Ph.D. Értekezés. Dr. Lohinai Zsolt

Átírás

1 Ph.D. Értekezés A NITROGÉNMONOXID BIOLÓGIAI JELENTÔSÉGE A FOGBÉLBEN ÉS A FOGÁGYBAN Dr. Lohinai Zsolt Témavezetô: Prof. Dr. Sándor Péter, az orvostudományok doktora Programvezetô: Prof. Dr. Monos Emil, az orvostudományok doktora Klinikai Kísérleti Kutató és Humán Élettani Intézet Budapest, 2002 Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Elméleti orvostudományok A vérkeringési rendszer normális és kóros mûködésének mechanizmusai Bírálóbizottság: Prof. Dr. Zelles Tivadar, az orvostudományok doktora, Prof. Dr. Nagy Sándor, az orvostudományok doktora és Dr. Kékesi Violetta kandidátus Hivatalos bírálók: Prof. Dr. Bari Ferenc, az orvostudományok doktora és Dr. Bartha Jenô 1

2 TARTALOMJEGYZÉK 1. MAGYAR NYELVÛ ÖSSZEFOGLALÓ ANGOL NYELVÛ ÖSSZEFOGLALÓ SUMMARY BEVEZETÉS CÉLKITÛZÉSEK A NOS anatómiai lokalizálása a fogbélben, az ínyben, a nervus és artéria alveolaris inferiorban és a ganglion trigeminaleban A NO. szerepe a fogbél és a foghús vérkeringésének szabályozásában A NO. jelentôsége a fogágygyulladás patomechanizmusában IRODALMI HÁTTÉR Az L-arginin/NO. rendszer A NO. felfedezése A NO. keletkezése az emlôs szervezetben A NOS izoenzimek NO. bioszintézise és mûködésük szabályozása A konstitutív NOS (cnos) A nnos Az enos Az indukálható NOS (inos) A nem enzimatikus NO. képzôdés. 24 2

3 A NO. hatásmechanizmusa A NO. mint élettani szabályozó molekula

4 A NO. kórélettani vonatkozásai és klinikai jelentôsége A NO. a száj egyes részeiben A NO. a szájüregben Az enterosalivalis nitrát/nitrit/no. körforgás A NO. a fogbélben és a foghúsban MÓDSZEREK A NOS anatómiai lokalizálása az ínyben, a fogbélben, a nervus és artéria alveolaris inferiorban és a ganglion trigeminaleban Sebészeti beavatkozások A NADPH-diaforáz enzim-hisztokémiai A nnos immunhisztokémia kimutatása Anyagok A NO. hatása a fogbél és a foghús vérkeringésére Sebészeti beavatkozások Kísérleti protokoll Általánosan mért élettani paraméterek A fogbél és a gingivomucosalis szövet véráramlásának mérése rádióaktivan jelzett mikrogyöngy módszerrel Anyagok Statisztikai értékelés. 44 4

5 6.3. A NO. jelentôsége a fogágygyulladás patomechanizmusában Sebészeti beavatkozások és kísérleti protokoll A gingivomucosalis NOS enzimaktivitás mérése Az inos anatómiai lokalizálása a gingivomucosalis szövetben A gingivomucosalis érfalpermeabilitás változásának meghatározása Az alveolaris csontrezorpció meghatározása Anyagok Statisztikai értékelés EREDMÉNYEK A NOS anatómiai lokalizálása A fogbélben Az ínyben A nervus és artéria alveolaris inferiorban A ganglion trigeminaleban A NO. hatása a fogbél és a foghús vérkeringésére A NOS blokkolás és a NO. adás hatása az általános élettani paraméterekre A NOS blokkolás és a NO. adás hatása a fog és a gingivomucosalis szövet véráramlására és érellenállására A NOS blokkolás és a NO. adás hatása a perctérfogat fogfrakciójára. 54 5

6 7.3. A NO. szerepe a fogágygyulladás patomechanizmusában A ligatúra hatása a gingivomucosalis szövet cnos és inos enzimaktivitására Az inos lokalizálása parodontitisben A MEG hatása a vérnyomásra, plazma extravazációra és az alveolaris MEGBESZÉLÉS A konstitutív NOS a fogbélben és a gingivomucosalis szövetben A konstitutív NOS anatómiai lokalizálása a pulpában és a parodontiumban A fogbél és az ínyszövet neurális NOS tartalmú idegrostjainak eredete A konstitutív NOS élettani funkciói a fogbélben és a gingivomucosalis A vérkeringés szabályozásában Az érkaliber beállításában Az érpermeábilitás kialakításában Egyéb funkciókban A szenzoros afferentációban A fog rögzítésében A konstitutív NOS szerepe az artéria alveolaris inferiorban A NO. a fogágygyulladás patomechanizmusában Az inos szerepe. 78 6

7 A fogágysorvadás NO. mediált kaszkádja (az oxidatív és a nitrozatív stressz és közös pontjainak hozzájárulása a fogágy Az inos szelektív blokkolása és a peroxinitrit megkötése a fogágygyulladás potenciális új terápiája lehet KÖVETKEZTETÉSEK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS IRODALOMJEGYZÉK Az értekezésben felhasznált közlemények Az értekezés alapjául szolgáló folyóiratban megjelent saját közlemények Az értekezésben idézett egyéb közlemények A szerzô egyéb közleményei Folyóiratban megjelent közlemények Könyvrészletek Folyóiratban megjelent citálható 7

8 AZ ÉRTEKEZÉSBEN HASZNÁLT RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE BF cnos cgmp CO COX-2 EDRF enos IL-1 inos ip. iv. L-NAME L-NMMA LPS MEG MMP mtsai n NADPH-d NADPH-d+ jelzett 7-NI nnos NO. NOLA NOS NTG ONOO - fogbél, illetve gingivomucosalis szövet véráramlása konstitutív nitrogénmonoxid szintáz ciklikus guanozinmonofoszfát perctérfogat indukálható ciklooxigenáz endothel erdetû érellazító faktor endothelialis nitrogénmonoxid szintáz interleukin-1 indukálható nitrogénmonoxid szintáz intraperitoneális(an) intravénás(an) N G -nitro-l-argininmetilészter N G -monometil-l-arginin lipopoliszacharid merkaptoetilguanidin mátrix metalloproteináz munkatársai állatok száma nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát-diaforáz nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát-diaforázzal 7-nitroindazol neurális nitrogénmonoxid szintáz nitrogénmonoxid N G -nitro-l-arginin nitrogénmonoxid szintáz nitroglicerin peroxinitrit 8

9 O 2 -. PMN ppm ppb SE SEM SIN-1 SNAP SNP SOD TNF-α PARS VIP szuperoxid polimorfonukleáris partikulum per millió partikulum per billió Semmelweis Egyetem az átlag standard hibája 3-morfolinoszidnonimin S-nitrozo-N-acetilpenicillinamin nitroprusszidnátrium szuperoxid dizmutáz tumornekrózis-faktor-alfa poli(adp-ribóz) szintetáz vazoaktív intesztinális peptid 9

10 MAGYAR NYELVÛ ÖSSZEFOGLALÓ A NITROGÉNMONOXID BIOLÓGIAI JELENTÔSÉGE A FOGBÉLBEN ÉS A Dr. Lohinai Zsolt Témavezetô: Prof. Dr. Sándor Péter Semmelweis Egyetem Doktori Iskola PhD program címe: A vérkeringési rendszer normális és kóros mûködésének mechanizmusai Budapest, 2002 A fogszuvasodás és a fogágybetegség népbetegség hazánkban. Az újabb vizsgálatok alapján megerôsítést nyert, hogy a fogászati fertôzések nem csupán lokális problémákat okoznak, hanem általános szervezeti betegségek, elsôsorban a cardiovascularis betegségek kiemelkedô rizikófaktorai is. Ezenkívül a hatvanas évek eleje óta több mint ötszörésére emelkedett a szájüregi daganatok száma is Magyarországon, ezért a szájüreg biológiájának kutatása nagy jelentôséggel bír, habár eddig még nem kapta Az elmúlt két évtizedben intenzív kutatási érdeklôdés fordult vazoaktív anyagok, különösen az endothel erdetû érellazító faktor (EDRF) tulajdonságainak megismerése felé. Az EDRF egyik lehetséges kémiai formája a nitrogénmonoxid (NO. ) szabad gyök, L-argininbôl keletkezik a NO. szintáz (NOS) izoenzimek hatására. A NO. az egyik legkisebb szintetikus, nagyon reaktív, rövid életidejû, fontos cardiovascularis, neurológiai és immun funkciókkal bíró intercelluláris hírvivô molekulája az emlôs élôlények sejtjeinek. A NO. -nak a fogbélre, illetve a fogágyra gyakorolt hatása relatíve kevéssé tanulmányozott, de úgy tûnik, hogy ezen a területen is sokrétû, alapvetô jelentôségû hatásokkal bír. Anatómiai vizsgálatainkban macskákon és kutyákon demonstráltuk, hogy mindkét szerv endotheliuma festôdik a NADPH-diaforázzal (NADPH-d) a NOS hisztokémiai markerével, valamint, hogy a fogbélben kis számban, a foghúsban nagy számban találhatóak NADPH-d pozitív/neurális NOS immunreaktív axonok. Ezek a rostok a NADPH-d/neurális NOS reaktív nervus alveolaris inferioron keresztül jutnak el 10

11 parodontalis szöveteibe, ahol szerepük lehet szenzoros (pl. fájdalom) és vegetatív (pl. véráramlás szabályozás) funkciókban. Rádioaktívan jelzett mikrogyöngy technikával macskában mért kísérleti eredményeink az L-arginin/NO. útvonal jelentôségét mutatják a fogbél és a foghús vérkeringésének szabályozásában. Kimutattuk, hogy a macska fogbélben és foghúsban NO. függô bazális vazodilatátor tónus található. Adataink arra utalnak, hogy míg a pulpa erek nyugalmi tónusának kialakításához hozzájáruló NO. fôleg az endothelialis NOS-ból és nem a csekély számú perivascularis neurális NOS-ból származhat, addig a gingivomucosalis szövet nyugalmi érellenállását az endothelialis NOS mellett még a neurális NOS bazális NO. termelése is folyamatosan csökkentheti. Továbbá feltételezzük, hogy az endotheliumból, perivascularis NO. -erg idegekbôl, illetve egyéb forrásból stimuláció hatására történô endogén NO. felszabadulásnak is szerepe lehet a pulpa értónusának regulációjában, mivel a fogbél vérkeringése szenzitív az exogén NO. -ra. Patkány ligatúrával kiváltott fogágygyulladás modellben a gingivomucosalis kötôszövet gyulladásos sejtjeinek és epitheliumának indukálható NOS expresszióján keresztül fokozza a NO. termelést. A szelektív indukálható NOS blokkoló és peroxinitritkötô merkaptoetilguanidin (MEG) kezelés ugyanakkor jótékony hatású a parodontitis tüneteire, csökkenti a következményes plazma extravazációt és Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy a fokozott NO. termelôdésnek, valamint a NO. és a szuperoxid reakciójából kialakuló peroxinitrit képzôdésnek szerepe lehet a fogágygyulladás patomechanizmusában. Feltételezzük, hogy parodontitisben a NO. és a peroxinitrit védô hatású az ínybe hatoló mikrobiológiai ágensekkel szemben, azonban lokálisan, nagy koncentrációban már a gazdaszöveteket is károsíthatják. A szervezet túlzott védekezési reakciójának csökkentésén alapuló új koncepció szerint úgy véljük, hogy a MEGnek potenciálisan terápiás szerepe lehet a parodontitisben kezelésében. SUMMARY THE BIOLOGICAL SIGNIFICANCE OF NITRIC OXIDE IN THE DENTAL PULP AND PERIODONTIUM 11

12 Zsolt Lohinai DMD Supervisor: Péter Sándor MD, DMSc Professor of Physiology Semmelweis University Doctoral School PhD program: Physiological and pathological mechanisms of the cardiovascular system Budapest, 2002 Caries and periodontitis are widespread diseases in Hungary. Recent epidemiological and clinical studies have shown that the dental infections are not only local problems, but are risk factors of systemic diseases most particularly cardiovascular diseases. In addition, the increase of oral tumors has been more than five-fold since the sixties in our country. Consequently, the research of the biology of the oral cavity is very important, however, still has not received the required attention and support so far. In the past two decades there was an intensive interest in the research of various vasoactive agents of the endothelial cells aimed at the characterization of the endothelium derived relaxing factor (EDRF). One possible form of EDRF is nitric oxide (NO. ) free radical, which is produced from L-arginine by the isoenzymes of nitric oxide synthases (NOS). NO. is one of the smallest synthetic, highly reactive, short lived intercellular messenger molecules of mammalian cells with important cardiovascular, neurological and immune functions. Although the information on the effects of NO. on the dental pulp and periodontal tissues are relatively scarce in the literature, it seems, that this free radical has substantial and versatile role in these tissues as well. In our anatomical studies in cat and dog we have demonstrated that the endothelial cells of both tissues are stained with NADPH-diaphorase, which is the histochemical marker of NOS. Furthermore, we observed a few NADPHdiaphorase positive and/or neuronal NOS immunoreactive perivascular and solitary axons in the dental pulp and abundant number of similar nerve fibres in the gingiva. These fibres travel within the inferior alveolar nerve to the pulp and the gingiva of the lower teeth and may participate in their sensory (i.e. pain) as well as in autonomic (i.e. regulation of blood flow) innervation. In our functional studies we have found that the L-arginine/NO. pathway plays an important role in the regulation of pulpal and gingivomucosal blood circulation measured by radioactive labeled microspheres in cat. Based on our data we suggest, that a NO. dependent 12

13 basal vasodilator tone exists in the dental pulp and the gingivomucosal tissue. In the pulp the resting tone of the vessels is probably influenced by NO. derived from endothelial origin and not from the small number of NOS reactive perivascular axons, however, in the gingivomucosal tissue the basal NO. may be derived from both sources. Furthermore, based on another study we presume, that the release of endogenous NO. from various sources in response to stimulation may also be involved in the control of the dental pulp vascular tone since the dental pulp circulation is sensitive to exogenously administered NO.. In a rat model of periodontitis, the ligature increases the local NO. production through the expression of inducible NOS in the inflammatory cells of the connective tissue and in the epithelium of the gingiva. On the other hand, mercaptoethylguanidine, a selective inhibitor of inducible NOS and a peroxynitrite scavenger treatment in the same model protects against the periodontitis associated extravasation and bone destruction. Based on these data, we suggest that enhanced formation of NO. and peroxynitrite play a significant role in the pathogenesis of periodontitis. We propose, that although the locally generated NO. and peroxynitrite protect the gingiva against the invading microorganisms, the overproduction of these agents in periodontitis may lead to the host tissue damage as well. Therefore, selective inhibition of inducible NOS may be of therapeutic utility in periodontitis. 13

14 3. BEVEZETÉS Továbbra is homályosan látok, csak magasabb szinten (Enrico Fermi) Minden bonyolult jelenségnek megvan a maga egyszerû, mindenki számára könnyen megérthetô, téves magyarázata (Murphy) A nitrogénmonoxid (NO. ) kétatomos kis molekulája az utóbbi csaknem másfél évtizedben hatalmas karriert futott be. Pályafutását egyébként megbélyegezetten, a kip környezetszennyezô komponenseként kezdte, de napjainkig eljutott odáig, hogy szervezetbeli szerepét az 1987-es elsô igazolása óta több mint orvosi-biológiai szakcikk ecseteli világszerte. Diadalmenete során 1992-ben az év molekulája, majd 1998-ban már a NO. -dal kapcsolatos kutatásokért adják az Élettani-Orvosi Nobel díjat megosztva Robert F. Furchgottnak, Ferid Muradnak és Louis J. Ignarronak. A NO. szervezetbeli funkcióit leginkább három területen, a vérkeringésben, az idegrendszerben és az immunvédelemben tölti be. Létezése mindenekelôtt akkor váltott ki hatalmas sajtóvisszhangot, amikor forgalomba került a merevedési zavarok tüneti kezelésére szolgáló sildenafil, a "kék tabletta", ami lényegében a NO. hatását erôsíti fel. Ezt a mostani különleges figyelmet akár méltatlan dolognak is vehetnénk, hiszen kezelésében már több mint száz éve alkalmazott nitrát típusú gyógyszerek naponta sok-sok életet mentenek meg azzal, hogy belôlük NO. szabadul fel. A NO. fontos biológiai szerepet játszik a digesztiv és a respirációs rendszerekben is.. részt vesz az értónus, a motilitás, a szekréció szabályozásban és a gyulladásos folyamatokban (281), a légzôrendszerben a perfúzió/ventilláció 14

15 kapcsolásában, a ciliáris motilitás létrejöttében és az infekció kontrollban (195). E két rendszer. -nak az élettani és kórélettani hatásait alig A szájüreg szinte minden szempontból relatíve kevésbé tanulmányozott a szervezet többi részéhez képest, sokan még a kutatásának a jelentôségét sem ismerik el. Pedig e terület biológiájának kutatása is nagy jelentôséggel bírna, mivel a szájüregi daganatos megbetegedések soha nem látott mértékben fokozódtak az utóbbi évtizedekben (323; 80). környékén kialakuló rosszindulatú daganatos betegségben elhunytak száma a hatvanas évek eleje óta több mint ötszörösére emelkedett (323, 80). Jelenleg az összes szervrendszert érintô rosszindulatú daganatos megbetegedések közül a szájüreget érintôek mintegy 4%-ban szerepelnek halálokként (80). A hazánkban lévô kritikus helyzetet mutatja, hogy mind a férfiak, mind a nôk vonatkozásában világviszonylatban is Magyarországon a legnagyobb a szájüregi daganat miatt meghaltak aránya (323; 80). A megoldáshoz a rendszeres és szigorú sztomato-onkológiai szûrésen, korai kezelésen kívül, epidemiológiai és biológiai vizsgálatokra is szükség lenne (14; 332)! A legújabb kísérleti adatok a NO. szerepét kimutatták a szájüregi daganatokkal kapcsolatban is (42; 44; 43). A szájüregben a másik kiemelendô tényezô a fogakkal kapcsolatos gyulladásos két nagy csoportba sorolhatók: dentális és parodontalis eredetû gyulladások. A fog kemény szöveteinek a szájüregi felszínén kezdôdô és mélybe haladó irreparábilis roncsolódása a caries, különösen a fejlett ipari országokban elterjedt. A szuvasodás progrediálása a fogbél (pulpitis), a gyökércsúcs körüli fogágy (periodontitis apicalis) és további szövetek gyulladásához vezethet (1). A fogakat rögzítô szövetek gyulladása a fogágybetegség (gingivitis ill. parodontitis) elôforduló bakteriális eredetû gyulladásos betegsége (257). A fogágybetegség a fogszuvasodással szemben nem civilizációs ártalom, mivel a magas egészségügyi kultúrával rendelkezô, fejlett ipari országokban alacsonyabb a betegség elôfordulási gyakorisága és intenzitása (102). Hazánkban a fogszuvasodás és a fogágybetegség is népbetegség. Felmérések szerint a fogszuvasodás elterjedtsége majdnem 100%-os, a lakosság közel 90%-a szenved ínygyulladásban, és ezek 15-20%-ának az állapota súlyosnak tekinthetô (102; 142). Hazánk ezeknek a betegségek gyakorisága tekintetében is az élen jár az európai rangsorban. Az állam fogászati ellátásra a CIX/1999 törvény szerint 2000-ben csak 10,41 milliárd forintot azt jelenti, hogy átlagosan minden állampolgárra 1041 Forint jutott. Ez 15

16 átlag huszadánál is kevesebb volt. Emellett a lakosság csupán 2.5 tubus fogkrémet ill. 0,56 fogkefét használ átlagban fejenként évente, így nem is csoda, hogy egy átlagos 12 éves gyermeknek - ebben a korban mégcsak éppen áttörtek a maradó fogak - már több mint 4 foga beteg, szuvas, tömött vagy hiányzik (142). Ez a helyzet hatvanöt év feletti lakosság mintegy fele pedig már teljesen fogatlan. Annak ellenére, hogy a fogbetegségek maradandó szövethiányt okoznak, az antibiotikumoknak köszönhetôen már nem lehet e betegségek szövôdményeinek következtében meghalni. Emiatt sokan úgy gondolják, hogy ezek jelentéktelen betegségek, egy fog elvesztése nem olyan nagy probléma, mert van másik. Ha viszont a fogászati problémákat a beteg szemével nézzük a az egész embert befolyásolja, tudatát erre az érzésmodalitásra fókuszálja, megzavarja az éjszakai pihenését és a probléma megoldódásáig elvonja a figyelmét az élet egyéb területeirôl, minden életkorban megkeserítheti a mindennapokat. A fogbetegség következménye a foglazulás, illetve a fogvesztés emésztési, esztétikai és fonetikai problémákat is okoz. Az állatvilágban ez pusztulást jelenthet az állat számára, mivel a fogaik segítségével védik meg magukat, ragadják és ölik meg a zsákmányt, aprítják fel, illetve ôrlik meg a táplálékukat (ennek elkerülésére az egyes állatfajok a hiányzó fogaikat biológiailag pótolni tudják). Az embernél a civilizációnak (tudománynak és technikának) köszönhetôen a foghiány következményei kielégítôen rendezhetôek, azonban volumenük miatt mégis társadalmiepidemiológiai és klinikai vizsgálatok alapján megerôsítést nyert, hogy a fogászati fertôzések nem függetlenek a szervezet egészétôl. szemléletváltozás történik ezen a területen. A legújabb vizsgálatok alapján ismét nagyobb hangsúlyt kap, hogy a fogakkal kapcsolatos gyulladásos betegségek nem csupán lokális problémát okoznak, hanem gócként viselkedhetnek. Belôlük a vérkeringésbe kerülô baktériumok és termékeik miatt általános szervezeti betegségek, elsôsorban a szív és érrendszeri betegségek kiemelkedô rizikófaktorai is lehetnek (314; 77; 204; 205; 262; 131; 18; 109; 61; 102; 285; 189). A cardiovascularis betegségeken kívül a tudományos vizsgálatok a fogászati gócok és a diabétesz, koraszülés, alacsonyabb újszülött súly és a respiratoricus betegségek között is összefüggést mutatnak (15; 133; 214; 286; 239; 61; 102). A fogászati gócok azonban nem csupán bizonyos betegségekre hajlamosíthatnak, hanem a magas rizikócsoportba (mûbillentyû beültetés után, reumás és bakteriális endocarditisen átesett egyének, ízületi protézist viselôk, immunhiányos állapotban szenvedôk, haemodializis 16

17 alatt álló vesebetegek) tartozó betegek számára közvetlen életveszélyt jelenthetnek, vagy a beültetett protézisük elvesztését okozhatják a fogászati/szájsebészeti ellátásuk során létrejövô átmeneti bacteriémia következményeként. Ezt megelôzendô a Magyar Fogorvosok Egyesülete ajánlotta a profilaxis alkalmazását a fogorvosok számára, illetve a Magyar Fogorvos szerkesztôsége szemléletformáló sorozatot indított a fogászati góckérdésrôl (64; 274; 250). Sajnos azonban kötelezô kezelési protokoll hazánkban még nem jelent meg! Mivel a cardiovascularis betegségek a vezetô halálokok hazánkban, legyôzésükhöz a rizikótényezôik okait is jobban meg kell ismerni. A fogászati/szájüregi kutatás valószínûleg a fenti adatok széleskörû ismeretének hiánya, és miatt nem kapja meg az ôt megilletô figyelmet és támogatást. A betegségek kórélettani az élettani háttér ismeretére is szükség van. A szájüregi kutatások a legkülönbözôbb biológiai anyagok élettani és kórélettani szerepét vizsgálták, de a. hatásairól -ami az élettani hatásain kívül a fenti betegségekben is lényeges lehet, mivel daganatkeltô és ellenes, illetve gyulladáskeltô és ellenes is lehet - alig van adat. 17

18 4. CÉLKITÛZÉSEK Kísérleteinkben a NO. biológiai jelentôségét, élettani és kórtani hatásait vizsgáltuk a fogbélben és a fogágyban. Legfontosabb fogas kérdéseink, célkitûzéseink foglalhatók össze: 4.1. A NO. SZINTÁZ (NOS) ANATÓMIAI LOKALIZÁLÁSA A FOGBÉLBEN, AZ ÍNYBEN, A NERVUS ÉS ARTÉRIA ALVEOLARIS INFERIORBAN ÉS A GANGLION TRIGEMINALEBAN A NO. szintáz (NOS) izoenzimek szájüregben történô anatómiai lokalizációja utalhat a NO. ezen területen betöltött szerepére, ezért A. Vizsgálni kívántuk, hogy a fogbélben és az ínyben mely anatómiai képletek tartalmaznak NOS-t nyugalmi körülmények között. (Az indukálható NOS (inos) izoenzim B. Tanulmányozni kívántuk, hogy van-e anatómiai alapja annak az elképzelésnek, hogy az alsó fogak és a fogakat rögzítô szövetek vérkeringésének regulációjában a NO. nemcsak lokálisan, hanem már a szervet ellátó artéria alveolaris inferior szintjén is részt vehet. C. Vizsgálni kívántuk, hogy az alsó fogak és a fogakat rögzítô szövetek feltételezetten nnos tartalmú idegrostjai származhatnak-e a nervus alveolaris inferioron keresztül a ganglion trigeminaleból, ami a szenzoros szerepüket vetné fel. 18

19 4.2. A NO. SZEREPE A FOGBÉL ÉS A FOGHÚS VÉRKERINGÉSÉNEK A. Meg kívántuk határozni, hogy a NOS blokkolásnak és a NO. adásnak milyen hatása van a fogbél és a foghús nyugalmi véráramlására és érellenállására. Létezik-e a pulpát. függô bazális vazodilatátor tónus, valamint az exogén NO. képes-e ezt az értónust befolyásolni? B. Vizsgálni kívántuk, hogy a NOS blokkolásnak és a NO. adásnak mi a hatása a perctérfogat fogfrakciójára. Hogyan viszonyulnak a fogban lezajló NO. függô hemodinamikai változások a szisztémás vérkeringés NO. függô redistribúciójához? 4.3. A NO. JELENTÔSÉGE A FOGÁGYGYULLADÁS PATOMECHANIZMUSÁBAN A parodontitis kialakításában a dentális plakk Gram-negatív baktériumainak szerepe már tankönyvi adat (187; 22). Mivel a Gram-negatív baktériumok indukálják az inos izoenzimet, ezért felmerült annak a lehetôsége, hogy a NO. hozzájárul a fogágygyulladás kórfolyamatához. Feltevésünk alapján: A. Meg kívántuk mérni az ínyszövetben a NOS konstitutív (cnos) és indukálható (inos) formáinak enzimaktivitását. Hogyan befolyásolja ezeknek az enzimaktivitásoknak az értékét a bal alsó elsô ôrlôfog köré kötött fogágygyulladást kiváltó selyem ligatúra a ligatúra melletti, illetve a kontralaterális oldali ínyszövetben? B. Meg kívántuk figyelni, hogy fogágygyulladásban, illetve kontroll körülmények között milyen anatómiai képletekben található inos C. Vizsgálni kívántuk, hogy a szelektív inos blokkoló és peroxinitritkötô merkaptoetilguanidinnek (MEG) milyen a hatása a fogágygyulladás tüneteire, a plazma az alveolaris csontpusztulásra. Pozitív eredmények esetén felmerülhet a 19

20 szelektív inos gátlás klinikai terápiában való alkalmazásának lehetôsége. 20

21 5. IRODALMI HÁTTÉR 5.1. AZ L-ARGININ/NO. RENDSZER (A kötött oldalszám és az L-arginin/NO. rendszer információ robbanása miatt ebben az általános pontban a többi fejezettôl eltérôen nem idézem minden egyes felfedezés szerzôjét, akiktôl ezúton is elnézést kérek, inkább fôként csak az összefoglaló publikációkra hivatkozom, amelyek a részleteket tartalmazzák.) A NO. felfedezése A NO. szabad gyök az 1980-as évek elôtt még csak egyike volt a levegôt szennyezô, a cigarettafüstben is kimutatható, karcinogén gázmolekuláknak, melyet összefüggésbe hoztak a savas esôk kialakulásával és az ózon réteg pusztulásával egyaránt. Napjainkra ennek az egyszerû és igen bomlékony gázmolekulának a megítélése alapvetôen megváltozott. A kis molekulájú, párosítatlan elektronja miatt rendkívül reakcióképes, erôsen mérgezô NO. -ot sok mindennek gondolhattuk, csak biológiai Jolly-Jokernek nem. Az élettani mûködések túlnyomó részét nagy méretû, összetett fehérjék és egyéb vegyületek szabályozzák, melyek. egyszerû szerkezetéhez képest. Jelenleg a NO. -ot tekintjük az új típusú, gázhalmazállapotú hírvivôanyagok elsô képviselôjének az élô szervezetben. Bár régóta tudjuk, hogy bizonyos baktériumok tartalmaznak NO. -t, korábban senki sem gondolta, hogy egy ilyen nagy reakcióképességû molekula fontos szerepet játszhat az emlôsök életmûködéseiben (218; 234; 139; 186). A NO. molekula biológiai hatásainak felfedezéséhez az 1980-as évek végén három kutatási terület találkozása vezetett: 1) Az endogén nitrátok és a makrofágok citotoxikus hatásának összefüggése: Már múlt század elején megfigyelték, hogy a bejutó mennyiséget meghaladó mennyiségben ürül az emberi szervezetbôl. Ezt akkor a belekben élô baktériumok termékének vélték, és nem tulajdonítottak neki jelentôséget ben mutatták csak ki, hogy a nitrátképzôdés a beleken kívül is történik (110). Majd megfigyelték, hogy fertôzések, lázas állapotok esetén a kiválasztott nitrát vegyületek mennyisége akár a tízszeresére is emelkedhet, és ebben a 21

22 makrofágok nitrát termelésének nagy szerepe van (311). Bebizonyosodott továbbá, hogy a makrofágok daganatsejtölô és baktériumpusztító hatásáért felelôs, ami a nitrát képzôdésnek a prekurzora (200; 122). 2) Az endotélium eredetû érellazító faktor (EDRF) kutatása: 1980-ban Furchgott és Zawadzki felfedezte, hogy az acetilkolin az intakt izolált artériákon dilatációt, az endothelium rétegétôl megfosztott izolált artériákon pedig kontrakciót vált ki. Az endothelium által termelt, az értágításért felelôs rejtélyes szubsztrátot EDRF-nek nevezték el (97) ben sikerült az EDRF azonos a NO. -dal (138; 255). 3) A vazodilatátor nitrátok hatásmechanizmusának tanulmányozása: A vazodilatátor az angina pectorisban kifejtett kedvezô hatásuk miatt, már több mint száz éve használják a gyakorlatban, azonban hatásmechanizmusukat sokáig homály fedte. Az 1980-as években bebizonyosodott, hogy a nitrovazodilatátorok is NO. képzôdéséhez vezetnek, és ezen keresztül aktiválják a guanilát-ciklázt az érfal simaizom sejtjeiben. (SNP) spontán, egyéb organikus nitrátok tiol csoporttal (pl. cisztein) érintkezve szabadítanak. -ot (227; 228; 140; 88).. a A NO. keletkezése az emlôs szervezetben A NOS izoenzimek NO. bioszintézise és mûködésük szabályozása A NOS enzimnek legalább három izoformája létezik a szervezetben, amelyek mindegyike igényeli a flavin-adenin-dinukleotid, flavin-mononukleotid, tetrahidrobiopterin, hem és cink kofaktorok jelenlétét. Szubsztrátjuk a NADPH, molekuláris oxigén és az L-arginin aminosav, amit azonban L-arginin tartalmú dipeptidek, mint az L-homoarginin és L-arginin-Laszparagin helyettesíthetnek, de az L-arginin D-enantiomerje már nem prekurzora a NO. szintézisnek. Az L-arginin terminális N-guanidino csoportjából a dimerizálódott NOS enzim. keletkezik. Az L-citrullint az arginilszukcinilsav szintetáz L- argininszukcináttá alakítja ATP és aszparaginsav felhasználásával, majd az arginilszukcinát fumársavvá és L-argininné alakul. A fumársavból a mitokondriumban a citrátkör útján aszparginsav képzôdik, miközben ammónia épül be. Ennek a módosított ureaciklusnak így két 22

23 szerepe van, egyrészt a NO. szintézise, másrészt sejtanyagcsere során termelôdött ammónia ismeretesek: A klasszikus csoportosítás szerint a NOS-nak a következô fôbb izoformái A konstitutív NOS (cnos) A cnos állandóan jelen van a sejtekben, aktivációja fôként poszttranszlációs kontroll alatt áll, melyek közül kiemelendô az intracelluláris Ca 2+ szint emelkedése. Stimulációja után rapidan és tranziensen pikomólnyi mennyiségben termel NO. -ot. Az elsôként leírt anatómiai lokalizáció alapján két típusa van: A neuronális NOS (nnos, vagy NOS 1) Ez az elsôként klónozott NOS, amelynek molekula tömege 160 kda. kromoszómán helyezkedik el. A nnos megtalálható a szomatikus és a vegetatív idegrendszer neuronjaiban és idegrostjaiban is, ahol a neurotranszmisszióban van szerepe. Kimutatták a az idegrendszeren kívül is pl.: a tüdô és a gyomor hámsejtjeiben, a nyálmirigyek acinussejtjeiben, az endothelsejtekben és a vázizomban is. 23

24 Az endothelialis NOS (enos, vagy NOS 3) Az endothelsejtekben a NOS 135 kda-os izoformáját izolálták. Az enos génje a 7. kromoszómán található. A bazális enos aktivitást fokozzák az extracelluláris jelzômolekulák (acetilkolin, bradikinin, P-anyag stb.) receptoraikhoz való kötôdése, vagy az endothelsejt mechanikai deformálása, membránjára ható nyíró erô erôsôdése, amelyek a NO. szintézisén keresztül vazodilatációhoz vezetnek. Az enos izoforma fellelhetô még pl.: a syncytiotrophoblastokban, a vese tubuláris epithelsejtjeiben és a hippocampus neuronjaiban is Az indukálható NOS (inos, vagy NOS 2) A cnos-sal ellentétben az inos nyugalmi körülmények között nem található meg a sejtekben, de a bakteriális endotoxinok és/vagy a különbözô citokinek (pl.: interleukin-1 (IL- 1), tumornekrózis-faktor-alfa (TNF-α), gamma-interferon) hatására elsôsorban a fagocitákban, a kültakaró sejtjeiben, de az általánosan elfogadott felfogás szerint valószínûleg a szervezet bármely sejtjében több órás latenciával, de novo egy kda molekula kromoszómán lévô kódológén átíródása után. Az inos megjelenése után maximálisan aktív, hosszú idôn keresztül nanomólnyi mennyiségben termel NO. -ot, aminek a mikroorganizmusok elleni védekezésben és a citotoxikus reakciókban van szerepe (352). A cnos-zal ellentétben az inos aktivitás fôként transzkripciós szinten regulálódik, az intracelluláris Ca 2+ szint változása nem befolyásolja. Bár a fenti csoportosítás ma már nem teljesen állja meg a helyét (a cnos is indukálódhat bizonyos esetekben, az inos konstitutívan is jelen lehet egyes sejtféleségekben, az inos által termelt nagymennyiségû NO. -nak nemcsak szövetkárosodást okozó következményei lehetnek pl. terhességben, stb.), de a nemzetközi irodalomban mégis ez a hagyományos felosztás jelenleg az irányadó. A NOS mindhárom izoformáját sikerült klónozni, aminosav sorrendjük kb. 50%-os azonosságot mutat. Egyéb, az emlôs szervezetben elôforduló enzimek közül a citokróm P-450 reduktázzal fedezhetô fel jelentôs szekvencia homológia, amely a gyógyszermetabolizmusban is fontos szerepet játszó citokróm P-450-nek juttat elektronokat. Egy sejtben több izoenzim is 24

25 expresszálódhat élettani körülmények között is, amit a patológiás állapotok még tovább kombinálhatnak. Alacsony celluláris L-arginin szint mellett a NOS képes szuperoxid szintézisre is. A végtermékgátlás mindegyik izoformánál megfigyelhetô, a NO. negatív feedback hatást fejt ki a saját szintézisére. A NO. biológiai szerepének megismerésében nagy segítséget. donor vegyületek (pl.: 3-morfolinoszidnonimin (SIN-1), nitroprusszidnátrium (SNP), S-nitrozo-N-acetilpenicillinamin (SNAP)), illetve az L-arginin szintetikus analógjai (pl.: N G -nitro-l-arginin (NOLA), N G -nitro-l-arginin-metil-észter (L-NAME), N G -monometil-larginin (L-NMMA)), amelyek képesek a NOS kompetitív gátlására (256; 113; 220; 225; 272; 179). Jellemzô, hogy a gátlás sztereospecifikus, a D-enantiomernek nincs hatása a NOSra és a gátlás L-argininnel kivédhetô. Ezek a széles körben alkalmazott NOS blokkolók azonban nem szelektíven gátolják a különbözô NOS izoenzimeket. Szelektív NOS blokkolók (pl.: nnos szelektív blokkoló a 7-nitroindazol (7-NI), inos szelektív blokkoló az aminoguanidin (AG)) kísérleti alkalmazása a NOS izoenzimek funkcióinak jobb megismerését segítették elô (221). Mellékhatásoktól mentes, nem toxikus, könnyen NOS izoenzim blokkolók jelenleg is intenzív fejlesztés alatt állnak. ( 39; 219; 218; 234; 302; 235; 240; 352; 20; 304; 316; 60; 353; 139; 174; 186; 271) A nem enzimatikus NO. képzôdés A NO. keletkezhet nem enzimatikusan az acidótikus hatásra létrejövô kémiai nitrit redukcióból (8; 24; 82; 364; 207; 360). A szervezetben ennek a NO. képzôdésnek élettani jelentôsége az alacsony ph-jú gyomorban, a parodontalis plakkban élô savtermelô baktériumok környezetében (lásd ) vagy ischemiás, gyulladásos kórfolyamatokban is lehet (148; 8; 24; 82; 364; 207; 360). A NO. képzôdhet még nem enzimatikusan gyulladásos szövetekben a hidrogénperoxid és az L-arginin reakciójából is (231) A NO. hatásmechanizmusa 25

26 A NO. egy új típusú, a régebben ismert szabályozó anyagoktól alapvetô tulajdonságaiban különbözô szignálmolekula. Bioszintézise után rendkívül gyorsan szétdiffundál, mivel mind vízben, mind lipidekben jól oldódik. Életideje 6-10 másodperc gyök könnyen lép reakcióba más molekulákkal. A szintetizálódott NO. kilép a sejtbôl, és a hatását a környezô sejtekre fejti ki, a vérbe kerülve oxihemoglobin jelenlétében rendkívül gyorsan nitráttá eliminálódik. A nagy reakciókészsége behatárolja a NO. parakrin hatásainak idôtartamát, és biztosítja, hogy a hatás lokalizált maradjon. A NO. - nak nincsen a hagyományos értelemben vett receptora, a NO. (1) fémekkel, (2) szabad gyökökkel és (3) oxigénnel lép reakcióba (139; 186). A különbözô nagyságrendû NO. koncentrációknál eltérô kölcsönhatások fordulhatnak elô, illetve ezek keveredhetnek is 1/a) A NO. legismertebb és legáltalánosabb célpontjai a guanilát-cikláz és egyéb A NO. stabil kovalens kötésbe lép a hem vassal, eközben a vas kiemelkedik a porfirin gyûrûbôl, megváltozik az enzim konformációja, ami a guanilát-cikláz aktiválódásához vezet. A guanilát-cikláz enzim katalizálja a guanozintrifoszfát konverzióját ciklikus guanozinmonofoszfáttá (cgmp), ami a sejttôl függôen több folyamatot is elindíthat. Ilyen pl.: a cgmp-függô proteinkináz specifikus intracelluláris fehérjék foszforilálása, ami módosítja a sejtfunkciókat, közvetíti a simaizom ellazulást, a szignáltranszdukciót az idegrendszerben; a cgmp-foszfodiészteráz a camp degradáción keresztül a NO. -cgmp és a camp hírközlô útvonalak egymásra hatását befolyásolja; a cgmp-függô aspecifikus kation csatornáknak pedig egy jellegzetes képviselôje található a fotoreceptorokban. hem protein target a ciklooxigenáz. A NO. koncentrációjától függôen serkenti vagy gátolja a ciklooxigenázt, ugyanakkor a ciklooxigenáz termékei is befolyásolják a NOS aktivitását módosítva ezzel pl. a gyulladásos választ. Szintén a NO. hem vas interakción keresztül gátlódik a citokróm P-450, a citokróm oxidáz, a kataláz és a NOS enzim is. A citokróm P- 450 gátlás megváltoztatja különbözô endogén és exogén anyagok metabolizmusát, farmakokinetikáját. A mitokondriális elektron transzport lánc terminális enzimének a citokróm oxidáz inhibiciójának a sejtlégzés szabályozásában van élettani szerepe, a kataláz blokkolás 2O 2 mediált citotoxicitást, baktericid aktivitást, a NOS enzim végtermékgátlása. termelést ( ), de az inos mediált endotheliális diszfunkcióban. 26

27 1/b) A NO. rapidan lép redoxreakcióba a fém oxigén komplexekkel, ennek legprominensebb példája az oxihemoglobin NO. oxidálása, ami methemoglobint és nitrátot A vörösvértestek ezzel a NO. katabolizmusában domináns reakcióval az erek felé irányuló jelentôs diffúziós grádienst, erôteljes NO. drenázst hoznak létre. 1/c) Ezenkívül számos olyan enzim létezik, amely nem hem prosztetikus csoport formájában tartalmaz vas atomot, leggyakrabban vasszulfid alakban, amelyekkel a NO. reakcióba lép és az enzim aktivitásának csökkenését okozza. Ilyen pl. a mitokondriális és a citoplazmatikus akonitáz inhibiciója, aminek következményeként gátlódik a sejt energia a csökkent ferritin szintézise miatt kialakuló vas anyagcserezavar a sejt életmûködését, növekedését, oxidatív folyamatainak katalizálását károsítja. Ezek a. direkt citotoxikus hatásaihoz. 2) Mivel a NO. szabadgyök, ezért könnyen lép reakcióba más szabadgyökökkel is. A ribonukleotid reduktáz tirozil gyökének és a NO. interakciójának eredményeként a DNS szintézis zavart szenved, aminek a NO. mediált mikroorganizmusok és tumorsejtek elleni citotoxikus mechanizmusban van szerepe. A lipid peroxidációban a NO. megköti a lipid lipidhidroperoxi gyököt és így leállítja a lipidszabadgyökök önmaguk újraképzôdését felerôsítô láncreakcióját. Ez a fô mechanizmusa a NO. oxidatív stressz ellenes védôhatásának. A szuperoxid és elsôsorban az inos által nagymennyiségben szintetizált NO. kombinációjából keletkezô nagyon reaktív peroxinitritnek az oxidációs és nitrációs (NO + 2 ) reakciókban van kiemelkedô szerepe. Alacsony L-arginin, vagy magas lipoprotein koncentráció esetén a NOS szintén képes szuperoxid termelésre, ezért a NOS-t bizonyos feltételek teljesülése esetén peroxinitrit szintáznak is nevezhetjük. A peroxinitrit féléletideje kb. 1 szekundum, de ez elegendô, hogy szignifikáns interakciókba lépjen a biomolekulákkal. Vizes oldatban protonálódik, így képes nitráttá izomerizálódni. A peroxinitrit a hatásait csak részben önmaga, inkább a peroxinitrit és a széndioxid interakciójából kialakuló nitrozoperoxikarbonát, NO 2. és CO 3 -. szabadgyökökön keresztül fejti ki. A peroxinitrit oxidációs reakciói közül a lipidperoxidáció következtében kialakuló membrán károsodás, a mitokondriális légzési komplexek oxidálása miatt létrejövô sejtlégzés zavar, a glutation oxidációja következtében csökkent enzim regenerációs képesség, a DNS oxidációja, törése és mutagenézis indukálása a ma ismert fôbb mechanizmusok. Másik fontos következménye a peroxinitrit képzôdésének a tirozin fenol gyûrûjének nitrálása, ami a 3-nitrotirozin kialakulásához vezet. A 3-nitrotirozin detektálását sokáig a peroxinitrit in vivo biomarkerének 27

28 tartották, de az újabb adatok azt mutatják, hogy a 3-nitrotirozin a peroxinitrittôl függetlenül is keletkezhet a NO. oxidált intermedierjei, azaz a reaktív nitrogén szpecieszek reakciói által. A szuperoxid dizmutáz (SOD) nitrációja gátolja az enzim aktivitását, ami a szuperoxid eliminálásának csökkenése miatt a peroxinitrit képzôdést segíti elô. A citoszkeleton nitrálódása a sejt architektúrájának dezorganizációját okozza. A prosztaciklin szintáz nitrációja gátolja a. és az arachidonsav metabolizmus kölcsönhatásának további lehetôsége. Nitrációja a protein tirozin-kináznak gátolja a saját foszforilációját, ezzel az intracelluláris jelközvetítô kaszkád mûködését. 3) Vizes oldatokban a NO. molekuláris oxigénnel lép reakcióba és nitritté alakul nitrogéndioxid és dinitrogéntrioxid intermediereken keresztül. Mivel mind a NO. és az oxigén is lipofil karakterû, a reakciójuk nagyon jelentôsen felgyorsul a hidrofób biológiai membrán kompartmentekben. Nagymennyiségû NO. termelôdés esetén a dinitrogéntrioxid szignifikáns + ) okoz, ami N-nitrózaminok és S-nitrozothiolok képzôdéséhez vezet. A N- nitrózaminokat teszik felelôssé egyéb tényezôk mellett a krónikus gyulladásos talajon kialakuló rákkeltésért. Az S-nitrozothiolok NO. donor molekulák, szerepük lehet a NO. raktározásában és szállításában. Ezenkívül az S-nitrozációt a legújabb adatok alapján széles körben elterjedt, a foszforilációhoz hasonló regulációs mechanizmusnak tartják. Intracelluláris metabolikus útvonalak, transzkripciós faktorok, receptorok és ioncsatornák szabályozásában is részt vesz. (irodalmi áttekintés: 218; 234; 238; 7; 73; 21; 30; 20; 316; 60; 153; 307; 260; 139; 186; 193) A NO. mint élettani szabályozó molekula Az L-arginin/NO. /cgmp reakcióláncolatot leginkább az erekben tanulmányozták, ahol a mechanizmus lényege a következô: a véráramlás hatására keletkezô nyíró erô és a perfuzátumba kerülô számos lokális mediátor (pl.: acetilkolin, bradikinin) aktiválja az enos enzimet az endothel sejtekben. A frissen szintetizálódott NO. a kis méretének és lipofil tulajdonságának köszönhetôen átdiffundál a szomszédos simaizomsejtbe, aktíválja a guanilát cikláz enzimet a hem kofaktorához kötôdve. A következményes cgmp szint növekedés protein foszforiláción keresztül a citoszól kálcium koncentrációjának csökkenéséhez, simaizom relaxációjához és így vazodilatációhoz vezet (218; 234; 352). Az endotheliumból 28

29 felszabaduló NO. a perfúzió beállításán kívül befolyásolja az érfal permeábilitását, gátolja az érfal simaizom proliferációját, valamint a vérlemezkék aggregációját és adhézióját és a leukociták kitapadását is, ezért trombózis és gyulladásellenes hatású is. Az arteriolákban állandóan érvényesül a NO. tónusos értágító hatása. Az állandó, tónusos jellegû NO. felszabadulás mellett egyes változó intenzitású fiziológiai tényezôk is. -ot, mely viszont fázisos jellegû. Az egyik tényezô mechanikai: a véráramlás sebeségének fokozódása az endothelsejtekre ható nyíróerôk növekedése következtében növeli az endothelsejten belüli kálcium szintet, ezzel a NOS aktivitását. Ezzel a hatással a prekapilláris rezisztenciaerekben bekövetkezô értágulat visszahat a megelôzô artériaszakaszra is, minthogy a véráramlás sebessége az arteriolatágulat eredményeként ott is megváltozik (retrográd vasodilatatio). Ilyen módon az endothelsejtek a keringésben áramlási érzékelôként (szenzorként) is mûködnek, és a vazodilatátor anyag kibocsátásával az érkalibert. szerepet játszik az idegrendszer morfogenézisében, antero- és retrográd nem konvencionális transzmitterként mûködik. A NO. -ot azért tartjuk atípusos neurotranszmitternek, mert nem raktározódik vezikulákban, nem kvantumokban szabadul fel az idegingerület hatására és nincsen a szokványos értelemben vett receptora sem. A NO. -erg idegek a központi idegrendszerben a szinaptikus plaszticitás befolyásolásán keresztül a tanulás, a memória és a viselkedés, a gasztrointesztinális és az urogenitális traktusban a szfinkterek tónusának, a perisztaltikának, a szekréciónak a szabályozásában, a cardiovascularis rendszerben a lokális értónus kialakításában, a respiratórikus rendszerben a légutak simaizomtónusának a beállításában és a belsôelválasztású mirigyek szekréciójának szabályozásában is részt vesznek. Újabb felfogás szerint, élettani-kórélettani szerepét tekintve a NO. ambivalens karakterû, Jánus arcú molekula az emlôs szervezetben, mert míg a cnos által termelt kis. jelátvivô és citoprotektív, addig az inos által nagy mennyiségben szintetizált NO. viszont már citotoxikus hatású is lehet. Gyulladásban az endotoxinok és a citokinek triggerelik az inos expresszióját. A nagy mennyiségben termelôdô NO. szerepet játszik a nem specifikus immunitásban, toxikus a baktériumokra, vírusokra, gombákra, protozoonokra és a tumorsejtekre is (218; 234). A NO. önmagában valószínûleg kevésbé mérgezô mint ahogy korábban gondolták, a NO. által mediált toxikus hatásokért részben a NO. és a szuperoxid kombinációjából keletkezô peroxinitrit és ebbôl tovább képzôdô ma még 29

30 kutatások tárgyát képezô, nagy oxidációs képességû vegyületek (reaktív nitrogén szpecieszek mint pl. a nitrogéndioxid gyök) a felelôsek. (irodalmi áttekintés: 40; 219; 218; 234; 302; 78; 238; 7; 73; 21; 30; 281; 195; 20; 316; 320; 60; 153; 260; 139; 174; 186; 193) 30

31 NO. kórélettani vonatkozásai és klinikai jelentôsége Általánosságban megállapíthatjuk, hogy a NO. fiziológiai koncentrációban citoprotektív hatással bíró hírvivô molekula, de a túltermelôdése már toxikus lehet a gazdaszövetekre. Ezért a pathomechanizmustól függôen bizonyos betegségekben, ahol az enos ill. nnos csökkent aktivitású, a NO. koncentrációját a célszövetekben fokozni kell az élettani szintre. Ezzel szemben más esetekben, ahol az inos ill. nnos aktivitás túlfokozott, a NO. koncentrációjának csökkentésére van szükség. Az L-arginin/NO. útvonal klinikai farmakológiai módosítása újfajta megközelítést, jelentôs elôrelépéseket hozhat a különbözô A gyógyászatban már régóta rutinszerûen alkalmazzák a korábban említett NO. donor nitrovazodilatátorokat (lásd ) iszkémiás szívbetegségek, hipertenzív krízisek terápiájában. Újabban hatásosnak bizonyult. inhalációban alkalmazva pulmonalis hipertóniában, respiratoricus distress szindrómában és bronchopulmonalis displasiaban is. Endotheliális diszfunkcióban, atheroszklerózisban a csökkent NO. termelôdés vazospazmushoz, trombózishoz, iszkémiához, érfal simaizom proliferációhoz vezet. Per os vagy infúzióban adott L-arginin ezekben a kórképekben javítja a károsodott endothelium függô vazorelaxációt, gátolja a trombózisképzôdést. A corpus cavernosum NO. szintjét növelô anyag adása az erekciós eredetû impotencia kezelésében lehet bíztató. Vizsgálatok igazolták, hogy a gyerekek pylorus stenózisának kialakulásáért feltehetôen a lokális nnos Sok adat gyûlt össze a NO. és a következményes reaktív nitrogén szpécieszek gyulladásban játszott szerepérôl. Az endotoxinok és a citokinek triggerelik az inos expresszióját, ami nagymennyiségû NO. keletkezéséhez vezet. Az ennek következtében kialakuló kifejezett vazodilatáció bakteriális szepszisben drámai vérnyomás csökkenést és keringésösszeomlást eredményez, amely a NOS gátlásával megfordítható. Krónikus gyulladásokban pl.: izületi gyulladás, vagy autoimmun betegségekben a túltermelôdô NO. szövetkárosodásokhoz vezet, míg véreztetéses sokkban a vaszkuláris dekompenzációban játszik szerepet. A NOS gátlók azonban nemcsak a túlzott NO. szintézisért felelôs inos-t, hanem a fiziológiailag szükséges cnos-t is blokkolják, ami túlzott vazokonstrikcióhoz, a mikrocirkuláció zavarához és a vitális szervek károsodásához vezethet, ezért a szelektív inos gátlók használata a célravezetô megoldás. Az agyi iszkémiában létrejövô neurotoxicitást 31

32 részben az excesszíven felszabaduló excitatórikus glutamát NMDA receptorok túlingerlésének következtében az nnos-ból felszabaduló nagymennyiségû NO. mediálja, ezért a NOS blokkolók alkalmazása, különösen a szelektív nnos gátlószerek ígéretes eredményt mutatnak. Hasonló mechanizmusnak lehet pathogenetikai szerepe a neurodegeneratív folyamatokban is, mint pl.: az Alzheimer, vagy a Huntington kór. A perivaszkuláris idegek túlzott nnos aktivitása is lehet bizonyos fejfájások oka, amit a NOS blokkolók jótékony hatásai igazolnak. NO. koncentráció csökkentô hatású lehet még a NOS izoenzim gén expressziójának szelektív blokkolása, a NOS kofaktorainak redukciója, vagy a NO. gyökfogók és a peroxinitrit dekompozícióját elôsegítô szerek alkalmazása is. az L-arginin/NO. szubsztitúció új terápiás lehetôségeket kínálhat számos egyéb betegség kezelésében is, azonban a gyógyászatban történô alkalmazásuk még további kutatásokat, ismereteket kíván (irodalmi áttekintés: 219; 78; 238; 7; 73; 21; 30; 264; 316; 60; 226; 153; 260; 139; 193; 347) A NO. A SZÁJ EGYES RÉSZEIBEN A NO. a szájüregben A NO. a következô módokon kerülhet a szájüregbe: (1) a ki-belégzett levegôvel, (2) a szájüreget körülvevô szövetek, nyálmirigyek NOS izoenzimjeibôl, (3) képzôdhet a szájüregben a baktériumok nitrit reduktáz enzimén keresztül, vagy (4) keletkezhet nem enzimatikus nitrit redukcióból is (45; 33; 82; 266; 195; 360; 280). Hogy a szájüregi levegôben és nyálban milyen tényezôk befolyásolhatják a NO. megoszlását e két kompartment között, valamint a NO. és a nitrit, illetve a nitrit és a NO. konverzióról a nyálban, jelenleg még alig van adat. A civilizáció kialakulásával az emberiség lokálisan nagy mennyiségû NO. -ot jutatott be a szájüregbe a dohányfüsttel ( ppm, 236), a szennyezett levegôvel (266), vagy a nyelv alól felszívódó antihipertenzív nitrovazodilatátor szerekkel. A szájüregi NO. képzôdés mellett szól, hogy a szájon át kilégzett levegô NO. koncentrációja (5-15ppb) magasabb, mint a tracheostomian keresztül kilégzett levegô NO. koncentrációja, de kisebb mint az orron át kilégzett levegô NO. koncentrációja az orrmelléküregek nyálkahártyája által 32

33 nagymennyiségben termelt NO. miatt (195). A kilégzett levegô NO. tartalmát a különbözô légzôszervi gyulladások fokozzák, ezért a kilégzett levegô NO. koncentrációjának a mérése gyors, noninvaziv diagnosztikus és terápiás monitorozása lehet a légzôszervi betegségeknek (195; 79). A nyálmirigyek is szekretálnak NO. -ot a szájüregbe, amely idegi szabályozás alatt áll (33). A szájüreget körülvevô szövetek NOS izoenzimjeiben (elsôsorban az inos-ban, lásd ) szintetizálódott NO. is bediffundálódhat a szájüregbe, illetve a sulcus gingivae-n keresztül a szájüregbe kerülô fehérvérsejtek inos enzime is hozzájárulhat a nyál NO. tartalmához (160; 233; 76; 280). A nyál nitrátot és nitritet a szájüregben élô baktériumok anyagcseréjükhöz és az egymás elleni küzdelemben is felhasználhatják (49; 50; 300; 4). Baktériumok, fôként a nyelvháton élôk a nitrát reduktáz enzim által a nyál nitrátból képzett nitritettel védekeznek többek között a többi mikroorganizmus ellen (327; 330; 82; 195; 81). Ezért az lehet annak a klinikai tapasztalatnak a magyarázata, hogy a széles spektrumú antibiotikum kezelés után orális candidiasis alakulhat ki, hogy az antibiotikum elpusztítja a Candida Albicans ellenes küzdelemben részben a fenti mechanizmust is felhasználó baktériumokat (81; 82). A nyál nitrit. képzôdhet az alacsony ph-jú cirkumdentális területeken nem enzimatikusan is (lásd ) (148; 82; 360), úgy mint a gyomorban (24; 207). Lépcsôzetesen emelkedô koncentrációjú nitrites szájöblítéssel végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy a nitrit redukció kapacitása a szájüregben nem limitált, a reakció limitáló tényezôje inkább a nitrit koncentrációja lehet (360). A bakteriális enzimatikus nitrát és a nem enzimatikus nitrit redukció eredményezheti a NO. és a nitrit koncentrációjának paralell növekedését orális nitrát bevitel után (82; 360). Ezt igazolja, hogy nitrát bevitel után klórhexidinnel, vagy bikarbonátos szájvízzel való szájöblítés után a kilégzett NO. koncentrációja azonnal lecsökkent, valószínûleg az antiszeptikus hatás, illetve a ph fokozása miatt (360). Ezek a szájöblítôk nemcsak nitrát bevitel után, hanem normális körülmények között is csökkentik a kilégzett NO. koncentrációját, igaz, hogy kisebb mértékben, ami a nyál. tartalmának a kilégzett NO. -hoz való nyugalmi hozzájárulására utal (360). A plakk anaerob denitrifikáló baktériumainak nitrit reduktáz enzime is termelhet NO. - ot. Ezek a baktériumok nitritet használnak fel a légzésükhöz, ahol a NO. egy intermedier (106; 45), viszont ezek a baktériumok a NO. -ot toxicitása miatt alacsony koncentráción tartják. A szájüregnek a légutaktól való izolálása után NO. mentes levegô beinjektálását 30 másodperccel követôen a szájüregi levegô NO. koncentrációja 44,3±4,9 ppb-ot ér el (50). 33