány az új, évi Európai Élelmiszer Szabályzat határértéke alatt marad. A QC-PCR hitelesítésére 12 európai laboratórium vállalkozott. A GMOkat tartalmazó kódolt mintákat kétszer vizsgálták és összehasonlították őket 0,5 és 2% RRS-tartalmú külső standard mintával. A hat RRS-tartalmú minta 246 meghatározása között nem volt hibás negatív eredmény, a kontroll negatív mintában pedig nem mutattak ki tévesen RRS-t. A laboratóriumok eredményei között kisebb volt a különbség, mint a kvalitatív PCR vizsgálat alkalmával,

7 s azt is a minta elégtelen homogenizálása okozta. A QC-PCR kalibrálását a továbbiakban a kereskedelemben kapható tanúsított referencia-anyaggal lehet elvégezni. Kvantitatív valósidejű PCR A valósidejű kvantitatív PCR abból indul ki, hogy jóllehet a PCR-termékek képződése elméletileg exponenciális, a valóságban ciklus után elér egy egyenletes szintet a reakciótermékek korlátozó hatása miatt. Ezeket a hagyományos PCR a reakcióprofil egyetlen pontján méri. A DNS-koncentráció egy korlátozott értéke fölött arányosság állapítható meg a DNS és PCRtermékek koncentrációja között (1. ábra), ami a mennyiségi mérés csökkent pontosságával jár együtt. Empirikusan azonban a valósidejű PCR-reakcióban, a DNS-koncentráció az exponenciális PCR-fázisban arányosnak bizonyul a PCR-ciklusok számával. Ha tehát ismert egy mintára az exponenciális növekedése folyamán ugyanazon pont eléréséhez szükséges ciklusok száma (1/c ábra), akkor meghatározható annak kezdeti DNS- (ezáltal GMO-) tartalma. (1/d ábra). (a) A (b) 15 B C PCR-termékek (c) PCR-termékek ,0 0,1 0,0 0 0 a GMO-k %-a a mintában 100 a GMO-k %-a a mintában 100 A ,1 0, a PCR-ciklusok száma G 1 0,1 B C D E F 0, F D E PCR-termékek (d) a PCR-ciklus száma E D C B F G 0,01 0, GMO% F E D C B 0,01 0, a PCR-ciklusok száma GMO% 1. ábra Különbség a hagyományos PCR (a, b) és a valósidejű PCR (c, d) között

8 Számos kereskedelmi forgalomban levő valósidejű PCR-hőciklizáló automatizálja az elemzést, ciklusról-ciklusra kísérve a reakciókinetikát és lehetővé téve a vizsgált szakasz koncentrációjának kiszámítását. Németországban egy évi beszámoló szerint a fenti eljárásnak 179 élelmiszer-készítményben (köztük diétás és bébiételekben, tésztafélékben, zsiradékokban, desszertekben) vizsgálták RRS jelenlétét. A módszer általában elég érzékenynek bizonyult, ennek ellenére a megsokszorozható szója- DNS-t nem mutatta ki zsírokban, olajokban és fűszerekben. Más minták közül viszont nyolcban 1% körüli genetikailag módosított RRS-t is sikerült kimutatni. Határhígításos PCR-módszer Az ún. határhígítás módszerének alapja a PCR optimálása egy endogén kontrollgén megsokszorozása útján a végső vízszintes PCR-szakaszból minden-vagy-semmi elven, valamint az a feltevés, hogy a reakcióelegyben egy vagy több célanyag (pl. GMO) pozitív eredményt ad. Mennyiségi meghatározáshoz a vizsgálandó anyagból hígítássorozatot kell készíteni. A hígítás határán, ahol negatív és pozitív végpontok is vannak, a jelen levő célpontok számát a negatívak arányából Poisson-féle statisztikával lehet kiszámítani. Meghatározás közeli infravörös (NIR-) spektroszkópiával A NIR-spektroszkópiát a gabonakereskedelemben kiterjedten használják az áru nedvesség-, fehérje-, keményítő-, olaj- és rosttartalmának roncsolásmentes meghatározására. Újabban kipróbálták hagyományos szója és RRS megkülönböztetésére. A szemek áramlása közben 8000 mintáról három Infratec 1220 berendezéssel felvett spektrumok 93%-ban helyesen különböztették meg a természetes terményt a transzgénikustól. A módszer nem igényel előkészítést, alig 1 perc alatt elvégezhető, ennél fogva olcsó is. Hátránya viszont, hogy nem azonosít vegyületeket, tehát kalibrálásra van szükség nagy adatbázis alapján, mégpedig minden felmerülő GMO-ra. Emellett a NIR nem mutatja ki a DNS vagy egyedi fehérjék megváltozását, csupán nagyobb szerkezeti változásokra reagál, amilyen pl. az új DNS hatására végbemegy a magok cellulózában és ligninjében. Az élelmiszerekben a génmódosított szervezetek kimutatására itt leírt módszerek az 1. táblázatban találhatók.

9 Összegzés a GMO-címkézés EU-szabályozásának követési feltételei Először hitelesített kvalitatív PCR alapján el kell dönteni, hogy a vizsgálandó élelmiszerben van-e GMO, ha az eredmény negatív, akkor a génexpresszió nyomán képződött fehérjére kell vizsgálni, ha az is negatív, akkor feltételezhető, hogy transzgénikus anyagok nem mutathatók ki. Amennyiben a kvalitatív PCR eredménye pozitív, a termék nem engedélyezettnek tekintendő és alá kell vetni hitelesített mennyiségi (Q-) PCR-nek a GMO-tartalom meghatározására, ha ez meghalad egy kijelölt hatáértéket, akkor a termékre fel kell tenni a nem engedélyezett GMO jelzést, ha nem éri el, nem kell címkézni. A DNS-alapú módszerek használata (fehérjealapúak helyett) azért bizonytalan, mert a genetikai módosítással nyert élelmiszerek (pl. finomított olaj) nem mindig tartalmaznak elegendő DNS-t, emellett az élelmiszergyártás folyamatai, leginkább a hevítés, roncsolják a molekulát. A relatív, vagyis %-ban kifejezett GMO-tartalomról természetesen tudni kell, hogy az az összes, valamennyi forrásból származó DNS-re, vagy csak a vizsgált termék DNS-ére vonatkozik. 1. táblázat A genetikailag módosított élelmiszerekben rekombináns DNS termékeket specifikusan meghatározó módszerek jellemzése Tulajdonság Fehérjealapúak DNS-alapúak western blot ELISA southern blot kvalitatív PCR valósidejű PCR QC-PCR és határhígítás Alkalmazás egyszerűsége nehéz közepes nehéz nehéz nehéz nehéz Speciális felszerelést igen igen igen igen igen igen igényel Érzékenység nagy nagy közepes igen nagy nagy nagy Időtartam 2 nap óra 1,5 nap 2 nap 1 nap perc Költség/minta, USD Kvantitatív eredményt nem igen nem nem igen igen ad Terepi vizsgálatra nem igen nem nem nem nem alkalmas Fő alkalmazás kutatólabor teszt kutatólabor teszt teszt teszt (Dr. Boros Tiborné)

10 Ahmed, F. E.: Detection of genetically modified organisms in foods. = Trends in Biotechnology, 20. k. 5. sz p Normile, D.: Asia gets a taste of genetic food fights. = Science, 289. k sz aug. 25. p Roseboro, K.: Standardizing GMO testing. = Food Processing, 61. k. 10. sz p EGYÉB IRODALOM Rodler I.: Hús és húsipari termékek biztonságának szerepe az élelmiszer-biztonság javításában I. = a Hús, 12. k. 2. sz p Szabó M.: Élelmiszer-biztonság és egészség hogyan tovább? = a Hús, 12. k. 2. sz p