SZENT ISTVÁN EGYETEM TRICHOTECÉNVÁZAS MIKOTOXINOK HATÁSA A GLUTATION REDOX RENDSZER SZABÁLYOZÁSÁRA. Doktori értekezés.

Átírás

1

2 SZENT ISTVÁN EGYETEM TRICHOTECÉNVÁZAS MIKOTOXINOK HATÁSA A GLUTATION REDOX RENDSZER SZABÁLYOZÁSÁRA Doktori értekezés Pelyhe Csill Gödöllő 2017

3 A doktori iskol megnevezése: Állttenyésztés-tudományi Doktori Iskol tudományág: Mezőgzdság-tudomány vezetője: Dr. Mézes Miklós egyetemi tnár, z MTA rendes tgj Szent István Egyetem, Mezőgzdság- és Környezettudományi Kr, Állttudományi Alpok Intézet, Tkrmányozástni Tnszék Témvezető: Dr. Mézes Miklós egyetemi tnár, z MTA rendes tgj Szent István Egyetem, Mezőgzdság- és Környezettudományi Kr, Állttudományi Alpok Intézet, Tkrmányozástni Tnszék Dr. Kovács Blázs tudományos főmunktárs, PhD Szent István Egyetem, Mezőgzdság- és Környezettudományi Kr, Akvkultúr és Környezetiztonsági Intézet, Hlgzdálkodási Tnszék. A progrmvezető jóváhgyás. A témvezető jóváhgyás. A társ-témvezető jóváhgyás

4

5 Trtlomjegyzék Trtlomjegyzék... I Rövidítések jegyzéke... IV 1 BEVEZETÉS ÉS PROBLÉMAFELVETÉS CÉLKITŰZÉSEK SZAKIRODALMI ÁTTEKINTÉS A trichotecénvázs mikotoxinok áltlános jellemzői A T-2 toxin és DON toxikokinetiki jellemzői A T-2 toxin és DON htási z állti szervezetre (toxikodinámii jellemzők) A T-2 toxin és DON kpcsolt ROS képzés indukciójávl és z oxidtív stresszel Az oxidtív stressz kilkulás, efolyásolás, htás és molekuláris jellemzői Az lcsony szintű oxidtív stressz áltl kiváltott sejtszintű válszrekciók A közepesen mgs szintű oxidtív stressz áltl kiváltott sejtszintű válszrekciók A mgs szintű oxidtív stressz áltl kiváltott sejtszintű válszrekciók Mikotoxinok htás z Nrf2-ARE útvonlon A szervezet ntioxidáns rendszerének emuttás A iológii ntioxidáns rendszer Az első védelmi vonl A második védelmi vonl A hrmdik védelmi vonl A szelenoproteinek molekuláris iológii jellemzői A GPx enzim cslád ANYAG ÉS MÓDSZER Mikotoxinok termeltetése és kísérletesen szennyezett tkrmányok elkészítése Mikotoxinok termeltetése A tkrmányok kísérletes mikotoxin szennyezése A tkrmányok mikotoxin trtlmánk meghtározás és nnk módszere Kísérleti álltok/kísérleti protokollok A vizsgált helyszíne Kísérleti álltok és trtásuk pontyok Kísérleti álltok és trtásuk rojlercsirkék Mintvételezés... 32

6 4.3.1 Pontyokkl végzett vizsgáltok Brojlercsirkékkel végzett vizsgáltok Biokémii módszerek A lipidperoxidációs mrkerek mérési módszerei A konjugált dién és -trién trtlom meghtározás A mlondildehid koncentráció mérése A gluttion redox rendszer tgjink mérési módszerei Redukált gluttion koncentráció meghtározás A gluttion-peroxidáz ktivitás meghtározás A fehérjekoncentráció mérése Génexpressziós vizsgáltok RNS tisztítás és reverz trnszkripció PCR Rel-time PCR vizsgáltok pontyn Rel-time PCR vizsgáltok házityúkn Rel-time PCR eredmények kiértékelése Sttisztiki értékelés EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉS Pontyokkl végzett kísérlet eredményei A pontyokkl végzett kísérleten megállpított trnzitidő Rövidtávú T-2 toxin terhelés htás pontyokr Rövidtávú T-2 toxin terhelés htás mortlitásr Rövidtávú T-2 toxin terhelés htás lipidperoxidációs prméterekre májn Rövidtávú T-2 toxin terhelés htás gluttion redox rendszer prméterekre májn Rövidtávú T-2 toxin terhelés htás gluttion redox rendszer szályozásár Megeszélés Rövidtávú DON terhelés htás pontyokr Rövidtávú DON terhelés htás mortlitásr Rövidtávú DON terhelés htás lipidperoxidációs prméterekre májn Rövidtávú DON terhelés htás gluttion redox prméterekre májn Rövidtávú DON terhelés htás gluttion redox rendszer szályozásár Megeszélés Eltérő életkorú rojlercsirkékkel végzett kísérletek eredményei Eltérő életkorú rojlercsirkékkel végzett kísérleten megállpított trnzitidő... 65

7 5.2.2 Eltérő életkorú rojlercsirkékkel végzett kísérletek során megállpított tkrmányfelvétel Rövidtávú T-2 toxin terhelés htás 1 hetes rojlercsirkékre Rövidtávú T-2 toxin terhelés htás lipidperoxidációs prméterekre májn Rövidtávú T-2 toxin terhelés htás gluttion redox prméterekre májn Rövidtávú T-2 toxin terhelés htás gluttion redox rendszer szályozásár Megeszélés Rövidtávú DON terhelés htás z 1 hetes rojlercsirkékre Rövidtávú DON terhelés htás lipidperoxidációs prméterekre májn Rövidtávú DON terhelés htás gluttion redox prméterekre májn Rövidtávú DON terhelés htás gluttion redox rendszer szályozásár májn Megeszélés Rövidtávú T-2 toxin terhelés htás 3 hetes rojlercsirkékre Rövidtávú T-2 toxin terhelés htás lipidperoxidációs prméterekre májn Rövidtávú T-2 toxin terhelés htás gluttion redox prméterekre májn Rövidtávú T-2 toxin terhelés htás gluttion redox rendszer szályozásár Megeszélés Rövidtávú DON terhelés htás 3 hetes rojlercsirkéken Rövidtávú DON terhelés htás lipidperoxidációs prméterekre májn Rövidtávú DON terhelés htás gluttion redox prméterekre májn Rövidtávú DON terhelés htás gluttion redox rendszer szályozásár Megeszélés ÖSSZEFOGLALÓ KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK Következtetések Jvsltok ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁS SUMMARY M1 IRODALOMJEGYZÉK... i

8 Rövidítések jegyzéke β-trcp β -trnsducin repet contining protein 3'-OH-T-2 3'-hidroxi-T-2 toxin AIF Apoptózis indukáló fktor AKT Protein kináz B ALP Alklikus foszftáz ALT Alnin-minotrnszferáz ANOVA Vrinci nlízis - Anlysis of vrince ARE Antioxidáns válszelem Antioxidnt Response Element AST Aszprtát-minotrnszferáz Bc β-ktin BTB Brod komplex - Brod complex, Trmtrck nd Bric--rc CAT Ktláz CBP CREB-kötő fehérje - CREB-inding protein CTR Kroxil-terminális régió CD Konjugált diének cdns Komplementer DNS cgpx4 Citoszol gluttion-peroxidáz4 Cry Kriptokróm gén CsMBE CNC-sMf-kötő elem CT Konjugált triének Ct Küszö ciklus CYP1A4 Citokróm P450 1A4 CYP1A5 Citokróm P450 1A CYP450 2F2 Citokróm P450 2F2 Cys Cisztein D3G Deoxinivlenol-3-β-D-glükozid DAS Dicetoxiszcirpenol DGR Kettős glicin ismétlődő domén - Doule glycine repet domin DHA Dokozhexénsv DLGex Extended DLG tripeptide DNS Dezoxirionukleinsv DOM-1 Deepoxi DON DON Deoxinivlenol DON-3-GlcA Deoxinivlenol-3- glükuronid EGF Epidermális növekedési fktor EPA Eikozpenténsv EpRE Elektrofíl Válszelem - Electrophil Response Element GAPDH Glicerinldehid-3-foszfát dehidrogenáz GCL γ-glutmil-cisztein ligáz GCS γ-glutmil-cisztein-szintetáz Gpx Gluttion-peroxidáz GSR Gluttion reduktáz GSS Gluttion-szintetáz vgy szintáz GSH Redukált gluttion GSSG Gluttion-diszulfid GSK3 Glikogen-szintetáz-kináz 3 GST Gluttion S-trnszferáz HSP Hősokk fehérjék Hetshock proteins IL-10 Interleukin 10 IVR Közeeső régió - Intervening region Kep1 (inrf2) Kelch-like ECH-ssocited protein 1 LC 50 Medián letális koncentráció - Medin lethl concentrtion LcPUFA Hosszú szénláncú töszörösen telítetlen zsírsvk - Long chin polyunsturted ftty cids LD 50 Medián letális dózis - Medin lethl dose LOX Lipoxigenáz MDA Mlondildehid MGB- NFQ Minor Groove Binder - nonfluorescent quencher mgpx4 Mitokondriális gluttion-peroxidáz4 mrns Hírvívő RNS - Messenger RNS NÉBIH Nemzeti Élelmiszerlánc-iztonsági Hivtl Neh Nrf2 ECH homology

9 NEO neoszolniol - Neosolniol ngpx4 Nukleáris gluttion-peroxidáz4 Niv Nivlenol NMD kori stop kodon áltl okozott mrns-leomlás - Nonsense medited decy Nrf2 Nucler fctor E2-relted fctor 2 PCR Polimeráz-láncrekció Per Period gének PHGPx Foszfolipid-hidroperoxid gluttion-peroxidáz (=Gpx4) PI3K Foszftidil inozitol 3 kináz PUFA Töszörösen telítetlen zsírsvk - Polyunsturted ftty cids qpcr Rel-time PCR RNS Rionukleinsv ROS Rektív oxigén szdgyökök RQ Reltív kvntifikáció SCN Szuprchismtikus mg - Suprchismtikus nucleus Se Szelén Sec Szelenocisztein SECIS Selenocysteine insertion sequence SMCP Spermium mitokondriumhoz kpcsolódó ciszteinen gzdg fehérje Sperm mitochondrion-ssocited cysteine-rich protein SOD Szuperoxid dizmutáz TNF-α Tumor nekrózis fktor lf trns Trnszfer RNS TTFL Trnscripciós/trnszlációs szályzók - Trnscriptionl-trnsltionl feedck loop UTR Nem trnszlálódó régió - Untrnslted region

10

11 1 BEVEZETÉS ÉS PROBLÉMAFELVETÉS A tkrmányozás elsődleges célj, hogy kiegyensúlyozott táplálónyg ellátottságot iztosítson z álltok számár, így megfelelő lpot szolgáltsson z életfenntrtáshoz, növekedéshez és szporodáshoz. A gonfélék monogsztrikus gzdsági álltink legfő, kérődző álltinknk pedig fontos tkrmány lpnygi, melyekkel zonn toxikus nygok is kerülhetnek tkrmányok. A trichotecénvázs mikotoxinok Fusrium penészgom fjok másodlgos nygcsere termékei. Gzdsági jelentőségük és gykorlti előfordulásuk lpján ennek mikotoxin csládnk legngyo jelentőségű tgji deoxinivlenol (DON) és T-2 toxin, vlmint zok toxikus metolitji. Toxikus htásikról már számos ismerettel rendelkezünk, melyek z egyes iológii folymtok, vlmint z zokt szályozó mechnizmusok prmétereien ekövetkező változásokon lpulnk, ezek jelentős része zonn vgy in vitro modellekkel végzett vizsgáltokon, vgy in vivo, de áltlán szuletális, hosszn trtó mikotoxin terhelések eredményein lpulnk. A T-2 toxin és DON htásivl, ezen elül kiemelten szdgyök képződéssel járó folymtokr, vlmint szervezet ntioxidáns védőrendszerére gykorolt htásik mechnizmusávl kpcsoltn még számos kérdés vár megválszolásr. A hosszn trtó mikotoxin terhelést követően mért iokémii változások csk egy folymt végső állpotát jelzik, melynek során egyre fokozódó mértékű károsodás, vgy dptáció egyránt előfordulht. Fontos kérdés, hogy T-2 és DON mikotoxinok tkrmányokkl történt felvételét követően mennyi idővel váltnk ki toxikus htásokt. Ezen elül milyen mértéken indukálnk oxidtív stresszt, illetve z ntioxidáns rendszer iokémii és molekuláris mrkerei milyen sorrenden és mértéken indukálódnk. Egyértelmű válsz jelenleg még nem dhtó ezekre kérdésekre. Ezen túlmenően, mikotoxinok, így T-2 toxin és DON hlk, illetve mdrk szervezetére kifejtett rövidtávú htási jelenleg még csk kevésé ismertek, így kísérleteimhez modell szervezetként gzdsági szempontól fontos ponty és házityúk fjokt válsztottm. Az áltlm elvégzett vizsgáltsorozt célj fentiek lpján nnk feltárás volt, hogy eltérő mértékű per os mikotoxin terhelés során lipidperoxidáció és z ntioxidáns védőrendszer egyes tgji, vlmint xenoiotikum trnszformáló rendszer milyen mértéken, és kiemelten milyen egymást követő lépések során, ktiválódik, vgy merül ki. Ezeket folymtokt enzim/fehérje, illetve génexpressziós szinten is vizsgáltm pontyok és rojlercsirkék szervezetéen rövidtávú mikotoxin terhelés során. 1

12 2 CÉLKITŰZÉSEK 1. Vizsgáltim fő célkitűzése z volt, hogy megvizsgáljm egyes trichotecénvázs mikotoxinok (T-2 toxin és DON) htását lipidperoxidációs folymtokr, vlmint gluttion redox rendszer egyes elemeinek változásár, vlmint zok szályozásár terhelést követő első 24 órán két eltérő élettni sjátosságokkl rendelkező álltfjn, pontyn és rojlercsirkéen. 2. A rojlercsirkékkel végzett vizsgáltok esetéen továi célom volt felmérni z áltlm vizsgált prméterek változásink életkorrl összefüggő eltéréseit zonos mértékű mikotoxin terhelés mellett. 3. Célom volt felmérni tkrmányrészek áthldásánk trnzit idejét élcstornán, mely efolyásolj mikotoxinok élcstornáól vló felszívódásár rendelkezésre álló időtrtmot, ennek lpján pedig összefüggéseket keresni z áltlm vizsgált prméterek értékeien észlelt változások és mikotoxinok felszívódását követő idő között. 4. A vizsgáltok eredményei lpján továi célom volt nnk felmérése, hogy z áltlm vizsgált mikotoxinok htásár májn keletkező rektív oxigén gyökök szennyezett tkrmány felvételét követően előidéznek-e lipidperoxidációs folymtokt, illetve ezek htásár milyen időintervllumn és milyen sorrenden ktiválódnk gluttion redox rendszer egyes elemei mrns és fehérje/tripeptid szinten. A fenti célok eléréséhez z lái kísérleteket állítottm e, és prméterek vizsgáltát végeztem el: I. Egyszeri, szuletális T-2 toxin vgy DON rövidtávú (24 órás) htásánk felmérése egynyrs pontyok máján: ) lipidperoxidációs folymtok esetén z iniciációs szksz mrkereinek (konjugált diének (CD) és konjugált triének (CT)), vlmint terminációs szksz metstil végtermékének (mlondildehid (MDA)) mennyiségére; ) iológii ntioxidáns rendszer működését jelző prméterek változásár (gluttion-peroxidáz (GPx) ktivitás, redukált gluttion (GSH) trtlom), c) továá, foszfolipid-hidroperoxid gluttion-peroxidázt kódoló gének (gluttion-peroxidáz 4 és (Gpx4 és Gpx4)), vlmit Kep1/Nrf2-ARE (kelch-like ECH-ssocited protein 1/ nucler fctor E2-relted fctor 2/ntioxidáns válszelem) útvonl trnszkripciós fktorit kódoló egyes gének (Kep1, Nrf2) expressziós változásir. II. Rövidtávú (24 órás), szuletális T-2 toxin vgy DON htásánk felmérése eltérő életkorú (1 és 3 hetes) rojlercsirkék máján: ) lipidperoxidációs folymtok esetén z iniciációs szksz mrkereinek (CD és CT), vlmint terminációs szksz metstil végtermékének (MDA) mennyiségére; ) iológii ntioxidáns rendszer működését jelző prméterek változásár (GPx ktivitás, GSH trtlom), c) vlmint gluttion redox rendszer egyes elemeit kódoló gének (gluttion-peroxidáz 4 (Gpx4), gluttion-szintetáz (Gss), gluttion-reduktáz (Gsr)) expressziós változásir 2

13 3 SZAKIRODALMI ÁTTEKINTÉS 3.1 A trichotecénvázs mikotoxinok áltlános jellemzői A mikotoxinok egyes fonls gomák másodlgos metolizmus termékei (Berthiller et l., 2013), melyek tkrmányokt, ezen elül különösen gonféléket (Selm és Gülden 2008), szennyezik. Ezáltl gzdsági álltoknál dózisfüggő mértéken termeléskiesést, illetve toxikus válszrekciót váltnk ki (Diz 2005). Jellemzően hőstil vegyületek, tehát hgyományos tkrmányipri műveletek során lklmzott kezeléseknek ellenállnk (Szigeti 1997). A trichotecénvázs mikotoxinokt termelő Fusrium penészek áltlán hűvös és párás környezeten (Wood 1992), jelenlévő oxigén mennyiségétől, illetve gonán jelenlévő szusztrátoktól (pl. keményítő) függően (Kovács 2010), számos, eltérő kémii struktúrávl rendelkező trichotecénvázs vegyületet termelhetnek. Az egyes Fusrium fjok/törzsek mikotoxin termelését, z htározz meg, hogy genetiki állományukn jelen vnnk-e, illetve izonyos külső környezeti htásokr ktiválódnk-e, z dott mikotoxinok termelésért felelős gének (Kimur et l., 2003). Ezek toxinogén fjok/törzs képesek mikotoxin-szintézisre (Desjrdins et l., 1993). A mikotoxinok, mint másodlgos nygcsere folymtok termékei nem esszenciálisk penészgomák növekedéséhez, zok termelődését jellemzően vlmilyen környezeti stresszhtás, pl. hőstressz, indukálj (Schmidt-Heydt et l., 2008). A trichotecénvázs mikotoxinokt négy ktegóriá sorolják kémii funkciós csoportjik szerinti hsonlóság lpján (1. tálázt) (McCormick et l., 2011). Az A típusú trichotecénvázs mikotoxinok közé trtozik T-2 toxin (legfontos termelő penészgom fjok: F. tricinctum, F. sporotrichioides, F. poe, F. grminerum), míg deoxinivlenol (DON) B típusú (legfontos termelő penészgom fjok: F. grminerum, F. culmorum) mikotoxin (Moss, 2002). A C, vlmint mkrociklusos D típusú trichotecénvázs mikotoxinok gzdsági szempontól kise jelentőségűek, és ezeket jellemzően más penészgom fjok termelik (pl. Stchyotris chrtrum, Stchyotrys lternns, Myrothecium verrucri, Myrothecium roridum) (Grove 1993). A mérsékelt éghjlti égöve trtozó országokn, így Mgyrországon is, DON leggykrn, és legngyo mennyiségen előforduló (Simsek et l., 2013), míg T-2 toxin leginká toxikusnk trtott trichothecénvázs mikotoxin (Bmurg et l., 1968). A T-2 toxin is gykori, viszont áltlán sokkl kise koncentráción vn jelen tkrmányokn (2. tálázt) (Biomin World Mycotoxin Survey 2015, Binder et l., 2007). 3

14 1. tálázt A trichothecénvázs mikotoxinok csoportosítás trichotecénvázhoz kpcsolódó funkciós csoportok elhelyezkedése lpján (McCormick et l., 2011 nyomán) Típus A B C D Mikotoxin T-2 toxin HT-2 toxin T-2 tetrol Neoszolniol (NEO) Dicetoxiszcirpenol (DAS) Trichodermol Trichodermin Izotrichodermol Klonektrin 7-8-dihidroxi-klonektrin Hrzinum A Deoxinivlenol (DON) Nivlenol (NIV) Fuzrenon-X Trichothecin Trichothecinol A Krotocin Bcchrin Roridin A Strtoxin H Verrucrin A A T-2 toxin és DON főképp gonféléken, vlmint ezek feldolgozott termékeien (mlát, sör, kenyér st.) fordulnk elő (Selm és Gülden 2008). Annk ellenére, hogy ezek mikotoxinok ngy gykorisággl, és esetenként ngy mennyiségen fordulnk elő gonmgvkn, trichotecénvázs mikotoxinokr vontkozón z Európi Unió tkrmány lpnygokn és teljesértékű keveréktkrmányokn csk jvsolt htárértéket htározott meg. A teljesértékű keveréktkrmányok esetéen ez 0,25 mg T-2 és HT- 2 toxin/kg és 5 mg/kg DON (2. tálázt) (Europen Commission 2013, Biomin World Mycotoxin Survey 2015). 2. tálázt A szennyezések gykoriság és mértéke legfontos mikotoxinok esetén Európ (Biomin World Mycotoxin Survey 2015 lpján) AFB1: fltoxin B1; ZEN: zerlenon; DON: deoxinivlenol; T-2: T-2 toxin FUM: fumonizin; OTA: ochrtoxin A AFB1 ZEN DON T-2 FUM OTA Vizsgált minták szám (d) Szennyezett minták rány (%) A szennyezések mértékének átlg (μg/kg) A szennyezések mximum értéke (μg/kg) EU jvsolt htárérték teljes értékű tkrmányokn (μg/kg)

15 3.1.1 A T-2 toxin és DON toxikokinetiki jellemzői A gzdsági álltok jellemzően per os, tkrmánnyl, veszik fel mikotoxinokt, ugynkkor már őrrel vló érintkezés révén is felmródásokt és lokális gyulldást indukálhtnk (dermtotoxikus htás), mely elsősorn száj környékét, száj nyálkhártyáját és gszrointesztinális rendszert érinti (Nesic et l., 2014). A mikotoxinokt trtlmzó por elégzése révén zonn z álltok tüdejéen is kilkulht gyulldás (Wong et l., 2016). Ez viszont nehezen különíthető el elélegzett fiziki részecskék penészgom trtlmától, zok micélium áltl előidézett gyulldásos folymtoktól (Puly et l., 2011). A T-2 toxin, mint lipofil krkterű molekul, könnyen átjut memránokon (Gyongyossy-Iss et l., 1984). A gyomoról csk kismértéken (Ellison és Kotsonis, 1974; Besley et l., 1986), vékonyélől viszont rövid idő ltt és htékonyn felszívódik. Sertéseken például kimuttták, hogy tkrmányfelvételt követően kevese, mint 20 perc múlv már kimutthtó mennyiségen volt jelen véren (Eriksen és Petterson, 2004). Vemhes emlősálltoknál plcentán is átjutht úgy T-2, vgy nnk ktív metolitj HT-2 toxin is (Wng et l., 2014). A DON kevésé hidrofó krktere mitt elsősorn prcelluláris útvonlon ( sejtközötti téren át) és psszív trnszport révén szívódik fel vékonyélől (Sergent et l., 2006), tkrmányfelvételt követően zonn már perccel kimutthtó volt véről (Eriksen és Petterson, 2004). A DON iológii felezési ideje rövid, sertésen mindössze 4 ór (Prelusky et l., 1988). A T-2 toxin iológii felezési-ideje még kevese, átlgosn 20 perc, zonn nnk 80%- HT-2 toxinná lkul, mi hsonló toxicitású (SCF, 1999). Brojlercsirkékkel végzett vizsgáltokn megállpították, hogy tkrmánnyl felvett T-2 és HT-2 toxin élcstornáól gyorsn felszívódik, mjd elsősorn májn metolizálódik, és órán elül xenoiotikum trnszformáló rendszer gykorltilg teljes mértéken eliminálj (Rizzo et l., 1994). A T-2 toxint fázis I. enzimek (rektív és poláros ktív csoportokkl rendelkező enzimek; pl citokróm P450 enzim cslád) kevésé hidrofó krkterű molekulává lkítják redukció, oxidáció, hidrolízís, hidroxiláció, és egyé detoxifikációs folymtok során (Wu et.l, 2010). A T-2 toxin, de főképp DON, metolizmus, elsősorn de-epoxidációj, már élcstornán megkezdődhet egyes mikroiális enzimek htásár (Swnson et l, 1988). A DON-t de-epoxi DON-ná (DOM-1) T-2 toxint pedig egyé deepoxi-metolitokká lkítják (Young et l., 2007). A mikroiális de-epoxidáció htékonyság zonn z egyes álltfjok között jelentősen eltérő, így például különöző hlfjok közül egyedül rn törpehrcs (Ameriurus neulosus) élcstornájáól izolált mikroiális közösség volt képes DON-t átlkítni DOM-1-é (Gun et l., 2009). A hlfjok mellett egyé álltfjok között is ngyfokú eltérések lehetnek (Horvth és Vrg, 1961; Anter et l., 2016) T-2 toxin és DON élcstornán lezjló detoxifikációjávl kpcsoltn. Ptkányokkl és csirkékkel végzett vizsgáltokn, DOM-1 mellett, egyé DON metolitokt is tláltk (Wn et l., 2014), így például DON-10-szulfonátot, DON-3- glükoronidot, DON-3-szulfátot, és DOM-1-10-szulfonátot is. A DON-10-szulfonát és DOM-1-10-szulfonát metolitokt zonn csk ptkányn, míg DON-3-szulfátot csupán csirkéken lehetett kimuttni (Wu et l., 2011). Brojlercsirkék esetéen T-2 toxin fő metolikus útvonl hidrolízis, melyet, elsősorn májn, fázis II. enzimek (ioszintetikus konjugációt végző enzimek) ktlizálnk. A trichotecének fő metolikus útvonl de-epoxidáció és decetiláció. A folymt eredményeképpen T-2 toxin fő metolitji HT-2, T-2 triol, T-2 tetrnol, 3-hidroxi T-2 és 3-hidroxi HT-2, míg DON fő metolitji DOM-1 és deepoxi-nivlenol (Wu et l., 2010). 5

16 Pontyoknál metolitok között HT-2 toxin kimutthtósági htárérték ltt volt máj mikroszómákn, ugynkkor jelentős mennyiségen tláltk 3 -OH-T-2 toxint. Ezen eredmények lpján rr lehet következtetni, hogy hlk xenoiotikum trnszformáló folymti között hidrolízis nem tölt e olyn fontos szerepet, mint szárzföldi álltoknál, sőt pontynál egyé metolikus útvonlt is leírtk (Wu et l., 2014). A mikotoxinok fázis II enzimek (pl. gluttion-s-trnszferázok, GST) htásár konjugáció (gluttion-, glükoronsv- st.) révén részen z epével (Corley et l., 1985), részen élsárrl, vlmint vizelettel, illetve hlk és mdrk esetéen z ürülékkel ürülnek (Swnson és Corley, 1989). Szkirodlmi dtok szerint hlk szervezetéen trichotecénvázs mikotoxinok fő trnszformációs és konjugációs útvonli jellemzően eltérnek szárzföldi álltokétól (Wu et l., 2011; Mul et l., 2012; Uhlig et l., 2013). A penészgomávl fertőzött növényeken is végemegy xenoiotikum-trnszformáció, melynek eredményeként mikotoxinok egy része detoxifikálódik. Az állti szervezethez hsonlón, fázis II. enzimek segítségével, glükóz- vgy mlonsv-konjugáció következik e, mjd konjugátumokt vkuólumokn (sejten elül) vgy z poplszt (sejtközötti tér), trnszportálják. Ezáltl úgynevezett mszkolt mikotoxinokt (pl deoxynivlenol-3-β-dglükozid (D3G), T-2 toxin-glükozid) hozv létre. A növényi szöveteken elrktározott mszkolt mikotoxinokt viszont z álltok tkrmánnyl együtt felveszik és kötésekől élrendszer enzimjeinek htásár mikotoxinok részen felszdulnk mjd felszívódnk (Berthiller et l., 2013) A T-2 toxin és DON htási z állti szervezetre (toxikodinámii jellemzők) A trichotecénvázs mikotoxinok htásit számos tényező efolyásolj, így z dott állt fj, fjtáj, ivr, kor, tkrmányozási és egészségi állpot, trtási körülmények, továá mikotoxin típus, z expozíció ideje és egyidejűleg más (toxikus) nygok jelenléte (Anter et l., 2016). A különöző álltfjoknál jelentős különséget mutttk ki mikotoxinok felszívódásánk mértékéen, zok szervezeten elüli eloszlásán, metolizmusán és kiválsztásán is (Wu et l., 2011; Mul et l., 2012). A trichotecénvázs mikotoxinok tekintetéen gzdsági álltfjok érzékenysége lpján z lái rngsor állíthtó fel: sertés>romfifjok>kérődzők (Eriksen, 2003). A romfiféléken elül z érzékenységi rngsor: lúd>kcs>házityúk (Mézes et l., 1998). A T-2 toxin LD50 értéke 1 npos rojlercsirkénél 4,97 mg/kg testtömeg, míg ennek értéke T-2 toxin egyik fő metolitj, T-2 tetrol, esetéen már 33,79 mg/kg testtömeg. DON esetén z LD50 értéke rojlercsirkénél 140 mg/kg testtömeg (Huff et l., 1981). Hlknál DON-r és T-2 toxinr vontkozón szkirodlomn nem tlálhtó LD50 érték (Pietsch és Hirsch, 2015). Azonn T-2 toxin esetén egy hlfjr, szúnyogírtó fogspontyr (Gmusi ffinis) vontkozón tláltm dtot, hol LC50 értékként 147 μg/l koncentrációt dtk meg (McKen et l., 2006). A T-2 toxin és DON hlk szervezetére kifejtett htási jelenleg még kevésé ismertek. Az egyes hlfjokr vontkozón következő érzékenységi sorrendet állították fel: szivárványos pisztráng>ponty>hrcsfélék (Anter et l., 2016). Az egyes hlfjok közötti különségek z érzékenység tekintetéen ngymértékűek, mi főképp z dott mikotoxin típusától függ (Gun et l., 2009). A trichotecénvázs mikotoxinok gzdsági álltoknál áltlán csk szukrónikus és szukliniki tüneteket idéznek elő, így például növekedéseli lemrdást, tkrmány-visszutsítást, csökkent tkrmány-értékesülést és emitt csökkent termelést, növekvő mértékű mortlitást, illetve fokozott 6

17 érzékenységet fertőző etegségekkel szemen. Amennyien kliniki tünetek is megjelennek, zok hányásn, hsmenésen, ágydtságn, csökkent immunválsz készségen, rossz spermminőségen, lcsony keltethetőségen, és főképp hlknál, némi formáján nyilvánulnk meg (D Mello et l., 1999, Eriksen és Petterson, 2004; Mtejov et l., 2016). Ezen tünetek töségét hlknál (Anter et l., 2016) és romfi fjoknál egyránt megfigyelték (Sokolovic et l., 2008; Awd et l., 2013). Brojlercsirkéknél trichotecénvázs mikotoxinok főképp nem specifikus htásokt fejthetnek ki. Így például szkirodlomn genotoxikus, citotoxikus, immunmoduláns htásokt egyránt leírtk. Emellett zonn negtív htást gykorolnk z emésztőrendszerre, májr és z idegrendszerre, emitt csökkentik termelési prmétereket (Sokolovic et l., 2008). Hlknál ugynkkor mikotoxinok, így trichotecénvázs mikotoxinok, htásiról jelenleg még csk kevés dt áll rendelkezésre (Anter et l., 2016). Bromfiféléken T-2 toxikózis első tünetei csökkenő tkrmányfelvétel, emitt testtömeg gyrpodás és növekedési intenzitás csökkenése (Chi et l., 1978; Wytt et l., 1973; Hoerr, 2003). Tojótyúkoknál csökken tojástermelés (Tois et l., 1992), romlik tojáshéj minősége és keltethetőség mértéke (Chi et l., 1978; Wytt et l., 1973). Hlknál, így például zerdániónál (Dnio rerio), DON terhelés kétfázisú htást vált ki termékenyülésen. Alcsony dózisok mellett mérsékelten ugyn, de jvult termékenyülés, sőt még lárvák úszási ktivitásán is ngyo értékeket tpsztltk (Snden et l., 2012). Bromfi fjokhoz hsonlón különöző hlfjoknál is megfigyelték tkrmányfelvétel, testtömeg gyrpodás és növekedési intenzitás csökkenését mind T-2 toxin, mind pedig DON felvételét követően. Ilyen htást írtk le szivárványos pisztrángnál (Oncorhynchus mykiss) (Poston et l., 1983; Woodwrd et l., 1983; Hooft et l., 2011) és tlnti lzcnál (Slmo slr) (Döll et l., 2010), ponty esetéen viszont ezeket htásokt nem észlelték (Pietsch et l., 2014,). Egy közleményen zonn leírták, hogy T-2 toxinnl szennyezett tkrmánnyl szemen pontyok kise érdeklődést mutttk (Mtejov et l., 2016). Az egyes vizsgált hlfjok közül szivárványos pisztráng tűnik leginká érzékenynek DON iránt, mivel már 20 mg DON/kg tkrmány koncentráció esetén is teljes tkrmány-visszutsítást figyeltek meg (Woodwrd et l., 1983). Ugynkkor, 10 mg DON/kg tkrmány szennyezettségi szint mellett semmilyen htás nem volt megfigyelhető pettyes hrcs (Ictlurus puncttus) tkrmányfogysztásár, növekedésére, vérprmétereire és máj tömegére (Mnning et l., 2014). Eől is jól láthtó, hogy jelentős különségek vnnk z egyes hlfjok mikotoxinokkl szemeni érzékenységéen. A különöző mikotoxinok iránti érzékenységen fennálló különségeket jól jellemzi, hogy mennyien pettyes hrcsávl T-2 toxinnl szennyezett tkrmánnyl etettek 0,625-5 mg/kg tkrmány koncentráción, kkor nnk htásár dózisfüggő mértéken csökkent növekedés, sőt 2,5 mg T-2 toxin/kg tkrmány koncentráció felett már jelentősen nőtt mortlitás is (Mnning et l., 2003). Pontynál (Cyprinus crpio) is hsonló változásokt figyeltek meg z említett prmétereken 0,52 vgy 2,45 mg T-2 toxin/kg tkrmány etetésének htásár (Blogh et l., 2009). A trichotecénvázs mikotoxinok elsődleges htás, hogy z eukriót sejteken gátolják fehérjeés DNS szintézist (Holldy 1995). A fehérje szintézis gátlás rioszómák szintjén vlósul meg, hol nnk mindhárom fő szkszát (iniciáció, elongáció és termináció) gátolják (Cundliffe et l., 1974; Sokolovic et l., 2008). Az epoxi gyűrű ugynkkor szerkezeti felépítése mitt emellett 7

18 közvetlenül is képes kötődni fehérjékhez (Cundliffe et l., 1977; Awd et l., 2013) gátolv zok funkcióját. Fehérje szintézist gátló htásuk mitt vérképző és lymphoid szövetek különösen érzékenyek trichotecénvázs mikotoxinokr (Ueno et l., 1983). Ez háttere nnk, hogy T-2 toxin vgy DON jól ismert immundepresszív, illetve immunszupresszív vegyületek (Kidd et l., 1995). A htás zonn függ z lklmzott dózistól és z expozíció időtrtmától (Pestk et l., 2004, Awd et l., 2013), így például kis dózisn immunstimuláns htásukt is kimuttták, z immunrendszer egyes elemeinek génexpressziój és poszt-trnszlációs modifikációjánk indukálás révén (Dong et l., 1994; Wrner et l., 1994; Pestk et l., 2004). Annk ellenére, hogy z A típusú trichotecének jelentősen kise immunotoxicitássl írnk, mint B típusúk (Shrm, 1993), T-2 toxikózis során nekrózist és lymphoid sejt depléciót is leírtk rojlercsirkék thymusán, lépéen és nyirokcsomóin (Wytt et l., 1973; Boonchuvit et l., 1975, Hoerr, 2003). Emellett, Slmonell fertőzés esetén ngyo mértékű mortlitást is tpsztltk T-2 toxinnl szennyezett tkrmányt fogysztó rojlercsirkéknél (Hoerr et l., 1982, Ziprin és Elisslde 1990), vlmint lcsony ntitest titert htároztk meg Newcstle etegség és fertőző ursitis elleni vkcinázást követően (Kmlvenktesh et l., 2005, Girish és Devegowd, 2006; Weer et l., 2006). A DON toxikus htási közül ugynkkor z immuntoxicitást trtják legjelentősenek (Bondy és Pestk, 2000). Ezt támsztj lá, hogy DON terhelés esetén kcsáknál csökkent Burs Fricii mérete és degrdálódott nnk szöveti szerkezete is, mi kihtott z ntitest termelésre és etegségekkel szemeni ellenállóképességre is (Feinerg és Mclughlin, 1989; Dänicke et l., 2004; Kuen et l., 1985). Brojlercsirkéken DON htásár, T-2 toxinhoz hsonlón, csökkent fertőző ronchitis vírus és Newcstle etegség elleni vkcinázást követően mért ntitest titer és emitt vkcinázás htásfok (Dänicke et l., 2004; Hrvey et l., 1991; Dänicke et l., 2002). Hlknál, egy T-2 toxinnl végzett kísérleten, csökkent hemtokrit és hemogloin szinteket tláltk szivárványos pisztrángnál 2,5 mg T-2 toxin/kg tkrmány, vgy zt meghldó szennyezettségi szintek mellett (Poston 1983). Emellett pontyn is csökkent immunválszt és z immunrendszer sejtes elemeinek (fehérvérsejt, limfociták, neutrofil grnulociták) csökkent számát figyelték meg (Pietsch et l., 2014; Pietsch et l., 2015; Mtejov et l., 2016). In vitro kísérleteken trichotecénvázs mikotoxinokkl végzett kezelést követően egér mkrofág- és humán sejtvonlkn poptózist mutttk ki (Yng et l, 2000), csirke lymphocitákn pedig, T-2 toxin htásár, DNS károsodást tpsztltk (Sokolovic et l., 2007), továá poptózist figyeltek meg rojlercsirkék thymusán (Venktesh et l., 2005). DON htásár csökkent sejtosztódást, vlmint z immunrendszer sejtes elemeinek nekrózisát és poptózisát állpították meg (Pestk és Bondy, 1990; Pestk et l., 2004). A vérképzésre kifejtett negtív htásukt izonyítj, hogy mindkét trichotecénvázs mikotoxin indukálj hemtopoetikus progenitor sejtek poptózisát (Prent-Mssin 2004). A DON például közvetlenül indukálj T-sejtek, B-sejtek és z IgA+ sejtek (Pestk et l. 1994), vlmint mkrofágok progrmozott sejthlálát (Zhou és Pestk 2005). Az poptózis hátteréen fehérjeszintézis gátlás, vgy z oxidtív stressz indukciój mitt ekövetkező DNS-károsodás állht, mely egyúttl ktiválj mitokondriális poptótikus utkt (Zhung et l., 2013), ugynkkor csökkenti citokróm P450 és gluttion-s-trnszferáz enzimcslád tgjink ktivitását, zz mikotoxin detoxifikációját (Meissonnier et l. 2008). 8

19 A T-2 toxin és DON szerotoninerg, vlmint dopmin rendszer működésének megzvrásávl (Smith, 1992; Sokolovic et l., 2008), továá sejtek egyes jelátviteli útvonlink efolyásolásán keresztül neurotoxikus (Prelusky, 1994, Wng et l., 1998) és ezzel összefüggésen emetikus (Fiormonti et l., 1993) htást fejtenek ki. Brojlercsirkéken csökkent tkrmányfelvételt, vlmint mozgáskoordinációs zvrokt is megfigyeltek T-2 toxin htásár, neurotoxicitássl összefüggésen (Wytt et l., 1973, Wytt et l., 1973). A T-2 toxin és DON 12,13-epoxi gyűrűs szerkezete kémiilg különösen rektív, mely felelőssé tehető zok dermtotoxikus (Ueno, 1977) htásiért. Bromfi fjokn, szájüregen és csőrkáván, felmródásokt és nekrotikus léziókt figyeltek meg 1-5 mg T-2 toxin/kg tkrmány dózistrtományn, z etetés megkezdését követő egy héten elül (Chi et l., 1978; Brke et l., 2000). A T-2 toxin htásár emellett nekrotikus elhlásokt is megfigyeltek szájüregen, zúzógyomorn, él nyálkhártyáján és májn (Ademoyero és Hmilton 1989; Ademoyero és Hmilton 1991; Konjevic et l., 2004). Leírták emellett tollsodás zvrát is rojlercsirkéken ngymértékű T-2 toxin terhelés mellett (Wytt et l., 1973; Hoerr, 2003;). A DON is hsonló elhlásokt idézett elő nyálkhárty károsítás révén tojótyúkok zúzógyomrán (Lun et l., 1986) és vékonyeléen, (Dänicke et l., 2002). Szövettni vizsgáltokkl zt is megállpították, hogy DON rojlercsirkéken negtív htássl vn gsztrointesztinális rendszer nyálkhártyájár. Így például elhlásokt tláltk élolyhok kriptáin (Awd et l., 2004; Awd et l., 2006; Awd et l., 2011), vlmint károsítj z intesztinális epithel sejtek integritását, ennek révén csökkentve tight junction fehérjék hidrofil molekul-trnszportját (Awd et l., 2013). Szivárványos pisztrángn Hooft et l. (2011) szövettni elváltozásokt figyeltek meg májn és élen DON terhelés htásár, de hsonló nekrotikus elváltozásokt írtk le pontyok máján és egyé szöveteien is (Pietsch et l., 2014; Pietsch et l., 2015) Leírták továá, hogy in vitro modellen DON gátolj egyes hl eredetű sejtvonlk életképességét, csökkenti memránok integritását, vlmint mitokondriumok és lizoszómák ktivitását. Az egyes vizsgált sejtvonlk közül szivárványos pisztráng eredetűek muttták legngyo fokú érzékenységet DON iránt (Pietsch et l., 2011). Pontyól szármzó elsődleges heptocit sejtvonln szintén toxikus htásokt figyeltek meg már 0,5 μg DON/ml koncentrációnál, emellett tö mikotoxin együttes vizsgált során DON dditív htását is tpsztlták (He et l., 2010) A T-2 toxin és DON kpcsolt ROS képzés indukciójávl és z oxidtív stresszel A rektív oxigén szdgyökök (ROS) olyn gyökök vgy molekulák, melyek minden élő, ero, szervezeten megtlálhtók (Dickinson és Chng 2011). Közös jellemzőjük, hogy külső elektronhéjukon párosíttln elektront trtlmznk, ezáltl rektívk. Mivel vlmely más tomról vgy molekuláról vonnk el elektront, így továi gyökképzőzést indukálnk (Jco és Burri, 1996). A szervezeten fiziológiás körülmények között is folymtosn keletkeznek szdgyökök (Hlliwell, 1991; Murphy, 2009), melynek fiziológiás szinten trtását z ntioxidáns rendszer szályozz (Lien et l., 2008). Korán megállpítást nyert, hogy sejteken zjló iokémii változásokkl összefüggésen trichotecénvázs mikotoxinok hosszú távú htásár fokozódik z állti szervezeten lipidperoxidációs folymtok intenzitás, mely kiht iológii ntioxidáns rendszer működésére is (Mézes et l., 1998; Suri et l., 2002). A szkirodlomn jelentős számn írtk le összefüggést trichotecénvázs mikotoxinok és z zok htásár kilkuló oxidtív stressz között (Arunchlm és Doohn, 2013). 9

20 A trichotecénvázs mikotoxin-expozíció és ROS képződés összefüggésével kpcsoltn ugynkkor megoszlnk vélemények rról, hogy mikotoxinok közvetlenül, vgy közvetve, zz z ntioxidáns védőrendszer működésének efolyásolás révén idéznek-e elő oxidtív stresszt (Sudkin, 2003; Jossé et l., 2011; Mishr et l., 2014; Chndrtre et l., 2014; Wen et l., 2016). Egyes vizsgáltokn ugynis nem tláltk közvetlen ROS képződést indukáló htást, sőt egyes eseteken csökkenő mennyiségen tláltk ROS vegyületeket trichotecénvázs mikotoxinokkl összefüggésen (Pietsch et l., 2011; Bin-Umer et l., 2014). A trichotecénvázs mikotoxinok, szerkezetükől dódón, zz z epoxi csoport megléte mitt, rektívk, ezért képesek ROS képződést indukálni (Chndrtre et l., 2014). Emellett közvetett módon is indukálhtnk ROS képződést, zz oxidtív stresszt, így például xenoiotikumtrnszformáló rendszer (pl. citokróm P450 cslád) ktivációj (Wen et l., 2016), vgy z áltluk indukált gyulldásos folymtok (Filkow et l., 2007; Osselere et l., 2013; Wu et l., 2014) áltl. A gyulldásos folymtok immunrekciókt is indukálhtnk (Strsser et l., 2013; Pierron et l., 2016), mely szintén fokozhtj ROS képződést. A mikotoxinok emellett immunszuppresszív htássl is rendelkeznek, mely ez utói folymtokt efolyásolhtj (Kidd et l. 1995; Pestk et l., 2004). Brojlercsirkéknél számos dttl rendelkezünk trichotecénvázs mikotoxinokkl összefüggő lipidperoxidációs htásokról, de jellemzően szukrónikus expozíciót követően (Smith, 1992; Mézes et l., 1998; Mézes et l., 1999; Suri 2002; Weer et l., 2010). Így például rojlercsirkéken 1,5 mg/kg testtömeg dózisú T-2 toxin htásár emelkedett mlondildehid (MDA) trtlmt mértek májn 7 npos expozíciót követően (Lel et l., 1999). Ez rr utl, hogy lipidperoxidációs folymtok intenzitás nőtt. Dvorsk et l., (2007) szukrónikus terhelést követően szintén emelkedett MDA trtlmt tláltk májn, mely egyidejűleg z ntioxidáns védelmi rendszer csökkent mennyiségével/ktivitásávl is társult (Se, α-tokoferol, szkorinsv, krotinoidok és redukált gluttion (GSH) trtlom, gluttion-peroxidáz (GPx) ktivitás). Egy másik vizsgáltn, 6 hetes T-2 toxin-expozíciót követően, oxidtív károsodásokr utló változásokt észleltek egyes májkárosodást jelző mrkerek értékeien (Yng et l., 2016). Csirke heptocit eredetű sejtvonlkn, in vitro modellen, 24 órás T-2 toxin terhelést követően, viszont z ntioxidáns rendszer indukcióját tpsztlták. Így például nőtt egyes ntioxidáns enzimek, GPx, szuperoxid-dizmutáz (SOD) és ktláz (CAT) ktivitás, ugynkkor csökkent GSH, de nőtt z MDA trtlom (Yng et l., 2016). Egy másik, in vitro, vizsgáltn is kimuttták z oxidtív stressz jelenlétét, szintén csirke eredetű sejtvonlkn (Mu et l., 2013). A szkirodlomn ugynkkor kevés rövid távú, gzdsági álltokkl végzett, in vivo vizsgálti eredmény tlálhtó, de például egy T-2 toxinnl szennyezett tkrmányt fogysztó, rojlercsirkékkel végzett, 48 órás kísérleten megállpították, hogy már 12 órávl tkrmányfelvételt követően fokozódnk lipidperoxidációs folymtok és egyidejűleg nő z ntioxidáns rendszer ktivitás (Bócsi et l., 2015). Ezzel ellentéten, 17 npos expozíció után 10 mg T-2 toxin/kg tkrmány vgy 10 mg DON/kg tkrmány dózisok mellett nem tláltk eltéréseket lipidperoxidációs folymtokn, nnk ellenére, hogy DNS töredezettsége már kimutthtó volt (Frnkic et l., 2006). Ehhez hsonlón Rezr et l. (2007) sem tláltk oxidtív károsodásokt 17 np után 0,5-13,5 mg T-2 toxin /kg tkrmány dózisok mellett. DON esetéen is ismertek olyn vizsgáltok, melyek során DNS károsodást ugyn tpsztltk, de nem volt szignifikáns mértékű változás lipidperoxidációs folymtok intenzitásán (Awd et l., 2011). Egy hosszútávú (28 npos) T-2 toxinnl végzett 10

21 kísérleten rojlercsirkéknél szintén nem tpsztlták lipidperoxidációs folymtok intenzitásánk növekedését és z enzimtikus ntioxidáns rendszer is csk mérsékelten ktiválódott, nnk ellenére, hogy termelési prméterek dózis- és időfüggően romlottk (Blogh et l., 2015). Egy másik vizsgált során viszont rojlercsirkéken T-2 toxin expozíció htásár in vitro és in vivo modelleken egyránt leírták z ntioxidáns védelmi rendszer enzimtikus tgjink ktivitás növekedését, de emellett Gst, Sod, Ct és Gpx gének expressziójánk változását is tpsztlták (Yng et l., 2016). A T-2 toxin emellett indukált xenoiotikum trnszformáló rendszer elemeinek, így például CYP1A4 és CYP1A5 enzimek, ktivitását és génexpresszióját (Wu et l., 2014). Hlk ntioxidáns rendszerére és lipidperoxidációs folymtir vontkozón is kevés dt áll rendelkezésre mikotoxinok htásivl összefüggésen (Anter et l., 2016). Az elérhető dtok szintén jellemzően szukrónikus terheléses vizsgáltok. Így például 56 npon keresztül trtó DON terhelés htásár gluttion redox rendszer csökkent ktivitását tpsztlták 26. és z 56. np után (Pietsch és Burkhrdt-Holm, 2015). Emellett, zonos terhelési protokoll mellett, fokozott lipidperoxidációt is megfigyeltek pontyok máján és veséjéen (Pietsch et l., 2014). Egy másik vizsgáltn (Snden et l., 2012) DON kezelést követően nőtt Cyp1 mrns szintje zerdánió máján, vlmint Cu-Zn Sod és Cyclin G1 gének koncentrációfüggő trnszkripciós változását is megfigyelték. A T-2 toxin xenoiotikum trnszformáló enzimrendszerre kifejtett htását vizsgálv GST ktivitásánk növekedését észlelték pontyn (Krvchenko et l., 1989). Szintén T-2 toxin htásár, 0,52 és 2,45 mg T-2 toxin/kg tkrmány koncentráció mellett, négy hetes kezelés során emelkedett GSH szintet tláltk pontyn, lipidperoxidációs mrkerek értékei zonn nem mutttk változást (Blogh et l., 2009). Hsonló eredményeket kptunk T-2 toxinnl vgy DON-nl szennyezett tkrmány etetését követően hosszútávú vizsgált során pontyn. Az ntioxidáns rendszer és lipidperoxidációs folymtok mrkerei csk kismértékű változást mutttk, génexpresszió szinten ugynkkor Ggpx4 és Gpx4 gének indukcióját tpsztltuk (Pelyhe et l., 2016). Egy másik, pontyokkl végzett, 4 hetes etetéses kísérleten, emelkedő MDA értékek mellett, csökkent CAT- és emelkedett GST ktivitást tpsztltk májn, GPx és GSR ktivitás zonn nem változott. A veséen viszont, szintén emelkedő MDA trtlom mellett, GPx ktivitás csökkenését és CAT növekedését tpsztlták. Megfigyelték továá TNF-α és z IL-10 gének indukcióját is, nem tpsztltk viszont génexpressziós változásokt Cyp450 2F2 és Ct gének expresszióján sem májn sem veséen (Mtejov et l., 2016). Egy in vitro vizsgáltn, DON terhelés során, különöző hlfjokól izolált sejtvonlkn is fokozott mértékű lipidperoxidációt tpsztltk, melyre szivárványos pisztrángól szármzó sejtvonl volt leginká érzékeny (Pietsch et l., 2011). 11

22 3.2 Az oxidtív stressz kilkulás, efolyásolás, htás és molekuláris jellemzői A szervezeten részen külső htásokr, de számos élettni folymt során is folymtosn képződnek ROS vegyületek egyes enzimtikus folymtok (pl. mitokondriális légzési lánc (Murphy, 2009)), vgy z immunrendszer működése során z oxidtív urst mechnizmus révén (Sluch, 2011), de keletkezhetnek szintézis útján is, például nitrogén oxid ktivációjávl (Bredt et l., 1990). Ezek molekulák kémiilg rektívk és károsíthtják iológii mkromolekulákt, de fontos szerepet töltenek e egyes jelátviteli útvonlkn, sejtszintű folymtok szályozásán, nem specifikus immunválsz kilkulásán, vgy z poptózis indukcióján (Engel et l., 2006; Dickinson és Chng 2011; Sluch, 2011). A ROS képződés fiziológiás szinten trtását iológii ntioxidáns védelmi rendszer végzi, ugynkkor, h ROS képződés és z ntioxidáns védelmi rendszer egyensúly felomlik, oxidtív stressz lkul ki (Sies, 1991). Az egyensúly megomlás ekövetkezhet ROS képződés fokozódás, vgy szervezet ntioxidáns védelmének csökkenése (pl. C-, E-, vgy A-vitmin hiány, metionin/cisztein hiány, szelénhiány, ntioxidáns enzimek csökkent ktivitás) mitt is (Espinos-Diez et l., 2015). Az így kilkult oxidtív stresszre, nnk mértékétől függően, sejtek eltérő módon és mértéken regálnk, mely eltérő következményekkel jár sejtek túlélése szempontjáól (Gloire et l., 2006). Oxidtív stressz htásár sejtek minden iomolekuláj károsodht (Jco és Burri, 1996). Ennek következtéen károsodnk különöző sejtstruktúrák (Berlett és Stdtmn 1997), de elsősorn lipidek, zok (per)oxidációj révén (Gutteridge és Hlliwell 1990). A DNS károsodás mitt szálk törése is ekövetkezhet, vlmint egyes, lipid peroxidáció terminációs szkszán keletkező, metolitok (pl. MDA, 4-hidroxi-2-nonenál) htásár DNS dduktok jöhetnek létre, melyek pontmutációk kilkulásához vezethet (Cooke et l., 2003; Ayl et l., 2014). A lipidek peroxidációj elsősorn memránokt érinti, mivel zok foszfolipid kettősrétegen ngy mennyiségű töszörösen telítetlen zsírsv tlálhtó, melyek különösen érzékenyek peroxidtív károsodásokr (Ayl et l., 2014). A lipidperoxidáció kezdeti lépéseként memránlkotó töszörösen telítetlen zsírsvkról egy ROS elektront von el (iniciáció), melynek htásár lipid szdgyökök keletkeznek, melyek zután szomszédos kettős kötésekről vonnk el elektronokt, melynek htásár peroxidtív láncrekció lkul ki (propgáció). A folymt kezdeti szkszán kettőskötések átrendeződése mitt konjugált diének (CD) és konjugált triének (CT) keletkeznek (Tkgi et l., 1987; Ayl et l., 2014), melynek következtéen megváltozik memránok fluiditás, emitt integritás. Ezt követi propgációs folymt, melynek során telítetlen kettőskötések felomlnk és oxidálódnk. A folymtot egy végső, terminációs, fázis zárj, melynek során zsírsvk feldrolódnk és ennek során metstil végtermékek, így például ldehidek, keletkeznek (pl. mlondildehid, 4- hidroxi-2-nonenál) (1. ár). Ezek rektív ldehidek fehérjéket precipitálhtnk, sőt DNS dduktokt is létrehozhtnk. A 4-hidroxi-2-nonenál átjut vér-gy-gáton is, mely zért különösen veszélyes, mert z gy ngy lipid-, ezen elül telítetlen zsírsvtrtlm, mellett z egyes szövetek közül legkevésé htékony ntioxidáns védelmi rendszerrel rendelkezik (Genet et l., 2002; Ayl et l., 2014). A lipidperoxidációs folymtok következtéen z oxidtív módon károsodott zsírsvk mitt memránok fluiditás és integritás csökken, emitt permeilitásuk megnő (Gutteridge és Hlliwell 1989), melynek htásár végeredményen sejt pusztulás, lízise következik e (Mézes és Mtkovics 1986). 12

23 Iniciáció Propgiáció Termináció 1. ár A lipidperoxidáció folymt: A lipidperoxidáció kezdeti lépéseként töszörösen telítetlen zsírsvkról egy ROS elektront von el (iniciáció), ennek htásár lipid szdgyökök keletkeznek, mely peroxidtív láncrekciót indítnk el (propgáció). A folymtot egy végső, terminációs, fázis zárj, melynek során zsírsvk feldrolódnk és ennek során metstil végtermékek, így például ldehidek, keletkeznek (Perjési 2014 nyomán) Az oxidtív htásoktól függően szervezeten különöző mértékű oxidtív stressz lkul ki, melynek függvényéen eltérő rekciós útvonlk ktiválódnk. Ezeket z eltérő válszrekciókt z ún. hierrchikus oxidtív stressz modellen (2. ár) fogllták össze (Gloire et l., 2006). 2. ár A hierrchikus oxidtív modell: Különöző mértékű oxidtív stressz függvényéen eltérő rekciós útvonlk ktiválódnk molekuláris és fehérje szinten. Alcsony oxidtív stressz esetén z Nrf2-iNrf2-ARE útvonl ktiválódik, melynek htásár z ntioxidáns elemek génexpressziój indukálódik (piros kerettel jelölve), közepes oxidtív stressz gyulldásos folymtokt indukál z NFκB és MAPK útvonlon, melynek htásár gyulldássl kpcsoltos fehérjék expressziój emelkedik, mgs oxidtív stressz esetén poptózis folymt zjlik mitokondriális pertuáció révén (Gloire et l., 2006 nyomán) 13

24 3.2.1 Az lcsony szintű oxidtív stressz áltl kiváltott sejtszintű válszrekciók A modellől láthtó (2. ár), hogy mennyien z oxidtív stressz lcsony szintű, nnk htásár ktiválódik szervezet ntioxidáns védelmi rendszere. Ennek során egyrészt fehérje szinten ktiválódnk z ntioxidáns enzimek (pl. SOD, CAT, GPx), melynek hátteréen molekuláris szinten Kelch-like ECH-ssocited protein 1 (Kep1)- Nucler fctor E2-relted fctor 2 (Nrf2) - Antioxidáns válszelem (ARE) (Suzuki et l., 2016) enzimtikus útvonl indukálódás áll. Ennek révén fokozódik z ntioxidáns fehérjék, így például z ntioxidáns enzimeket kódoló gének expressziój (Moi et l., 1994). A folymt kulcseleme z Nrf2, mely egy, sejteken fiziológiás körülmények között folymtosn termelődő, trnszkripciós fktor (Suzuki et l., 2016). Az ntioxidáns válszelem folymtos ktiválódásánk elkerülése érdekéen zonn folymtosn termelődik egy Nrf2 represszor fehérje (Kep1 vgy inrf2) is, mely homodimer formán ktív és egy Cullin-3 lpú E3 uiquitin ligázhoz kpcsoló dpter fehérje (Suzuki és Ymmoto, 2015). A Kep1 szerkezetileg három funkcionális csoportot trtlmz: N-terminális BTB (Brod complex, Trmtrck nd Bric--rc) domin, IVR (intervening (közeeső) region), és DC dominek. A DC doméneket egy DGR (doule glycine repet) domin és egy CTR (croxylterminl region) lkotj (3. ár). A BTB domin Kep1 homo-dimerizációján játszik szerepet, ezáltl két Kep1 molekul képes megkötni z Nrf2-t DC domineken (3. ár). A Kep1 cisztein csoportji: Cys151, Cys273 és Cys288, melyek z oxidtív stressz érzékeléséen játsznk szerepet. Az Nrf2 ht funkcionális csoportot trtlmz, melyek Neh (Nrf2 ECH homology) 1-6 dominek (4. ár) (Suzuki et l., 2016). A Neh1 domin leucin cipzár ázikus régió szerkezete révén z Nrf2 képes smf fehérjével dimerizálódni és ennek révén kötődni DNS-hez. A Neh4 és Neh5 trnszktivátor dominek, melyek képesek kötődni CBP-hez (CREB-inding protein) és más trnszkripciós koktivátorokhoz. A Neh2 és Neh6 dominek degronok, melyek Kep1 és β-trcp trgetszkszi z Nrf2 degrdációs folymtán. A Neh2 domin DLGex és ETGE dominekől áll, melyek Kep1-hez kötődésért felelősek (Suzuki et l., 2016). Homodimerizáció DC domin Nrf2 kötés Cisztein csoportok 3. ár A Kep1 domin szerkezete: A fehérje három funkcionális csoportot trtlmz: N-terminális régió (NTR), BTB (Brod complex, Trmtrck nd Bric--rc) domin, mely homodimerizáción játszik szerepet, IVR (intervening (közeeső) régió), mely CUL3-ml vló interkcióért felelős szksz, és DC dominek, melyek 6 ismétlésen mguk fogllják konzervált Kelch domént (doule glycine repet DGR) és C terminális régiót (CTR), melyek z Nrf2-vel vló kötődésért felelősek. A Kep1 cisztein csoportji: Cys151, Cys273 és Cys288, melyek z oxidtív stressz érzékeléséen játsznk szerepet. (Suzuki et l 2016 nyomán) 14

25 A Neh2 domin z Nrf2 N-terminális részén tlálhtó. A Kep1-hez vló kötődésért z Nrf2 Neh2 domin két legysége felelős, z lcsony ffinitású DLGex (extended DLG) és mgs ffinitású ETGE legységek. A két legység közötti lizin csoportok z uikvitinizáció trgetjei, ezáltl két kötőhely kiemelt szerepet játszik z Nrf2 elontásán. Oxidtív stressz htásár DLGex disszociál Kep1-ről, ezáltl megváltozik Kep1 szerkezete, így z Nrf2 degrdációj nem megy vége. Az ETGE két lépéses folymtn kpcsolódik Kep1-hez. Az első lépésen gyorse/gyors-ki, második lépésen pedig lssú-e/lssú-ki módon kpcsolódik, melynek segítségével stiln kötődik Kep1-hez. A DLGex zonn már egy lépésen kpcsolódik Kep1-hez, mely gyors-e/gyors-ki működésű. Ezek különségek fontos szerepet játszhtnk z oxidtív stressz érzékeléséen (Suzuki et l., 2016). Az ETGE és DLGex legységeket működésük mitt hinge nd ltch (zsnér és retesz) modellként írták le, míg Kep1-Nrf2 kpcsolódást Two-site inding (Kétoldli kötődés) modellel jellemzik (Mitsuishi et l., 2012). A Neh6 domin β-trcp Nrf2 ontási útvonln játszik szerepet, mely szintén egy Cullin-3 lpú E3 uiquitin ligázhoz kpcsoló dpter fehérje, zonn β-trcp csk foszforilált Nrf2-t ismeri fel. Az Nrf2 foszforilációját GSK3 végzi, Neh és 338. szerin csoportjánál. A GSK3 ktiválódás PI3K AKT útvonlon történik. Kep1 kötés Trnszktiváció β-trcp kötés DNS kötés smf kötés 4. ár Az Nrf2 domin szerkezete: Az Nrf2 ht funkcionális csoportot trtlmz. A Neh2 domén Kep1 leontási útvonlért felelős, Neh4 és 5 trnszkripció ktiválásáért felelős, Neh1 DNS és smf kötésért felelős, Neh6 z Nrf2 β-trcp Nrf2 ontási útvonln játszik szerepet. Az árán tová láthtó Neh2 két legysége, DLGex és ETGE dominek, melyek Kep1-hez kötődésért felelősek (Suzuki et l 2016 nyomán) A Kep1 citoszoln megköti, mjd uiquinizációt követően proteoszómá szállítj z Nrf2- t, mely ott leontásr kerül (Kspr et l., 2009), ezáltl szályozv nnk ktuális mennyiségét (4. ár). A Kep1-homodimer emellett z oxidtív stressz érzékelőjeként is fontos szerepet kp záltl, hogy olyn cisztein csoportokkl rendelkezik, melyek képesek z intrcelluláris redox változásokt érzékelni (Suzuki és Ymmoto, 2015). Ennek lpját z dj, hogy Kep1 cisztein csoportji tiol (-SH) csoportokt trtlmznk, melyek könnyen regálnk z elektrofil molekulákkl (Suzuki et l., 2016). Az Nrf2 másik degrdációs útvonlán GSK-3 (glycogen synthse kinse-3) játszik szerepet, mely foszforilálj z Nrf2-t, mjd z uiquinizációt követően leontásr kerül β-trcp (β - trnsducin repet contining protein) áltl, mely ezáltl megkdályozz z Nrf2 nukleusz történő ejutását és felhlmozódását (5. ár) (Suzuki et l., 2016). 15

26 A Fiziológiás állpot Oxidtív stressz B ROS Citoszol Trnszlokáció Nukleusz Antioxidáns gének expressziój Proteszómális leomlás 5. ár Az Nrf2 működése és degrdációs úvonli, A: fiziológiás ROS szint esetén Kep1 megköti z Nrf2-t, mely uikvitizációt követően proteoszómán degrdálódik, B/1: Oxidtív stressz esetén z Nrf2 ejut sejtmg, kpcsolódik z ARE-vel és indukálj z ntioxidáns gének expresszióját, míg B/2: GSK-3 áltl foszforilált Nrf2-t nukleuszn β-trcp elontj, így megkdályozv z Nrf2 nukleuszn vló túlzott felhlmozódását. (Suzuki et l., 2016 nyomán) Az Nrf2 felezési ideje lcsony, körülelül 18 perc (Suzuki et l., 2016). Oxidtív stressz körülmények között viszont z Nrf2 stilizációj feltételezhetően olyn mechnizmusoktól függ, melyek megkdályozzák, vgy csk csökkentik, Kep1 Nrf2-höz kötődését (Nguyen et l., 2005). A nem kötött Nrf2 ejut sejtmg és ktiválj z ntioxidáns válszelem áltl kódolt gén-klsztert (5. ár). Oxidtív stressz szignál htásár emellett degrdálódik Kep1 fehérje is, ezzel is elősegítve z Nrf2 ejutását sejtmg, hol z, egy Mf1 fehérjéhez kpcsolódást követően, összekpcsolódik z ARE, más néven Electrophil Response Element (EpRE) vgy CNC-sMf inding element (CsMBE) kötőhelyekkel (Bloom és Jiswl 2003; Itoh et l., 2004). A felismert kötőhelyek z ntioxidáns védelemért felelős fehérjéket kódoló gének promóter régióján tlálhtó trnszkripciós fktor kötő helyek (Nguyen et l., 2009). A kpcsolódást követően tö mint 200 olyn gén expressziój indukálódik, melyek közvetlen vgy közvetett módon részt vesznek z ntioxidáns védelemen. Így például ktiválj fázis II detoxifikációért felelős, gluttion ioszintézisért felelős enzimek, továá z extrcelluláris szuperoxiddizmutáz, egyes hősokk fehérjék, vlmint ferritin gének expresszióját (Petri et l., 2012). Az ARE olyn szerkezeti és iológii tuljdonságokkl rendelkezik, melyek egyúttl meghtározzák oxidtív stressz iránti érzékenységét is (Rushmore et l., 1991). Nem csupán H2O2-re dott válsz képes ktiválni, hnem minden olyn vegyület, mely ekpcsolódht redox ciklus és/vgy metolikus úton válik rektív vgy elektrofil intermedierekké (Rushmore et l., 1990). Ezen felül minden olyn vegyület is ktiválj, mely rekció lép szulfhidril csoportokkl, ezzel csökkentve sejtek szd -SH trtlmát (Nguyen et l., 2009). 16

27 Az oxidtív stressz áltl indukált jelátviteli utk és szignál-rendszerek, z ntioxidáns, így például Gpx gének expressziójánk indukálás mellett, efolyásolják z e gének áltl kódolt enzimfehérjék poszt-trnszlációs modifikációját, zz ktivitását is. Ezek folymtok zonn részleteien jelenleg még csk kevésé ismertek. Leírták például, hogy citoszol gluttionperoxidáz (GPx1) poszt-trnszláció során cetiláció (Sheprd et l., 2010; Fritz et l., 2012), illetve foszforiláció (Co et l., 2003) útján módosulht, mi jelentősen növeli z enzim ktlitikus ktivitását (Sheprd et l., 2010). A mitokondriumn, GPx1 mellett, foszfolipid-hidroperoxid gluttion-peroxidáz (GPx4) cetilációját is leírták (Choudhry et l., 2009; Fritz et l., 2012; Lundy et l., 2012) A közepesen mgs szintű oxidtív stressz áltl kiváltott sejtszintű válszrekciók Amennyien z oxidtív stressz mértéke nő, már nem elsősorn z Nrf2 ktiválódik, hnem gyulldásos folymtok indukálódnk, melynek során z NFκB (Nucler Fctor κ B) trnszkripciós fktor jut e nukleusz, miután z erőteljes mértékű oxidtív stressz htásár degrdálódik nnk represszor fehérjéje, z infκb. Ennek eredményeként egyes citokinek, interleukinek és interferonok génexpressziój indukálódik (2. ár) (Lwrence, 2009) A mgs szintű oxidtív stressz áltl kiváltott sejtszintű válszrekciók Az oxidtív stressz mértékének egy kritikus szintje felett, már z ún. progrmozott sejthlál (poptózis) vgy nekrózis szignál útvonli válnk elsődlegessé (2. ár). Az poptózis során tumor nekrózis fktor (TNF) útvonl (intrinsic pthwy) ktiválódik, melynek során mitokondriumok perturációj (pore trnsition) következik e mitochondril swelling révén (extrinsic pthwy). Ez utói folymt hátteréen klcium efflux zvr mitt ekövetkező kszpáz kszkád ktiválódás áll (Engel et l., 2006; Bnerjee et l., 2016). Amennyien viszont sejteket olyn mértékű oxidtív károsodás éri, melynek htásár memránlkotó töszörösen telítetlen zsírsvkt trtlmzó foszfolipidek is oxidtíve károsodnk, melyet szervezet ntioxidáns és repir rendszerei már nem képesek szályozni, úgy nekrózis lkul ki. A nekrózis során memrán sérülések következtéen sejtől enzimek és egyé iológiilg ktív nygok jutnk z extrcelluláris tére, károsítv ezzel sejtek környezetét, mi továi ROS képződéshez vezet (Choi et l., 2009) Mikotoxinok htás z Nrf2-ARE útvonlon A trichotecénvázs mikotoxinok áltl előidézett oxidtív stressz htásár z ARE feltehetően z Nrf2-ARE útvonlon keresztül ktiválódik, mely z oxidtív stressz válszért felelős fehérjék és gluttion szintéziséen és újrhsznosításán résztvevő gének trnszkripcióját is irányítj (Jennings et l., 2013), ee eleértve gluttion-peroxidázokt is (Köhle és Bock 2007). Ezt támsztj lá z megfigyelés, hogy T-2 toxin htásár csökkent z Nrf2 expressziój in vivo egér gyn (Chudhry és Ro 2010), melynek htásár z lklmzott dózis és z expozíció időtrtmától függően csökkent és/vgy nőtt néhány, gluttion újrhsznosításáért felelős, enzim génexpressziój is, melyet primer csirke heptocitákn írtk le in vitro modellen (Mu et l., 2013). Azt is megfigyelték, hogy Nrf2 knock-out ptkányok ngyo érzékenységet mutttk z fltoxin B1 toxicitássl szemen, melynek hátteréen z Nrf2-ARE útvonl gátlás állht. Ezzel ellentéten Kep1 knock-down egerek, vd típushoz viszonyítv, jon tolerálták xenoiotikumokt, mi zzl mgyrázhtó, hogy kise mennyiségű Kep1 fehérje kevese Nrf2-t kötött meg. A Kep1 homozigót knock-out egerek ugynkkor lultápláltság mitt válsztást követően elpusztultk, melynek ok z emésztőrendszer hyperkertosis volt, zz Kep1 fehérje hiányánk z Nrf2-ARE útvonlr gykorolt htás mellett egyé, még nem teljes mértéken feltárt, htási is lehetnek (Suzuki et l., 2016). 17

28 3.3 A szervezet ntioxidáns rendszerének emuttás A iológii ntioxidáns rendszer Az élő szervezeten z oxidtív htások kivédésére z evolúció során egy htékony iológii ntioxidáns védelmi rendszer lkult ki, melynek funkciój ROS áltl előidézett károsodásoktól megvédeni szervezetet (Sies 1997). Mgs rendű szervezeteken z ntioxidáns védelmi rendszernek három védelmi vonl lkult ki (Tokrz et l., 2013) Az első védelmi vonl Az első védelmi vonlt kis molekultömegű ntioxidánsok lkotják. Ezek olyn nukleofil és redukáló tuljdonságú molekulák, melyek képesek rekció lépni rektív elektrofil szdgyökökkel és környezetükhöz képest könnyeen képesek zoknk egy vgy két elektront átdni, zz elektron donorként funkcionálnk. Lehetnek zsíroldékony (pl. A-vitmin, E-vitmin), vgy vízoldékony (C-vitmin, húgysv, gluttion) krkterűek. Az ntioxidáns molekulák htásár leáll szdgyökök áltl előidézett láncrekció, miközen, igz csk rendkívül rövid időre és csk kismértéken, de mguk is rektív gyökké lkulnk (Buettner és Jurkiewicz, 1993), melyet követően zonn gyorsn és ngy htékonysággl redukálódnk. A zsíroldékony α-tokoferol fizikilg is kpcsolódik memrán foszfolipidekhez, ezáltl közvetlenül védi zokt z oxidtív károsodástól. Oxidációját követően tokoferil-kinonná lkul, mely kevésé hidrofó krkterű, ezért részen kilép memránól. Az oxidálódott α-tokoferolt (tokoferil-kinon) elsősorn citoszoln lévő L-szkorinsv redukálj, mely ezáltl ismét hidrofóá válik, így ismét kpcsolt léphet memrán foszfolipidekkel (Tokrz et l., 2013). Az oxidálódott szkorinsvt (dehidroszkorinsv) részen GSH regenerálj (Espinos-Diez et l., 2015), vgy een formán kiürül szervezetől. A kis molekultömegű ntioxidánsokt más megközelítésen metolikus és nutriens ntioxidánsok csoportjá is oszthtjuk (Lien et l., 2008). A metolikus ntioxidánsok közé zok z endogén vegyületek trtoznk, melyeket szervezet is képes előállítni. Ilyen például gluttion, z L-rginin, koenzim Q10, vgy meltonin (Droge 2002). Ezzel szemen nutriens ntioxidánsok olyn exogén vegyületek, melyeket szervezet nem képes előállítni, zokt tkrmány vgy táplálék útján veszi fel. Ide trtozik például z E-vitmin, C-vitmin (egyes álltfjoknál, így például legtö hlfjnál is), krotinoidok, továá egyes flvonoidok (Lien et l., 2008). A nem-enzimtikus ntioxidáns védelem kiemelten fontos tgj vízoldékony redukált gluttion (GSH), mely három minosvól áll (tripeptid). A peptid szintézise zonn nem áll genetiki kontroll ltt, n két enzim vesz részt, γ-glutmil-cisztein-szintetáz vgy ligáz (GCS vgy GCL), mely glutmát és cisztein kpcsolódását ktlizálj, vlmint gluttion-szintetáz (GS), mely dipeptidhez egy glicin minosvt kpcsol (6. ár). A folymt ATP-dependens (Espinos-Diez et l., 2015). A GCL heterodimer enzim, melynek ktlitikus ktivitásért GCLc (73 kd) legység, vlmint GCLc egység szályozásárért GCLm (33 kd) legység felelős (Lu 2013). A GSH szervezeten z egyik legngyo mennyiségen előforduló ntioxidáns molekul, melynek redukált formáj ktív tiol csoporttl rendelkezik, ez oxidtív stressz esetén könnyen oxidálódik, így z oxidtív folymtok elleni védelem fontos komponense (Volodymyr 2011). A ROS redukcióját követően két oxidálódott GSH dimerizációjávl gluttion-diszulfid (GSSG) jön létre. A GSH közvetlenül és közvetve egyránt képes ROS eliminálásár. Egyrészt ugynis 18

29 közvetlenül rekció léphet szuperoxid nionnl és más szdgyökökkel, másrészt pedig, közvetett módon, képes más ntioxidáns molekulákt, így például dehidro-szkorinsvt, redukálni (Espinos-Diez et l., 2015). A GSH homeosztázist nem csk nnk de novo szintézise efolyásolj, de n szerepe vn más fktoroknk is, így például sejten elüli felhsználásnk, z újrhsznosításnk (GSSG GSH redukció), vgy sejtől történő efflux mértékének. A GSH-nk szerepe vn továá szervezet enzimtikus ntioxidáns védelméen is, mint GPx vgy GST enzimek ko-szusztrátj. A GSSG-t gluttion reduktáz (GSR) regenerálj, mely folymtnk fontos szerepe vn sejtek szd szulfidril trtlmánk fenntrtásán (6. ár). Emellett számos egyé funkcióvl is rendelkezik, így például cisztein trtlék, trnszportálj és tárolj nitrogén oxidot, részt vesz z ösztrogének, leukotriének és prosztglndinok metolizmusán, rionukleotidok és deoxirionukleotidok redukálásán, vlmint konjugáló ágensként részt vesz xenoiotikum trnszformáción (Hlliwell és Gutteridge 1989). A GSH ioszintézisét llosztérikus folymtok, vlmint szusztát-hozzáférés is efolyásolják. Amennyien ugynis z intrcelluláris GSH trtlom egy kritikus értéket meghld, kkor GCLc kompetitív gátlás révén csökken GSH szintézise. Szintézisének továi limitáló tényezője sejtek szd cisztein trtlm (Lu 2009; Lu 2013). γ-glutmil-cisztein + L-Gly 6. ár A gluttion ioszintézis és gluttion redox rendszer: A cisztein (L-Cys) és glutmin (L-Glu) összekpcsolását γ-glutmil-cisztein-ligáz (GCL) végzi, ezt követően gluttion-szintetáz (GS) egy glicint (L- Gly) cstol z így létrejövő GSH-hoz, mely folymtok NADPH-t igényelnek. A gluttion redox rendszeren, GPx enzim koszusztrátként hsználj GSH-t H 2O 2 eliminlásához, mjd létrejövő oxidált GSSG-t GR visszredukálj GSH-vá, mi szintén energi igényes folymt (Espinos-Diez et l., 2015 nyomán) 19

30 A második védelmi vonl A második védelmi vonlhoz z ntioxidáns enzimek (SOD, CAT, GST, GPx, tioredoxin-reduktáz (Trx) és egyes fémkötő (kelátképző) fehérjék (pl. ferritin, metllotionein, lumin) trtoznk. Az ntioxidáns enzimek olyn módon semlegesítik rektív oxigén gyököket, hogy ROS-t redukáló rekciókt ktlizálnk (Ci és Cherin 2003; Espinos-Diez et l., 2015). A kelátképző fehérjék pedig olyn módon htnk, hogy megkötik z átmeneti fémeket (pl. Fe, Cu), melyek Fentontípusú rekciók során ROS képződést indukálhtnk (7. ár) (Leonrd et l., 2004; Murle et l., 2014). 7. ár A Fenton rekció folymt: Fém-ktlizált szdgyök képződés, melyen vs hidrogénperoxiddl regálv szdgyököket hoz létre (Murle et l., 2014 nyomán) Az enzimtikus védőrendszer elemei: szuperoxid niont hidrogén-peroxiddá redukáló szuperoxid-dizmutázok (SOD), hidrogén-peroxidot ontó ktláz (CAT), vlmint peroxidázok csoportj, ezen elül például gluttion-peroxidázok (GPx) és gluttion S- trnszferázok (GST) (Leonrd et l., 2004), továá tioredoxin reduktázok (Trx) (Holmgren, 1977). A mitokondriumokn és mikroszómákn folymtosn keletkező szuperoxid nion semlegesítését szuperoxid-dizmutázok (SOD) végzik. Az ősi típusú Mn-SOD prokriótákn és z eukrióták mitokondriumán tlálhtó. Az eukriót sejtek citoszolján viszont Cu-Zn SOD vn jelen (Espinos-Diez et l., 2015). A ktláz csknem teljes készlete mikroszómákn, sejtmgn és peroxiszómákn tlálhtó (Leonrd et l., 2004). A GPx enzimeknek jelentős szerepük vn ROS káros htásivl szemeni védekezésen, elsősorn citoszoln és mitokondriumn, mivel szuperoxid-dizmutáz működése során keletkező H2O2- t vízzé lkítják, miközen GSH-t oxidálják (8. ár) (Imi és Nkgw 2003). A tioredoxin reduktáz tioredoxin, egy átlgosn 12 kd molekultömegű tiol/diszulfid, redukcióján vesz részt. A tioredoxin fontos intrcelluláris redox szályozó, mert szerepe vn redox-érzékeny trnszkripciós fktorok szályozásán és zokt ktív formán trtj oxidtív stressz állpotokn. Ennek lpján tioredoxin és tioredoxin reduktáz megelőző funkciót töltenek e ROS áltl előidézett citotoxicitás kivédéséen (Clrese et l., 2009). 8. ár Az enzimtikus ntioxidáns rendszer semtikus áráj: A szuperoxid niont SOD H 2O 2-vé lkítj, melyet CAT és GPx ont tová vízzé (Li et l., 2000 nyomán) 20

31 A gluttion S-trnszferáz enzimcslád nem kizárólg ntioxidáns htású, mert xenoiotikum trnszformáció II. Fázis, zz ioszintetikus konjugáció, enzimek közé trtozik, melyek részen GSH és z elektrofil xenoiotikumok ioszintetikus konjugációját ktlizálják (Liu et l., 1993). Ezen túlmenően gluttion-peroxidázhoz hsonló ktivitássl is rendelkeznek, melynek során főképp szerves hidroperoxidokt redukálják ko-szusztrátként GSH-t felhsználv, elsősorn szelén hiányos állpotokn, mintegy szelén-dependens GPx helyettesítőjeként (Rhmn 2007). A gluttion redox rendszer lcsony szintű oxidtív stressz esetén kiemelt fontosságú, míg ktláz erőteljese oxidtív stressz htások esetén tölt e fontos szerepet és iztosít védelmet (9. ár) (Zoidis et l., 2010; Mtés et l., 2000) A hrmdik védelmi vonl A hrmdik védelmi vonl z ún. repir molekulák és enzimek trtoznk, így pl. hősokk fehérjék (Hsp), egyes lipázok, proteázok, továá DNS repir enzimek és gluttion-reduktáz (GSR), melyek károsodott/oxidálódott mkromolekulák helyreállítását és/vgy eltávolítását ktlizálják (Dvies, 2000) A szelenoproteinek molekuláris iológii jellemzői A gluttion-peroxidázok szelenoproteinek legfontos csoportj, melyek ktív centrumukn szelént szelenocisztein formáján trtlmzzák (Kieliszek és Błżejk, 2016). A szelenoproteinek mrns-e egy SECIS (selenocysteine insertion sequence) elemet trtlmz, mely jól meghtározott tuljdonságokkl rendelkezik. A nyitott leolvsási kereten (open reding frme) elül UGA kodon tlálhtó, mely más mrns-ek esetén, trnszláció során STOP kodonként funkcionál (9. ár, A). A SECIS elemet trtlmzó szelenoproteineken zonn egy speciális másodlgos szerkezet stem-loop struktúr lkul ki trnszkripciót követően 3 UTR régión (9. ár, B), melyet egy enzim komplex felismer, és melynek htásár trnszláció során szelenocisztein épül e z minósv lánc. Áltlános gén mrns A Strt kodon Stop kodon Szelenogén mrns Stop kodon B Strt kodon Kori stop kodon (UGA) SECIS elem 9. ár A szelenogének és áltlános gének mrns szerkezetének felépítése: A: z áltlános mrns-ek strt kodonnl kezdődnek, mjd stop kodonnl végződnek, míg szelenogén esetén kori stop kodon (UGA) szelenociszteint kódol (Penglse 2014 nyomán) 21

32 Amennyien áltlános mrns-ek nyitott leolvsási keretén elül mutáció révén stop kodon lkul ki (UAG (mer); UAA (ochre); UGA (opl)), kori stop kodon mitt potenciálisn sérült, kori terminációt hordozó mrns-ől megrövidült fehérjék képződhetnek, melyek eliminálásár sejt töszintű védekező mechnizmussl rendelkezik. Ezen mechnizmusok egyike nonsense mutáció áltl mediált mrns leontás (nonsense-medited mrna decy, NMD), melynek feldt, hogy már mrns szinten megkdályozz fehérjék szintézisét (Berry et l., 1993; Lunskyy et l., 2014). A szelenotrnszkriptumn zonn z MND szályzó mechnizmusként működik, mely szelén hozzáférhetőségre regál. Amennyien szelén ellátottság megfelelő, szelenogének kori stop (UGA) kodonj trnszláció ltt újrkódolódik szelenociszteinné (Sec) egy SECIS-hez kpcsolódó fehérje komplex áltl. A trnszláció során SECIS elementhez kpcsolódó Sec-tRNS-t trtlmzó fehérje komplex kölcsönhtás lép rioszómávl, így Sec egyesül nszcens fehérjelánccl, ténylegesen átfordítv kori stop kodont Sec kodonná (Berry et l., 1991; Ppp et l., 2007; Lunskyy et l., 2014). Szelénhiányos állpotokn SECIS-hez kpcsolódó fehérje komplex felomlik és z open reding frme-en tlálhtó UGA kodont stop kodonként ismeri fel rendszer, emitt z mrns z NMD útvonlon keresztül elomlik (Morirty et l., 1998; Lunskyy et l., 2014). A szelenoprotein szintézis lssú folymt, mely jelentős mértéken függ z ktuális szelén ellátottságtól (Ppp et l., 2007). A szelenogének evolúciós retenciój és konzervtív volt rr utl, hogy Sec ktlitikus előnyt jelent. Összehsonlítv például Cys-szel ( szenlenocisztein trtlmú enzimek homológji ciszteint trtlmznk Sec helyett), Sec viszont növeli fehérje stilitását (Nuser et l., 2014) és lehetővé teszi z enzimktivitást tág fiziológii körülmények között is, így például szélese ph trtományn (Gromer et l., 2003), vlmint oxidtív stressz esetén ngyo H2O2 szintek mellett (Rocher et l., 1992). Emellett Sec áltlán ngyo ktlitikus ktivitást is eredményez, mint cisztein trtlmú fehérje izoformák. Amennyien például egyes GPx enzim izoformákn Sec helyett Cys tlálhtó, z ngymértéken csökkenti z enzim ktlitikus ktivitását (Miorino et l., 1995; Guo et l., 2014). 22

33 3.3.3 A GPx enzim cslád A GPx enzimek nélkülözhetetlen részei z ntioxidáns védelmi rendszernek, egyes tgji memránok védelmét, míg mások citoszol és sejtorgnellumok oxidtív károsodás elleni védelmet iztosítják. Jelentős szerepük vn ROS káros htásivl szemeni védelemen, mivel szuperoxid dizmutáz htásár szuperoxid nionól keletkező H2O2-t vízzé lkítják, GSH egyidejű oxidációj mellett (Imi és Nkgw 2003). A GPx enzimek sejtmgn, mitokondriumn és citoszoln egyránt megtlálhtók. Emlősöken eddig nyolc, GPx enzimcslád trtozó, fehérjét zonosítottk, melyek közül GPx1, GPx2, GPx3, GPx4 és GPx6 trtlmz szelenociszteint, míg GPx5, GPx7 és GPx8 homológok cisztein trtlmúk (Lunskyy et l., 2014) (3. tálázt). 3. tálázt A gluttion-peroxidáz enzimcslád tgji és előfordulásuk szervezeten Rövidítés enzim elnevezése (és előfordulás) GPx1 GPx2 GPx3 GPx4 GPx5 GPx6 gluttion-peroxidáz 1 (klsszikus, citoszol) gluttion-peroxidáz 2 (gsztrointesztinális) gluttion-peroxidáz 3 (plzm) gluttion-peroxidáz 4 (foszfolipid-hidroperoxidáz) gluttion-peroxidáz 5 (mellékhere specifikus ndrogén-függő fehérje) gluttion-peroxidáz 6 (szglóhám) GPx7 gluttion-peroxidáz 7 GPx8 gluttion-peroxidáz 8 (feltehetően önálló izoform) A GPx1-et vörösvértestekől zonosították, melynek fontos szerepe vn hemogloin oxidtív stressz elleni védelméen, mely z oxigén megkötéséért és nnk szállításáért felelős, ezáltl folymtos oxidtív stressznek vn kitéve (Mills et l., 1957). Megkdályozz továá z intrcelluláris hidrogén-peroxid felhlmozódást, csökkenti lipid-hidroperoxidok és más hidroperoxidok mennyiségét, melyek memrán lipidekől szdulnk fel lipidperoxidációs folymtok során (Mrtinez et l., 1982). Emlősöken z ntioxidáns védelem kiemelkedően fontos tgj (Lunskyy et l., 2014), melyet z is izonyít, hogy GPx1 knock-out egereken ngyo érzékenységet tpsztltk z oxidtív stresszel szemen (Cheng et l., 1998; Fu et l., 1999). A GPx1 túlzott mértékű génexpressziój zonn negtívn ht redox-érzékeny szignál kszkádrendszerekre, így például z áltluk szályozott tumor nekrózis fktorr (TNF-α) (Kretz- Remy et l., 1996), z epidermális növekedési fktorr (EGF) (Hndy et l., 2009), sőt még z inzulin elválsztás szályozásár is (Lei és Wng 2012). Ez utói okól GPx1 túltermelődését (overexpresszió) összefüggése hozták 2-es típusú diétesz, z inzulinrezisztenci, hiperinzulinémi, hiperglikémi és z elhízás kilkulásávl is (McClung et l., 2004; Pepper et l., 2011). A gsztrointesztinális GPx2 (Chu et l. 1993) specifikusn táplálékkl felvett, és élcstornán felszívódás előtt nem redukálódott, szerves hidroperoxidokt redukálj z emésztőtrktus epithel sejtjeien, minek szintén kiemelt szerepe vn, ugynis z epithel sejtek lkott rrier elégtelensége élcstornán gyulldásos folymtokhoz, mjd következményesen, élhámsejtek áteresztőképességének növekedése mitt, potenciálisn ptogén mikroorgnizmusok ejutásához, zz fertőzésekhez vezethet (Esworthy et l., 2005). 23

34 Megnövekedett expresszióját figyelték meg epitheliális eredetű tumorokn is (Bnning et l., 2012). Ez utói etegség pthomechnizmusán etöltött pontos szerepe zonn még nem tisztázott, mert például GPx2 knock-out egereken csk ngy dózisú UV sugárzássl lehetett dgntképződést indukálni (Wlshe et l., 2007), míg GPx1/GPx2 knock-out egereken spontán tumorképződést is megfigyeltek (Chu et l., 2004). Leírták viszont htását sejtosztódás szályozásán, knock-out tumor-sejtvonlkn ugynis gátolt sejtproliferációt (Niki-Ito et l., 2007), sőt poptózist indukált (Yn és Cehn 2006). Az extrcelluláris GPx3 (Tkhshi et l., 1990) főképp vese proximális tuulus sejtjeien szintetizálódik, de szerepét z extrcelluláris téren, véren keringve, tölti e. A vér lcsony ngy sűrűségű lipoprotein (HDL) szintjét, mely nnk csökkent proxonáz ktivitás révén növeli kis sűrűségű lipoprotein (LDL) oxidációját (Kpln és Avirm, 1999), melyhez áltlán GPx3 lcsony ktivitás is társul, összefüggése hozták például stroke megnövekedett kockáztávl (Nowk-Göttl et l., 2011). A GPx4-et vgy más néven foszfolipid-hidroperoxid gluttion-peroxidázt (PHGPx) Ursini és munktársi (1982) zonosították, egy, liposzómákt és iomemránokt peroxidációtól védő, kd molekultömegű fehérjeként. Az enzim citoszoln és memránkötött formán egyránt megtlálhtó (Mtés, 2000). Eltérően töi, tetrmer, GPx-tól, GPx4 monomer enzim (Ursini et l., 1985). Funkcióján is eltér z enzimcslád töi tgjától, mert nem elsősorn H2O2-ot redukálj (Mtés, 2000), hnem lipid hidroperoxidokt, lkil-peroxidokt és timidin peroxidokt (Bo et l., 1997; Ynt et l., 2003). A GPx4 képes továá redukálni egyé hidroperoxidokt, lipoproteinek és komplex lipidek oxidált derivátumit, melyek koleszterin és koleszterin-észterek oxidációj során szdulnk fel (Ling et l., 2007). A GPx4 továá z egyetlen olyn GPx enzim, mely specifikusn redukálj foszfolipid-hidroperoxidokt (Miorino et l., 1991). Memránkötött formáj memránok foszfolipid- és koleszterinperoxidjit is redukálj, ezáltl z -tokoferolll együtt védi memránok integritását (Thoms et l., 1990; Wortmnn et l., 2013). A redukcióhoz zonn ko-szusztrátként nem csk GSH-t, hnem egyé tiolokt is felhsználht. Érett spermiumokn GPx4 emellett rekció léphet egyes tiol fehérjékkel, főképp olyn eseteken, mikor GSH limitáló tényező. Ez folymt zonn nem z oxidtív stressz elleni védelem része, hnem spermiumok szerkezeti stilitását segíti elő, olyn módon, hogy egyes struktúrhtású fehérjéken ktlizálj diszulfid kötések kilkulását (Mnnes 2013). Szekvenci dtok lpján GPx4 tekinthető z egyik legősi szelenoenzimnek (Brigélius-Flohé et l., 1994; Mriotti et l., 2012). A GPx4 áltl ktlizált rekció során szelenociszteinől disszociált szelenolt (-Se-) egy hidroperoxid oxidálj, melynek htásár szelénsv (-SeOH) és víz jön létre. A szelénsv rekció lép szd tiol (-SH) csoportokkl, tipikusn GSH-vl, melynek során egy átmeneti szelenenil-diszulfid jön létre, melyet viszont egy második GSH molekul redukál (Conrd, 2009). A GPx4 enzimet egyesek Moonlighting fehérjének trtják, melyek jellemzői, hogy egyidejűleg tö esszenciális funkciót is etöltenek szervezeten (Jeffery, 1999). Ennek zonn némiképp ellentmond z tény, hogy GPx4, egyé htási mellett, szerepet játszik ugyn z oxidtív stressz indukált poptózis megelőzéséen (Seiler et l., 2008), de z htás végeredményen egy oxidtív stresszre dott válszrekció része, így nem tekinthető független htásnk. Feltételezhető ezen redox-szályozott, sejthlál útvonlon keresztül, hogy GPx4 ktivitásnk preventív szerepe lehet egyes neurodegenertív kórképeken, így pl. z Alzheimer etegségen (Yoo et l., 2010). 24

35 Ugynkkor GPx4 mrns-nek, lterntív splicing révén, tö különöző típus is létezik, nukleáris (ngpx4), mitokondriális (mgpx4) és citoszol (cgpx4) izoformák. A citoszol izoform z emrionális fejlődés során, és felnőtt szöveteken is széleskören expresszálódik. A nukleáris és mitokondriális izoformák zonn kizárólg heréen fordulnk elő (Nolnc et l., 2011). Ennek formánk tehát, ntioxidáns htás mellett, szerepe lehet spermiumok védelméen z érés folymtin (Ursini et l. 1999; Schneider et l., 2009; Ling et l., 2009), vlmint z emrionális fejlődésen (Imi et l, 2003; Ynt et l, 2003; Ling et l., 2009). Ez utóit z megfigyelés támsztj lá, hogy cgpx4 knock-out egéremriók már z emrionális fejlődés kori szkszán elpusztulnk (Ynt et l., 2003; Ling et l., 2009), míg ngpx / és mgpx / egéremriók életképesek voltk (Nolnc et l., 2011). A spermium érés kori szkszán GPx4 expressziój és ktlitikus ktivitás egyránt ngy, késő zonn inktiválódik és szerkezeti elemként működik. A GPx4, szulfhidril keresztkötések kilkítás révén ngy molekultömegű polimereket hoz létre, ugynis intrmolekuláris szelenil-szulfid hidkt képez Cys és Sec reziduumokkl. Ez szerkezeti elem, vlmint Sperm Mitochondrionssocited Cysteine-rich Protein (SMCP) védő kpszulát lkot spermium középrészén, mitokondrium-spirál körül (Miorino et l., 2005; Lunskyy et l., 2014). A mgpx4 knock-out hím egereket teljes infertilitás jellemzi, z enzim gmetogenezisen etöltött szerepe mitt (Schneider et l., 2009). Nukleáris GPx4 knock-out egereken viszont ilyen htás nem volt tpsztlhtó (Conrd et l., 2005), vlmint GPx1 és GPx2 esetén sem tpsztltk ehhez hsonló htásokt (Zoidis et l., 2010). Az emlősökkel ellentéten, hol GPx4 ktivitás z összes GPx ktivitás kevese, mint 2%-, mdrkn ennek mértéke z összes GPx ktivitásn jelentősen ngyo mértékű (ld. késő) (Brnes et l., 2009). Ennek filogenetiki különségnek hátteréen, mely mind génexpressziós, mind pedig enzimktivitás szinten megmuttkozik, z evolúció során megváltozott szerkezetű és/vgy funkciójú szelenogenom állht (Hung et l., 2011). Brojlercsirkék máján z összes peroxidáz-ktivitás 30%- szelén-dependens (GPx), 42% szelénindependens (GST), míg monomer GPx (GPx4) ktivitás 28%, melyől láthtó, hogy GPx4 z összes GPx ktivitás közel 50%-áért felelős (Miyzki és Motoi, 1992). Pulykán szintén GPx4 felelős z összes GPx ktivitás közel feléért májn, hrmdáért z izomn, hereszöveten és szívizomn (Sunde és Hdley, 2010). Megállpították rojlercsirkék máján és vázizomztán, hogy Gpx4 génexpressziój legngyo mértékű szelenoproteinek között (Hung et l., 2011). A mellizomn Gpx1-hez viszonyítv Gpx4 génexpressziój még ngyo (1:6) volt. A génexpresszió mértékét zonn z ktuális szelénellátottság is efolyásolt. Megfelelő szelénellátottság esetén 1:6 rányú volt Gpx4 jvár, ddig Gpx4 részrány szelénhiányos állpotn tová nőtt (Yo et l., 2014). Tojótyúkoknál is hsonlón mgs rányú expressziós szinteket mértek Gpx4 esetéen (Liu et l., 2014). 25

36 A gluttion-peroxidázok hlkn etöltött funkcióiról és z enzimek génexpressziójáról jelenleg még kevés információ áll rendelkezésünkre (Kryukov és Gldyshev, 2000, Thisse et l., 2003). Azonn számos hlfj genomján zonosítottk már z enzimcslád tö tgját kódoló géneket is (Benner et l., 2010; Mriotti et l., 2012). Pontyn Gpx4 génexpressziój májn legngyo mértékű, ezt követi z gy, mjd közel zonos mértéken, vázizom, vese és szív (10. ár) (Hermesz és Ferencz 2009). Thisse és munktársi (2003) Gpx4 gén két formáját (Gpx4, Gpx4) zonosították zerdánión (Dnio rerio). Hermesz és munktársi (2009) szintén két Gpx4 gént zonosítottk pontyn (Cyprinus crpio L.). 10. ár Reltív Gpx4 és Gpx4 mrns szintek ponty májn, veséen, szíven, izomn és gyn (Ferencz 2010) Hlkn GPx4 teljes GPx ktivitás közel egyhrmdáért felelős (Grim et l., 2011; Wng et l., 2012). Pontyn zt is megállpították, hogy Gpx4 mrns szintje májn legmgs, míg Gpx4 szint lcsony volt z összes vizsgált (10. ár) szöveten (Hermesz 2010). Zheng és munktársi (2013) szintén zt tlálták, hogy Gpx4 mrns legngyo mennyiségen zerdánió máján tlálhtó meg. Szivárványos pisztráng (Oncorhynchus mykiss) máján Gpx1 mrns mennyisége csk egyhrmd volt Gpx4 és Gpx4 mrns-hez viszonyítv (Pcitti et l., 2013), ellentéten z emlős máj GPx1 mrns mennyiséggel, mi közel 7-szer ngyo volt, mint GPx4 (Weiss et l., 2001). Hlk szöveteien z emlősökkel összehsonlítv z oxidációr érzékeny töszörösen telítetlen zsírsvk mennyisége (pl. DHA és EPA) jóvl ngyo (Mhffey, 2004). Ennek lpján feltételezhető, hogy sejtmemránokn tlálhtó töszörösen telítetlen zsírsvk oxidációvl szemeni védelmére is ngyo GPx4 ktivitás szükséges, melyet z is látámszt, hogy pozitív korrelációt figyeltek meg GPx4 ktivitás és töszörösen telítetlen zsírsvk mennyisége között különöző hlfjokn (Grim et l., 2011). 26

37 Emlős sejtekkel összehsonlítv, hlk májsejtjeinek memránján hosszú szénláncú töszörösen telítetlen zsírsvk (LcPUFA) (11. ár) mennyisége ngyo, mint rövid szénláncú töszörösen telítetlen zsírsvké (PUFA), vgy kár z egyszeresen telítetlen és telített zsírsvké (11. ár) (Moris et l., 2011). A LcPUFA-k rendkívül érzékenyek z oxidációr, mi lipid(per)oxidációs láncrekcióhoz vezethet, károsítv ezzel sejtmemránt (Aedi és Shri, 2014). Mint rr korán már utltm, GPx1 és GPx4 izoform egyránt képes peroxidok redukciójár, ugynkkor GPx4 szélese szusztrátspecifitássl rendelkezik (pl. lipidperoxidok) (Bo et l., 1997; Ynt et l., 2003; Ling et l., 2007). Emitt hlk számár előnyöse, h gluttion redox rendszeren GPx1 mellett multifunkcionális GPx4 prlógok ngyo rányn vnnk jelen (Penglse 2014). A GPx rendszer működése Emlős heptocit Hl heptocit Sejtmemrán Citoszol 11. ár Emlős és hl GPx rendszer működésének elméleti modellje heptocitákn: Hlk esetén memránn áltlán ngyo mennyiségen vnnk jelen hosszú szénláncú töszörösen telítetlen zsírsvk, melyek fokozottn érzékenyek z oxidációr. A GPx4 htékonyn eliminálj hosszú szánláncú töszörösen telítetlen zsírsvkól ROS htásár keletkező lipidperoxidokt, mint GPx1, emitt z emlősökhöz képest ngyo mennyiségen vn szükség hlknál ennek z enzimnek jelenlétére (Penglse 2014). Piros vonl: hosszú szénláncú telítetlen zsírsvk (LcPUFA); kék vonl: egyszeresen telítetlen és telített zsírsvk 27