Elcsendesített RNS-ek vagy a genom immunrendszere

Átírás

1 BIOTECHNOLÓGIAI FEJLESZTÉSI OLITIKA, KUTATÁSI IRÁNYOK Elcsendesített RNS-ek vagy a genom immunrendszere Tárgyszavak: genom; védelem; immunrendszer; RNS-csendesítés. A génkészlet fokozatos változása vírusok hatására A bonyolultabb szervezetek génkészlete állandóan ki van téve vírusok és egyéb transzponálható elemek általi támadásnak. Az emberi génkészlet 45%- a korábbi vírus vagy transzpozon támadások maradványa, és vannak még ma is működő elemek: 21% hosszú elvegyített nukleáris elem, 13% rövid elvegyített nukleáris elem, 8% retrovírus, 3% DNS-transzpozon, amit a 2%-nál is kevesebb (nem transzpozon) proteint kódoló génállománnyal kell összevetni. Azt várnánk, hogy a szervezetnek az ilyen támadásokat vissza kell vernie, különben az idegen DNS teljesen átveszi a saját genom szerepét. A genom védelménél ugyanaz a két probléma merül fel, mint a fejlettebb élőlények immunrendszere esetében: a) hogyan különböztesse meg a saját elemeket az idegentől, és b) hogyan erősítse fel specifikus módon a kezdődő válaszreakciót. A gerincesek immunrendszere két lépcsőben veszi fel a küzdelmet a behatolókkal: kombinatorikus génátrendeződésekkel előállított antitestkódoló génekből nagy készletet halmoznak fel, és ezt a készletet elosztva, sok sejtben tárolják. Fertőzés után klónszelekció és néhány sejt szelektív elszaporodása következik be, ami specifikussá teszi az immunválaszt. A gerincesek immunrendszere tehát úgy oldotta meg a problémát, hogy kezdetben egy többé-kevésbé véletlenszerű repertoárt alakított ki, amelyet a korai fejlődés fázisában egy szűrőmechanizmus, az úgynevezett tolerancia-indukció korlátoz: a saját antigénekkel szemben fellépő sejteket az érett immunrendszer kizárja önmagából. Hogyan ismeri fel a genom a behatolókat, és hogyan hoz létre határozott és specifikus immunválaszt ezekkel szemben? Egy lehetséges stratégia a transzpozon szekvenciák szelektív metilezése, bár más vélemények szerint ez csak a szuppresszió melléktünete. Az utóbbi években felfedeztek egy igen ősi csendesítési mechanizmust, amely az RNS-re épül, és megvan a gombák, állatok és növények világában is. Ezt a mechanizmust több szervezetben füg-

2 getlenül is felfedezték és leírták, még mielőtt rájöttek volna, hogy a mögöttük rejlő folyamatok lényegében közösek. A növényekben leírt poszttranszkripciós géncsendesítés (TGS) és ko-szuppresszió, a növények RNS-közvetített vírusrezisztenciája, az állatoknál felfedezett RNS-interferencia (RNSi), az algáknál és gombáknál leírt géncsendesítés lényegében mind hasonló mechanizmusra épül. Ezt igazolja a kis interferáló RNS-ek (sirns) közös előfordulása, valamint a jelenség előfordulásához szükséges gének homológiája egymástól eltérő csoportokhoz tartozó élőlények esetében. Az RNS-csöndesítés mechanizmusát egyre jobban kezdik feltárni. Itt most csak ennek egy részletéről lesz szó, arról az erősítési (amplifikációs) mechanizmusról, amely a gerincesek immunrendszerének klónszelekciójával analóg folyamat. Az RNS-csöndesítés funkciója A hengeresférgek és a legyek normál esetben ritkán találkoznak koncentráltan olyan dupla szálú RNS-sel (dsrns), amelynek szekvenciája megegyezne saját endogén génjeikkel. A genetikai vizsgálatok mégis azt mutatják, hogy a géncsöndesítéshez szükséges gének száma, amelyeket külső dsrns aktivál, valószínűleg 10-nél is több. Mi lehet ennek a bonyolult anyagcserefolyamatnak a természetes funkciója? A legtisztább képet a növények esetében kapták, ahol TGS és a vírusgének elcsendesítése gyakran előforduló vírusfertőzésekkel szemben véd. A folyamat előnye, hogy az immunitás terjed a fertőzött sejtek felől a környezetében. Egy másik vizsgálatból kiderült, hogy egy állati vírus ugyancsak kódol egy RNS-interferencia (RNSi) szuppresszort, ami alátámasztja azt az elképzelést, hogy az RNSi-nek az állatok világában is lehet vírusellenes szerepe. A hengeresférgekben az RNSi-hez szükséges gének funkciójának elvesztése a csíravonalban többszörös transzponálható elemek aktiválódását eredményezi, amely azt jelzi, hogy e gének funkciója a transzpozonok következő generációk felé történő terjedésének meggátlása. Az RNSi anyagcsereút természetes funkciója a vírusokkal és transzpozonokkal szembeni védelem lehetett, de ez nem magyaráz meg minden, az RNSi jelenséggel kapcsolatban megfigyelt tulajdonságot. Az RNSi egyik legérdekesebb jellemzője a Caenorhabditis elegans esetében a szisztémás hatás. Ha csupasz dsrns-t injektálnak az állat egyik részébe, az máshol is befolyásolja a génexpressziót, és a táplálékkal felvett dsrns az ivarsejteken keresztül befolyásolja a következő generáció génexpresszióját is. Növényekben kimutatták, hogy az immunitás a szárszövetek mentén akár 30 cm-re is elvándorolhat, ami különösen ismétlődő vírusfertőzések esetén jelenthet előnyt. A szisztémás hatás nem minden esetben figyelhető meg (pl. Drosophila esetében sem). Lehet, hogy a C. elegans esetében az RNS-csendesítést a táplálékban levő dsrns is kiválthatja. Lehet, hogy a C. elegans a táplálékkal veszi fel a nukleinsavak előállításához szükséges prekurzorokat. Lehet, hogy a táp-

3 lálkozás által kiváltott RNSi esetében kétféle mechanizmus is szerepet játszik: az egyiknek természetes funkciója nukleinsavak felvétele a replikáció és transzkripció prekurzorainak biztosítására, a másik pedig vírustranszpozon pajzsként szolgálhat. A saját/idegen felismerő rendszer Tekintettel arra, hogy kapcsolat áll fenn a genom immunrendszere és az RNSi között, amelyet dsrns-ek váltanak ki, felmerül a kérdés, hogy a transzpozonok vagy vírusok hogyan váltják ki saját szekvenciájuknak megfelelő dsrns képződését. A C. elegans esetében legalább három, elfogadhatónak tűnő magyarázat van. Ha egy elem többször véletlenszerűen bemásolódott a genomba, a szegélyező promoterektől kiinduló teljes transzkripció RNSmásolatot képezhet mindkét szálról, és így létrejöhet a dsrns. Ennek valószínűsége megnő, ha nő az inzertált (beszúrt) részek száma, és ez a mechanizmus érzékelné a másolatok számát a véletlenszerű integrálódással együtt, vagyis a transzpozon terjedését a genomban. A második elképzelés szerint az RNSi által szabályozott gének a C. elegans-ban fordított ismétlődésű terminális szekvenciákkal rendelkeznek. Egyetlen másolat teljes átírása ezen inverz szekvenciák révén önmagára visszahajló dsrns-t eredményezhet. Ilyen szerkezeteket valóban meg is figyeltek a C. elegans esetében. Létezhet egyéb felismerési mechanizmus is, lehet pl., hogy minden jó génnek vannak közös szerkezeti részletei az mrns-ben. Az is lehet, hogy 3' és 5' végek között kölcsönhatás van, vagy protein faktorok kapcsolódnak hozzájuk. Elképzelhető, hogy az ilyen szerkezeti részletekkel nem rendelkező mrns-eket egy speciális mechanizmus dsrns-sé alakítja. Az a tény, hogy sok olyan mutáns C. elegans, amelyiknek hibás a transzpozon-csendesítési mechanizmusa, dsrns hozzáadása után hibátlan RNSi hatást mutat, arra utal, hogy az mrns dsrns-sé való átalakítását független tényezők határozzák Bizonyos meg. növényi mutánsok transzpozon-csendesítése hibás, míg a vírusok által kiváltott csendesítési mechanizmus érintetlen marad. Ezekben a mutáció az RNS-irányított RNS-polimerázban (RdR) van, amelynek szerepe valószínűleg az, hogy az idegen transzgén egyszálú RNS-ét (ssrns) átalakítsa kétszálúvá (dsrns). Lehet, hogy a vírusok esetében a nem saját jelleg egyszerűen a dsrns-hez kapcsolódik, míg transzgének esetében a nem saját jelleg valami olyasmi lehet, amit az RdR ismer fel, amely átalakítja az egyszálú RNS-t kétszálúvá. Amplifikáció (erősítés) A C. elegans-ban egy kis mennyiségű dsrns képes nagy fölöslegben levő mrns-t elcsendesíteni. Erre legalább háromféle mechanizmust javasoltak:

4 1. a daraboló enzim (1. ábra) a hosszú dsrns molekulát rövid primer sirns darabokká (rövid interferáló RNS-sé) alakítja. Mivel mindegyik sirns darab potenciálisan célba vehet egy homológ mrns-t, ez olyan amplifikációs faktort jelent, ami a primer sirns mértétől függ, de könynyen lehet szoros. 2. Lehetséges olyan katalitikus mechanizmus, amelyben az sirns-ek mennyisége megtöbbszöröződik, ez tovább növeli az amplifikációs faktort. 3. A rövid RNS-ek primerként szolgálhatnak a cél-mrns-en és a továbbiakban másodlagos sirns-ek képződéséhez vezethetnek, vagyis kiváltanak egy RNS-vezérelt RNS-polimerizációs reakciót (1. ábra). exogén dsrns vírus dsrns transzpozon dsrns(?) RdR általi RNS szintézis aberrált ssrns dsrna daraboló enzim sirns duplex aktív sirns komplex mrns célfelismerés RISC RdR általi RNS-szintézis a daraboló enzim által létrehozott másodlagos sirns-ek exonukleázok által feldarabolt RNS célmolekula feldarabolása endonukleáz enzimmel 1. ábra Az RNS-csendesítés molekuláris mechanizmusának modellje

5 Célmolekulától függő amplifikáció A reakció első lépésében az mrns-t a primer sirns ismeri fel. Az események további sora a feltételezések szerint a következő: a dsrns rövid sirns-ekké darabolódik, ezek feltételezhetően dsrns-ből ssrns-sé alakulnak, és ezután kétféle dolog történhet. Ezek az sirns-ek (amelyek feltehetően proteinekhez kapcsolódnak) magukban nem stabilisak, degradálódnak, hacsak fel nem ismernek egy homológ cél-mrns-t a sejtben és ahhoz nem kapcsolódnak a megfelelő bázispárok mentén. Erre a mechanizmusra a C. elegans esetében három bizonyítékot is találtak: 1. egy marker gén (zöld fluoreszcens protein (GF)) ellen irányuló RNSi hatására in vivo körülmények között nem keletkezik mérhető mennyiségű sirns, hacsak a GF gén nem expresszálódik a célszövetben; 2. in vivo csak az sirns-ek antiszensz szála látható, a szensz szál nem; 3. a hibás RNSi-t mutató mutánsokban in vivo nem mutatható ki stabil sirns szint, pedig a daraboló enzim működése in vitro könnyen kimutatható durva sejtextraktumok segítségével. Úgy tűnik, hogy ezek a mutánsok képesek annyi sirns-t előállítani, mint a vad típusok, de nem tudják stabilizálni őket, valószínűleg azért, mert nem jutnak el addig, hogy az sirns-ek a bázispárok mentén kötődjenek a célmolekulákhoz. Ez a stabilizáció magyarázná a gyors, specificitás szerinti szűrést. Ha bármilyen okból dsrns-ek képződnek, de nincs olyan mrns, amelyet elcsendesíthetnének, a reakció önmagától elhal, mivel a sirns nem stabilizálódik. Ha viszont van ezeknek a sirns-eknek megfelelő cél-rns, akkor a reakció tovább folytatódik. A második lépésben, miután az antiszensz sirns a bázispárok mentén csatlakozott a cél-mrns-hez, a célmolekula által vezérelt amplifikációra kerül sor. Férgek és növények esetében egy gén közepén levő szekvenciának megfelelő dsrns által kiváltott RNSi olyan sirns-ek szintézisét eredményezi, amelyben a céltartományhoz közeli régiók is benne vannak. A férgek esetében ez a jelenség polaritást mutat (csak 5' szekunder sirns-eket találtak) és nyilvánvalóan függ a távolságtól. Ez a tranzitív hatás nem terjed túl néhány száz bázispáron. Valószínű, hogy sok, az eredeti dsrns által lefedett tartományból származó sirns (amelyeket primer sirns-nek neveznek) valójában ugyancsak szekunder, és a régión belüli rövid lánchosszabbítási reakciók eredménye. A tranzitív RNSi másik bizonyítéka, hogy egy (transzgénikus) génfúzió ellen irányuló RNSi egy 3' doménből beléphet egy 5' doménbe, és ezáltal hatással lehet egy nem kapcsolódó, nem fuzionált génre is, amely az 5' doménhez tartozik. Végül meg kell jegyezni, hogy hatékony RNSi váltható ki rövid antiszensz RNS-ek injektálásával, amennyiben találnak olyan célmrns-t, amelyhez közvetlenül kapcsolódni tudnak.

6 Az amplifikációhoz szükséges polimeráz valószínűleg a különböző szövetekben eltérő. A C. elegans csíravonalában az ego-1 gén vesz részt az RNSi jelenségben, amely a paradicsomból korábban izolált RdR -t kódoló szakasszal homológ szekvenciákat tartalmaz.a C. elegans testi sejtjeiben azonban egy másik RdR homológ szerepel, az rrf-1. Az rrf-1 gén mutációja az RNSi megszűnését okozza, és jelentősen csökken az sirns-ek mennyisége. Egy másik RdR homológ (rrf-3) dezaktiválódása azonban pont ellentétes hatású: erősödik az RNSi. Lehet, hogy az rrf-3 gén terméke kevésbé aktív, és a megfelelő komplexben verseng az RRF-1-gyel. A Dyctostelium esetében három RdR homológot írtak le, amelyek közül egynek (rrpa) az elvesztése az RNSi megszűnéséhez és az sirns-ek eltűnéséhez vezet. Fontos különbség a C. elegans és a növények (pl. Nicotiana bethamiana vagy Arabidopsis thaliana) RNSi jelensége között, hogy a növények esetében a tranzitív hatás 5' és 3' irányban is érvényesül, ezért találunk szekunder sirns-eket a célterülethez képest 3' és 5' irányban is. A növényeknél az sirns-ek odairányíthatnak egy RdR-t az mrns-hez, amely kiváltja az egész RNS molekula RdR aktivitását. Más esetben a kezdeti reakció polaritást mutat, de gyakori templátváltások következnek be. A sirns stabilizáció és a tranzitív RNSi kombinációja egyfajta láncreakciót vált ki, amelynek során sok replikációs ciklus lép fel, ezt követően darabolódás, új primerezés, és egy újabb amplifikációs ciklusra kerülhet sor (1. ábra). Következtetések A faj legérzékenyebb részét, a genetikai kódot védelmező mechanizmusok megértése még csak épp hogy elkezdődött. A gerincesek immunrendszeréhez hasonló módon ez a molekuláris gépezet is felismeri a molekuláris parazitákat, kezdeti választ produkál, majd stabilizálja és felerősíti ezt a választ. Tekintettel arra, hogy az RNSi csendesítési mechanizmus részei igen jól konzerválódtak, ez a genetikai védőmechanizmus meglehetősen általános lehet, bár a részletek különbözhetnek. Az is lehetséges, hogy az RNSi csendesítés tulajdonképpen mechanizmusok egész családját takarja, amelyek mind kontextusok, mind részleteik tekintetében teljesen eltérőek lehetnek. Ahogyan az immunológiai ismeretek gyarapodása elvezetett a (kísérleti) immunterápiához, a géncsendesítés jelenségének jobb megértése is nagy lehetőségeket tartogat az irányított géncsendesítés révén mind a kísérleti biológia, mind a betegségek gyógyítása területén. (Bánhegyiné Dr. Tóth Ágnes) lasterk, R. H. A.: RNA silencing: the genome's immune system. = Science, 296. k sz máj. 17. p Randerson, J.: Fewer genes, better health. = New Scientist, 175. k sz júl. 13. p. 19.