gyakorlatok Általános biológia laboratóriumi Összeállította: Dr. Mara Gyöngyvér Oktatási segédlet biomérnök hallgatóknak

Átírás

1 Általános biológia laboratóriumi gyakorlatok Összeállította: Dr. Mara Gyöngyvér 2010 Oktatási segédlet biomérnök hallgatóknak Sapientia Erdélyi Magyar Tudományegyetem Műszaki Tudományok Intézete Csíkszereda

2 ÁLTALÁNOS TUDNIVALÓK A METSZETKÉSZÍTÉSRŐL ÉS A GYAKROLATOKON ALKALMAZOTT FESTÉSI MÓDSZEREKRŐL A metszetkészítés A növényi szervek szerkezetét legjobban metszetek készítése során tanulmányozhatjuk, így a legtöbb mikroszkópi preparátum metszéssel készül. A metszetek előállíthatok kézi technikával vagy mikrotommal. A metszés során arra kell törekedni, hogy a metszet egyenletesen vékony, hártyaszerűen áttetsző legyen. A metszetek előnye a többi mikroszkópi preparátumtípushoz viszonyítva az, hogy megmarad a sejtek és szövetek közötti természetes viszony (legalábbis a metszet síkjában), ha pedig egymás utáni síkokban metszetsorozatot készítünk, és ezek képét összevetjük, megismerhetjük az illető növényi testrész szerkezeti alkotóinak térbeli viszonyait is. A legjobb metszetek egyetlen sejtrétegnyi vastagságúak. Kézi technikával nehéz ilyen egyenletesen vékony metszeteket készíteni, a tapasztalat szerint azonban a 2-3 sejtréteg vastagságú metszetek is eléggé átlátszóak, és jól vizsgálhatók. Azt, hogy a vastagabb metszetről is éles képet kapunk, a mikroszkóp objektívjeinek csekély mélységélessége magyarázza, ugyanis ennek tulajdoníthatóan a vastagabb metszetből, különösen erősebb nagyítású objektívvel, csak egyetlen szintet látunk élesen. A tubus emelésével és süllyesztésével egymás után állíthatjuk élesre a jól megvilágított metszet egymás alatt fekvő sejtrétegeit. Az éppen élesre állított szintet optikai metszetnek nevezzük. A vizsgálhatóság és a szerkezeti elemek közti reális viszony megfigyelése szempontjából fontos, hogy a metszet ne legyen ferde, hanem pontosan a kellő irányba haladjon. Ezért nagyon kell ügyelni arra, hogy milyen pozícióban áll növényi anyagunk és a metszőeszköz, egyiküket sem szabad ferdén megdőltve tartani, ezért jó, ha a metszési sík pontosan szemünkkel egy irányban van. A szervek metszésében két előirt irány van, így készíthetünk keresztmetszetet és hosszmetszetet, ez utóbbinak pedig két változata ismeretes. KERESZTMETSZET (1. ábra) esetében a metszetet a szerv hossztengelyére merőlegesen készítjük, és a szerv magasságának egy adott szintjén, a szerv teljes vastagságában, szélétől a közepéig, áttekinthetjük az összes szerkezeti alkotórészt, természetes oldalirányú egymásutániságában. Ezzel magyarázható, hogy a növényanatómiai vizsgálatok céljából leggyakrabban keresztmetszeteket készítünk. HOSSZMETSZET készítésekor a növényi anyagot hossztengelyével párhuzamosan vágjuk át. Hengeres szervek (gyökér) szár, virágkocsány, egyes magvak és termések esetében kétféle hosszmetszetet készíthetünk. Ha a szerv középpontján áthaladó hossztengely beleesik a metszés síkjába, sugárirányú vagy RADIÁLIS hosszmetszetről (1. ábra) beszélünk, és ekkor a szervrész két ellentétes oldalsó felülete között egymás mellett felsorakozva látjuk oldalnézetben az összes szerkezeti elemet (a szerv külseje és középpontja között). 2

3 Ha a metszet csak párhuzamos a központi hossztengellyel, de ezen nem halad át, mert a felülettől egy bizonyos távolságra (a szerv szélességének egy adott szintjén) hatol keresztül, akkor érintőirányú vagy TANGENCIÁLIS hosszmetszetről (1. ábra) beszélünk. Ebben az oldalfel-lettöl egy adott távolságra levő egyetlen szövettípus elemeit láthatjuk oldalnézetben. A ferde metszetek, bármilyen vékonyak is legyenek, használhatatlanok, mert bennük a sejtek és szövetek képe nagyon zavaros és torzult. Nem vizsgálhatok jól az egyenlőtlen vastagságú, helyenként vékonyabb és helyenként sokkal vastagabb metszetek sem, a metszés síkjától függetlenül. 1. ábra: A metszetkészítés alapvető irányai Jó metszetek készítésének elsőrendű feltétele a tökéletesen vágó, új zsilettpenge, illetve a jól kiélesített borotva, amelynek éle még erősebb nagyítással nézve is egyenes é egyenletes. Ha az él nem elég egyenletes, az egyenetlenségek szétroncsolják a metszetet. A borotvát vagy a zsilettpengét metszetkészítés után azonnal szárazra kell törülni, mert a rajta maradó vízcseppektől és növényi nedvektől rozsdásodik és megfoltosodik. Közvetlenül metszhetünk zsilettpengével vagy borotvával kézben tartva minden olyan anyagot, amely elég nagy ahhoz, hogy bal kezünkben metszésre alkalmas módon stabilan tarthassuk, nem annyira vékony, lágy és hajlékony, hogy a penge éle elöl görbüléssel kitérne, és nem túlságosan kemény. A lágyszárú növények kifejtett gyökere, szára és a fásodó növények fiatal, tehát nem nagyon kemény ágai és gyökerei általában közvetlenül kézben tartva metszhetők. A nagyobb stabilitás érdekében az alkarunkat a könyök közelében az asztal szélére támaszthatjuk, miközben a bal kezünk első három ujja közé szorított növényi rész metszési felületét, és a jobb kezünkben vízszintesen tartott metszőeszközt a szemmagasságba emeljük. Vékony levelek, nagyon vékony és puha szárak, gyökerek, virágelemek, apró magvak stb. csak ügy metszhetők sikeresen, ha ezeket valamilyen jól vágható, homogén szerkezetű ellenállóbb (de nem túl 3

4 kemény) anyaggal vesszük körül, vagyis ebbe beágyazzuk. Ez lehetővé teszi az apróbb szervek kézbentartását, ugyanakkor megakadályozza azt, hogy a puha, hajlékony szövetek kitérjenek a penge éle elöl. Kézi metszéskor a leggyakrabban használt beágyazó anyag a bodzabél, vagyis a bodzafa ágának elhalt parenchimasejtekből álló, száraz és fehér bélszövete. Ehhez olyan, lehetőleg száraz, ősz végén, illetve télen begyűjtött, 2-3 éves ágat válasszuk, melynek már száraz bélszövete 1-2 cm átmérőjű. Az ágat kb. 2-3 cm hosszú darabokra vágjuk (amekkora a hossza a metszendő növényi anyagnak), majd a kérget és a farészt éles késsel teljesen lehántjuk a bélszövetről. (A rajta maradó kemény rostok csorbítják a pengét.) Az így nyert bodzabelet az asztalra fektetjük, és zsilettpengével óvatosan hosszában két egyenlő félre vágjuk (sima vágásfelülettel), vagy sugárirányban behasítjuk. Bodzabél hiányában használhatjuk a napraforgószár bélszövetét is, esetleg egy homogén, lyukak nélküli, puha parafa dugót. A metszendő anyagot az átvágott vagy behasított bodzabél darabjai közé fogjuk úgy, hogy a bodzabélből felül az anyagnak csak kis része álljon ki. Hengeres szervek esetében, ha keresztmetszetet szándékozunk készíteni a szervdarabot úgy helyezzük el, hogy hossztengelye párhuzamos 1egyen a bodzabél hossztengelyével. Hosszmetszet készítésekor a szerv tengelye merőleges a bodzabél hossztengelyére. Ha az anyag vastagabb, és felülete domború, amikor kézben tartjuk a bodzabél két szemben álló sík metszésfelületét, nem engedi egymáshoz simulni, ezért ilyenkor előzetesen a szerv vastagságának megfelelő mélyedést (vájatot) készítünk a két bodzabélfél metszésfelületén az anyag számára úgy, hogy megfelelő alakú eszközzel (pl. a bonctű oldalával) benyomogatjuk a bodzabelet. Metszetkészítéskor a vizsgálandó anyagot pontosan függőlegesen vagy vízszintesen, és sohasem ferdén tartva bal kezünkbe fogjuk, és a jobb kezünk hüvelykes mutatóujja között pontosan vízszintesen tartott zsilettpengével egyenletesen vékony szeleteket vágunk le róla. A pengét mindig kívülről magunk felé húzzuk át az anyagon, folyamatos és egyenletes mozdulattal (nem szakaszosan nyiszitelve). Bodzabélbe ágyazott anyag esetében előbb a bodzabél egyik felén át kezdjük a metszést, hogy kezünk szokja meg keményebb állagát, majd végighaladunk a pengével a növényi anyagon és a bodzabél másik felén is. A metszetek készítése előtt természetesen leegyenesítjük a metszendő felületet. Arra is ügyeljünk, hogy a vágó mozdulatot ne csupán csuklónkkal végezzük, hanem egész jobb alkarunkkal. Metszéskor figyelmünket arra kell összpontosítanunk, hogy a metszet ne legyen ferde, és hogy minél vékonyabbra sikerüljön. Ha borotvát használunk, akkor pengéjét a nyélhez viszonyítva fokos szögben kinyitjuk, és nyaki részét jobb kezünkben alulról hüvelykujjunkkal és felülről (a nyéllel való ízesülés szintjén) a többi ujjunkkal rögzítjük. A borotvának természetesen a sík felületét irányítjuk lefele, a metszendő tárgy felé, miközben az éle felénk néz. Nagyon kell ügyelni, nehogy metszés közben valaki meglökje kezünket, és kerülni kell a hirtelen mozdulatokat. Metszés közben a zsilettpengét vagy borotvát nem nyomjuk rá az anyagra, hanem laza mozdulattal húzzuk végig rajta az élét egyik végétől a másikig, magunk felé. A túl kemény, erősen fásodott növényi anyagot metszetkészítés előtt ajánlatos megpuhítani. Ezt például 4

5 ügy érhetjük el, hogy 130 C-ra felmelegített, néhány csepp tömény sósavat tartalmazó trietilén-glikolba süllyesztjük az anyagot kb. 20 percre, majd csapvízzel lemossuk. A túl puha növényi anyag keményebbé, merevebbé tehető 96 %-os etil-alkoholban történő 24 órai állással) ellenben az alkohol elszínteleníti és törékenyebbé teszi az anyagot. A megfelelően vékony, átlátszó vagy áttetsző metszetek rendszerint a zsilett vagy a borotva pengéjén maradnak, és innen úgy gyűjtjük össze őket, hogy a pengét óvatosan átvesszük bal kezünkbe (anélkül azonban, hogy a metszendő tárgyat elengednénk), majd a metszeteket a bonctű megnedvesített oldalához érintve, lándzsatűvel vagy nedves, puha ecsettel levesszük a pengéről, és azonnal vízzel vagy festékoldattal, illetve rögzítőszerrel telt óraüvegbe vagy egyéb edénybe helyezzük. A levegőn hagyott vékony metszetek nagyon gyorsan kiszáradnak, összerücskösödnek és használhatatlanná válnak. A festés A kongövörös és krizoidin keverékével történő szimultán kettős festés az egyik legjobb festési módszer friss növényi mikroszkópi készítményék tanulmányozásához, mert a különböző vegyi összetételű sejtfalak élénkpiros és sárga színeződése élesen elkülöníthető, és így nagyon könnyen megkülönböztethetők egymástól a növényi szervek felépítésében egymással társuló szövettípusok. Ezen kettős festés alkalmazásával jól elkülöníthető mikroszkópi vizsgálatkor: 1.) a kétféle szállítószövet, mely gyakran vegyes nyalábokba csoportosul (a háncs pirosra színeződik, a faedények falai barnássárgákká válnak); 2.) a kétféle szilárdító szövet (a kollenchima pirosra, a szklerenchima citromsárgára festődik); 3.) a fellogén által létrehozott kétféle másodlagos szövet (a paraszövet világosbarna, a felloderma sejtfalai sötétpirossak lesznek); 4.) a kétféle elsődleges védőszövet (a rizodermisszel ellentétben az epidermisz külső felületén jól láthatóvá válik az élénk világossárgára színeződő kutikula); 5.) a parenchimák pirosra színeződő sejtfala éles kontrasztot biztosit a sejtekben gyakran jelenlevő plasztiszok zöld, narancssárga vagy csillogó fehér színével. A fentiek alapján a kongóvörös és krizoidin keverékét alapvető festékként tekintjük és leggyakrabban használjuk növényi szövettani és szervtani vizsgálatainkban. Megjegyezzük, hogy állandósított készítményekben a kongóvörös által biztosított piros színeződés az évek során fokozatosan elhalványodik. A kétféle festékanyagoldat külön készül, majd összekeverjük őket és elegyükbe süllyesztjük be a megfestendő növényi készítményeket. Az oldat úgy készül, hogy 3g pornemű kongóvöröset feloldunk 100 ml desztillált vízben, majd hozzáadunk 5 ml koncentrált ammónium-hidroxidot, és jól összerázzuk. A kongóvörös a cellulóz sejtfalakat festi élénk pirosra, ha pedig egyes sejtek nyálkaanyagokat 5

6 (mukopoliszacharidokat) tartalmaznak, akkor ezek világospirosra színeződnek. A kallózt, mely szintén szacharid típusú vegyület, ugyancsak vörösre festi (pl. a rostalemezek pórusai körül). A krizoidin oldat ügy készül, hogy 0,1 g krizoidinporhoz 12 ml 96%-os etil-alkoholt adunk és két napig oldjuk benne, időnként alaposan kavargatva. Vízben nem oldódik és kifejezetten lipofil vegyület. A lipid jellegű, hidrofób sejtfalanyagokat festi meg: a lignint és a kutint világossárgára, a szuberint pedig sárgásbarnára. Teljes feloldódás után a kongóvörös és a krizoidin oldatait a fenti mennyiségekben (105 ml kongóvörös oldat + 12 ml krizoidinoldat) egybeöntjük, alaposan összekeverjük, 2 napig állni hagyjuk, hogy az esetleges zavaró anyagrészecskék kiváljanak az oldatból, majd kettős gézrétegen átszűrjük jól záró dugóval ellátott barna üvegbe. FESTÉSKOR pipettával kiveszünk az üvegből 3-4 csepp festéket, óraüveg közepére helyezzük, és belesüllyesztjük a megfelelően vékony növényi anyagot. Ezt 1-3 percig festjük, majd a festékfölösleget egy Petri-csészében bőségesen rendelkezésre álló tiszta csapvízben alaposan kimossuk a készítményből. A festékcseppek kipipettázása után a festékes edényt visszazárjuk, hogy az alkohol ne párologjon el a festékoldatból. Ha ez megtörténik (mert nyitva hagytuk az edényt), akkor a krizoidin egy része barna tűkristályok formájában kicsapódik és leülepedik, ilyen esetben friss festékoldatot kell készíteni. A helyesen elkészített festékkeverék jól zárható barna üvegben hűvös helyen hosszú ideig tárolható. 6

7 I. LABORGYAKORLAT A MIKROSZKÓP FELÉPÍTÉSE, KÉPALKOTÁSA ÉS HASZNÁLATA A LABORATÓRIUMI VIZSGÁLATOK SORÁN. MIKROSZKÓPOS MÉRÉS. 1. A mikroszkóp története Robert Hooke ( ), a biológia történetébe a Micrographia, 1665-ben megjelent könyvével írta be magát. Hooke összeállította az akkor egyik legkorszerűbbnek számító mikroszkópot, amelynek megvilágítása is volt. Ezzel fedezte fel a növényi sejteket, mint a parafa elhalt sejtjeit és vezette be a cella, cellula kifejezéseket. 1. ábra Hooke mikroszkópja 2. ábra Hooke által megfigyelt sejtek Antony van Leeuwenhoek ( ) saját maga készített mikroszkópjával, amely koránt sem volt olyan korszerű mint a Hooke által készített, különböző megfigyeléseket végzett, megihlette kortársa Micrographa című könyve. Apró élőlényeket: baktériumokat és protozoákat figyelt meg készülékével. 7

8 3. ábra Leeuwenhoek mikroszkópja 2. A mikroszkóp felépítése 2.1. Optikai vagy fénymikroszkóp Az optikai vagy fénymikroszkóp egy összetett nagyítórendszer, mely több százszorosan nagyított és egészen apró részleteket is elkülönítő képet ad a megfelelően előkészített vizsgálati tárgyról. Felépítésében mechanikai és optikai alkotórészek találhatók (4. ábra), a modern mikroszkópok pedig képernyővel és fényképezőgéppel is el vannak látva. Mechanikai alkotórészek: 4. ábra: A fénymikroszkóp fő részei (Fodorpataki László, 2001) a) Mikroszkóp talpa: mely fémből készül, és súlyának tulajdoníthatóan stabilitást biztosít; benne található a fényforrásként szolgáló izzólámpa henger alakú lámpaháza, a mikroszkóplámpa elé rögzített gyűjtőlencse és egy téglalap alakú, ferdén álló tükör, melynek helyzete a talpon levő két csavarral változtatható, és amely a fénysugarakat a talpon levő, üveggel fedett nyílásra, a fénykapura irányítja; a fénykapu egyben színszűrőként is szolgál; b) Mikroszkóp oszlopa: szintén fémből készül, többé-kevésbé függőleges helyzetű, és a tárgyasztal, a tubus, a kondenzor, valamint a makro- és mikrométercsavar rögzítésére szolgál; c) Tárgyasztal: a vizsgálandó tárgyat tartó tárgylemez rögzítésére és vízszintesen tartására szolgál, közepén pedig egy nyílás van, melyen az alulról érkező fény megvilágíthatja a tárgyat; a tárgylemez 8

9 rögzítésére rugalmas lemezből készített, oldalirányban is mozgatható, részben fémkeretből képzett csíptető vagy szorítólemez szolgál. A tárgyasztal egyik oldalán a rögzítőkerethez vagy magához a tárgyasztalhoz kapcsolódó két csavar található, melyek segítségével a tárgylemez jobbra-balra és előrehátra mozgatható a tárgyasztal síkjában; d) Tubus: a mikroszkóp nagyítórendszerét tartalmazza, szabványos hosszúságú (160 vagy 170 mm), egyenes vagy hajlított cső, mely belül fekete színű, hogy a tükröződést gátolja. A megtört változat előnyösebb, mert ülő helyzetben kényelmesebben bele lehet nézni az okulárba. A megtört tubusban a fény útját prizmarendszer töri meg, és a prizmalencse nagyító képességét figyelembe kell venni az össznagyítás kiszámításakor; e) Revolver: a tubus alsó végéhez kapcsolt forgatható korong, mely az objektíveket tartalmazza (ezek kiés becsavarhatók); f) Makro- és mikrométercsavar: az oszlop egyik oldalán vagy mindkét oldalán szimmetrikusan, egy nagyobb és egy kisebb csavar található: az előbbi a makrométercsavar, mely durvább, nagyobb mértékű függőleges mozgással változtatja a tárgyasztal és az objektív közti távolságot, az utóbbi pedig a mikrométercsavar, melynek forgatásával élesre állítható a kép a tárgy és az objektív közti távolság nagyon kis változásaival; Optitai alkotórészek: a megvilágító rendszerbe és a nagyító rendszerbe sorolhatók be. A megvilágító rendszer részei: a fényforrás, a tükör, a kondenzor és az esetlegesen alkalmazható színszűrők. a) A fényforrás az újabb mikroszkópoknál kisfeszültségű (pl. 6V-os) izzólámpa, ezért a mikroszkóp csak megfelelő transzformátorral kapcsolható a hálózati áramkörhöz. A jó fényforrás egyenletesen és erősen világítja meg a látóteret. Természetes fényt (napfényt) ma már ritkán használnak, mert nem elég erős, nem biztosít állandó megvilágítást, bizonyos napszakhoz és helyhez köti a mikroszkóp használatát. Az izzó fénysugarait az előtte álló gyűjtőlencse párhuzamossá vagy kissé összetartóvá teszi, a síktükör pedig felfele irányítja a kondenzorhoz. b) Kondenzor: rövid fókusztávolságú, összetett gyűjtőlencserendszer, mely a fénysugarakat a tárgyasztal nyílásán át a vizsgálandó tárgyra összpontosítja. Minél nagyobb nagyítású objektívet használunk, csavarja segítségével annál feljebb emeljük (alulról a tárgyhoz közelítjük) a kondenzort, azért, hogy a vizsgálandó tárgy kisebb részét vagy részletét minél jobban megvilágítsa. A kondenzor legfelső lencséje a frontlencse, melynek, ha középső részét letakarjuk, a szélső részen kilépő fénysugarak segítségével sötét látóteres vizsgálatokat is végezhetünk. A legelterjedtebb típusú, ún. Abbé-féle kondenzor tartalmaz egy oldalirányban eltolható színszűrőtartó keretet, valamint egy zárható-nyitható apertúrarekeszt (diafragma vagy írisz). A nagyító rendszer: részei az objektívek és az okulárok. c) Objektív vagy tárgylencse: kis fókusztávolságú, összetett lencserendszer, mely az alatta elhelyezett, átvilágított tárgyról nagyított, fordított, valódi képet továbbít az okulár felé. Minden objektív több 9

10 optikai lencséből áll, és ezek közül a tárgy felé néző, síkdomború (plánkonvex) lencse a frontlencse. Ennek a tárgy felőli felülete sík, a másik erősen domború. Minél kisebb a frontlencse átmérője, annál kisebb a fókusztávolsága és annál fokozottabb a nagyító képessége. Az objektív fényköpenyében a frontlencse feletti lencsék a különféle lencsehibák (színi és gömbi eltérések) kiiktatására szolgálnak. A lencsék, illetve lencsepárok közötti távolságot nagy pontossággal szabályozzák, és ha csak az egyik is elmozdul, az objektív használhatatlanná válik. Ezért nem szabad az objektívnek érintkeznie (pl. tisztításkor) olyan anyaggal, amely feloldhatja a lencséket összetartó ragasztót. Az objektív fémköpenyén bizonyos jelölések találhatók. Fel van tüntetve: a gyártási szám és a gyártó cég neve, a nagyítási fok (pl. 40X), közvetlenül utána a numerikus apertúra vagy nyílás szám (pl. 0,65), egy alsóbb sorban pedig a szükséges tubushossz milliméterben (ahhoz, hogy a képet az okulár számára megfelelő síkba vetítse; pl. 160), és nagyobb nagyítású, a tárgyhoz nagyon közel kerülő objektívek esetében a használható fedőlemez maximális vastagsága milliméterben (pl. 0,17). Ezek mellett az objektíven egyéb betűjelzések is lehetnek, melyek a minőségre vonatkoznak. Az Apo felirat azt jelenti, hogy az objektív apokromát, vagyis nem okoz színeltérést, mert három színhibára javított. A HI, I, Im vagy Oel jelzés arra utal, hogy immerziós objektívről van szó, azaz csak immerziós olaj alkalmazásával lehet a tárgyat vizsgálni. A Pol jelzésű objektív polarizációs vizsgálatokra alkalmas, a Ph vagy Phv jel pedig a fáziskontraszt objektíveken található. d) Okulár vagy szemlencse: a mikroszkóp tubusának felső végében található. Az újabb mikroszkópok binokulárisak, vagyis két okulárral rendelkeznek, hogy mindkét szemmel lehessen nézni a vizsgálandó tárgyat. A két okulár közötti távolság változtatható a személyek pupillatávolságának függvényében azért, hogy egységes képet lássunk. Az okulár két síkdomború lencsébő1 áll, a sík felület szemünk felé, a domború felület pedig a tárgy felé tekint. A két lencse között gyűrű alakú fényrekesz található a szélső fénysugarak kiszűrésére. Felső lencséje a nagyító, az alsó pedig a gyűjtőlencse, amely az objektívből jövő fénysugarakat összetartóbbá teszi. Minél kisebb a szemlencse átmérője és a fókusztávolsága - így a fémfoglalat hossza is - annál fokozottabb a nagyítóképessége. Az okuláron fel van tüntetve a nagyítás mértéke (7X, 10X vagy 15X). Az okulár egyszerű nagyítóként működik, amely az objektív által szolgáltatott - tehát már fordított állású és jelentősen felnagyított - képről egyenes állású, nagyított, virtuális (képernyőre ki nem vetíthető) képet ad. Mivel az okulár nem fordítja vissza az objektív által fejjel lefele állított képet, a mikroszkópba nézve a tárgy fordított állású képét látjuk. Lencserendszerének tulajdonítható a feloldóképesség mellett az optikai mikroszkóp két másik fontos tulajdonsága is: a nagyítóképesség és a penetrálóképesség (a kép mélységélessége). A mikroszkóp nagyítóképessége: egyenlő az alkalmazott objektív nagyításának, az okulár nagyításának és az esetleges tubusbeli prizmalencse nagyításának a szorzatával. Ennek ismeretében kiszámítható, 10

11 hogy az optikai mikroszkóp maximális nagyítóképessége, immerziós objektívet használva 2700-szeres (120X15Xl,5), leggyakrabban azonban nem nagyobb, mint 1600-szoros. A kép mélységélessége: vagyis a mikroszkóp penetrálóképessége a képen élesen látszó legközelebbi és legtávolabbi tárgyrészlet közti távolság az optikai tengely mentén mérve, és kifejezi, hogy az objektív a tárgy felületének magasságában és mélyebben levő részleteiről egyaránt tud képet adni Sztereoszkópikus vagy preparáló mikroszkóp Apró növényi szervrészek (pl. magházak, magkezdemények, gyökércsúcsok, rügyek, mirigyek stb.) kipreparálásához, apró állatok vizsgálatához sztereoszkópikus mikroszkópot használunk, melynek előnye az egyenes állású kép, a térbeli (sztereoszkópikus) látás biztosítása, valamint az objektívek elég nagy szabad tárgytávolsága, ami lehetővé teszi a különböző preparáló eszközök (csipeszek, bontótűk) akadálymentes mozgatását. Az egyenes állású képet olyan képfordító, teljes visszaverődésű prizmákból álló rendszer hozza létre, amilyen a közismert kiránduló látcsövekben ( prizmás látcsövekben) is van (ún. Porro-prizmák). 5. ábra: Sztreoszkópikus preparáló mikroszkóp a. tárgyasztal; b. fényforrás; c. tárgylencse; d. beállító csavar; e. szemlencse (Róbert Endre,1984). A nagyobb szabad tárgytávolság biztosítása céljából a preparáló mikroszkópok gyengébb objektívekkel vannak felszerelve, a kellő összenagyítást pedig erősebb okulárok használatával érjük el. A sztereoszkópikus mikroszkóp használható mind áteső fényű, mind ráeső fényű (felső) megvilágítással. Áteső fénnyel való megvilágításra a régebbi változatoknál az asztal alatt elhelyezett tükör, az újabbaknál 11

12 pedig beépített fényforrás (kisfeszültségű izzólámpa) szolgál. A felső (ráeső fényű) megvilágítás céljára egy ív alakú vagy csuklós karon mozgatható és különböző helyzetekben rögzíthető mikroszkóplámpa áll rendelkezésre. A lámpatartó kar a tárgyasztal fölött körbe forgatható, a lámpa pedig le-fel mozgatható. Így a felső megvilágítást bármely oldalról, tetszés szerinti szögben lehet a tárgyra irányítani. A gyenge nagyítás a mikormétercsavart fölöslegessé teszi, az élesre állítás makrométercsavarral végezhető. Az újabb sztereomikroszkópoknak egyetlen (közös) objektív frontlencséjük van, ami egy nagy átmérőjű síkdomború lencse. 3. Az optikai vagy fénymikroszkóp képalkotása Úgy valósul meg, hogy a fényforrásból kiinduló fénysugarakat a tükör a kondenzoron keresztül a megfelelően vékony (a fény által átjárható) tárgyra vetíti, az objektív a fókuszpontján kívül levő tárgyról nagyított, fordított állású, valódi képet hoz létre, amelyet az okulár tovább nagyít, és végül fordított állású és virtuális (látszólagos) kép keletkezik. A tubushossz úgy van beállítva, hogy az objektív a tárgy képét az okulár tárgy felőli fókuszpontjába vetíti. Ez a kép az okulár számára olyan, mintha a tárgy lenne, és az erről alkotott képet a nagyítóként működő okulár a végtelen felé vetíti ki. Így az okulárból kilépő képet nem foghatjuk fel képernyőre, de a végtelenbe való nézésre akkomodálódott szemünkkel élesen látjuk. (Szemlencsénk ilyenkor ellaposodik, azaz olyan görbületet vesz fel, mint amikor a távolba nézünk.) Az általunk látott kép a tárgyhoz képest fordított állású, mert az objektív által létrehozott közbenső kép is az, ezt pedig az okulár azonos állásban mutatja. 4. A mikroszkóp használata A mikroszkóp használata során először is bekapcsoljuk a mikroszkóp talpában levő izzólámpát. Benézünk mindkét szemünkkel egyszerre a két okulárba, úgy hogy egyetlen kerek látóteret lássunk, és ellenőrizzük, a látótér egyenletesen és eléggé erősen meg van-e világítva. Szükség esetén a mikroszkóp talpából félig kiálló csavar, valamint a tükröt mozgató két csavar segítségével módosíthatjuk a látóteret megvilágító fényt. A vizsgálatot mindig a kis nagyítású objektívvel kezdjük (6x-os vagy 10x-es objektív). A tárgylemezt, melyen a fedőlemezzel letakart vizsgalati tárgy található, rögzítjük a tárgyasztalon, majd az oldalcsavarok segítségével a tárgyat beállítjuk az optikai tengelybe, a tárgyasztal nyílása föle. Ha a tárgy nagyon kicsi, a kondenzort a felső határig emeljük, és szabad szemmel oldalról nézve beállítjuk a tárgyat az erős fénynyaláb irányába, majd lesüllyesztjük a kondenzort. Ezután oldalról nézve a tárgyasztalt (anélkül) hogy az okulárba néznénk), a makrométercsavar segítségével a tubust lefele engedjük, amíg az objektív frontlencséje 1-3 milliméternyire megközelíti a fedőlemezt. Csak ezután nézünk az okulárokba, majd a makrométercsavarral a tubust lassan fölfelé emeljük mindaddig, amíg a tárgy képe megjelenik szemünk 12

13 előtt. Ekkor már nem járunk többé a makrométercsavarral, hanem a mikrométercsavar élőre vagy hátrafele történő csavargatásával a lehető legélesebbre állítjuk a képet. A vizsgálódás egész ideje alatt egyik kezünket a mikrométercsavaron tartjuk, hogy az újabb és újabb területrészeket mindig élesen lássuk és a mélységélességet is átállíthassuk. Amikor a kis nagyítású objektívvel már átnéztük az egész készítményt, és leválogattuk a legjellegzetesebb részét, amelyet a látótér középpontjába állítunk, áttérünk nagyobb nagyításra úgy, hogy a revolver elforgatásával a következő objektívet hozzuk a tárgy fölé. Az objektív akkor van az optikai tengelyben (és tud képet továbbítani), amikor egy kis kattanást hallunk az átfordítás során. Normális esetben a mikroszkóp objektívvel összehangoltak, vagyis a tubus felemelése nélkül, csupán a revolver elforgatásával egyből bejön a kép a nagyobb nagyítású objektívre való áttéréskor, és ez akármilyen közel is kerülne a tárgyhoz nem érintkezik a fedőlemezzel. Tehát nagyobb nagyításra való áttéréskor egyáltalán nem nyúlunk a makrométercsavarhoz, hanem a létrejött képet az új objektív esetében is újra élesre állítjuk a mikrométercsavar segítségével. A fenti eljárás alól kivételt képez az immerziós objektív alkalmazása, melyet oldalról nézve nagyon óvatosan és lassan kell a makrométercsavarral lefele engedni, amíg a frontlencse eléri a készítmény fölé, a fedőlemezre helyezett immerziós olajcseppet. Ezt a pillanatot a lelapuló olajcseppben észlelhető félvillanásszerű jelenség jelzi. Ezután ez esetben is a mikrométercsavarral állítjuk élesre a képet. Erősebb nagyítású objektívvel való vizsgálatra térve a kondenzort is felsőbb állásba hozzuk úgy, hogy a látótér egyenletesen és megfelelő fényerősséggel legyen megvilágítva - a szélek ne legyenek homályban, és a látótér középrésze ne legyen vakítóan fényes. Ha a tárgylencsék összehangoltak és a fedőlemez az előirt vastagságú, egyszerűen átfordítjuk a következő nagyítású fokozatú objektívet. Ellenben, ha az objektívek nincsenek összehangolva, akkor a kis nagyításnál alkalmazott eljárást meg kell ismételni, vagyis újra oldalról kell nézni a tárgyat, miközben a tubust majdnem ütközésig a fedőlemez síkja fölé engedjük le. Ezután belenézünk az okulárokba és a tubust addig emeltük nagyon lassan fölfelé, amíg a kép meg nem jelenik a látótérben, majd a mikrométercsavarral elvégezzük az élésre állítást. 5. Az optikai mikroszkópos mérés A mikroszkópos mérés a mikroszkópban megfigyelt szerkezetek valódi méretének a meghatározását teszi lehetővé. A vizsgált objektumok (pl. sejtek) legtöbbször nagyon kis méretűek. A mikroszkópikus világ mérésének alapegysége a mikron ( - mű), amely a milliméter ezredrésze: 1 = 10-6 m = 10-3 mm = 0,001 mm. Használjuk még a millimikront (m ) vagy nanométert, amely a mikron ezredrésze: 13

14 1m = 0,001 = 10-9 m = 10-6 mm = 0, mm A millimikron tizedrészét Angström-nek nevezzük, jele Å. 1 Å = 0,1 m = m. (10 m = 1 Å) A mikroszkópos mérés speciális beosztásos skálával rendelkező tárgylemez (tárgymikrométer) és okulárkorong (mérőokulár) segítségével történik. 1.) A mérőokulárt a mikroszkóp jobb okulárjának a helyébe tesszük, vagy pedig a jobb okulár felső, csavarmentes részének a kiemelésével behelyezzük az okulár tubusának belső átmérőjével megegyező szélességű okulár-mikrométerkorongot. Ennek középvonalában 100 egyenlő részre osztott skála található. A mérőokulár skáláján egy beosztásnak más-más nagyítású objektívvel használva más-más hosszérték felel meg, ezért a mérés előtt minden objektív esetében meg kell állapítani a mérőokulár mikrométer-egyenértékét (kéttizedesnyi pontossággal). 2.) A mikrométer-egyenérték megállapítása a tárgymikrométer segítségével történik, ami egy tárgylemez nagyságú, közepén finom beosztást viselő üveglap, és a készítmény helyére a mikroszkóp tárgyasztalára rögzítjük. A tárgymikrométer üveglemezének közepén 2 milliméter hosszúságban 0,01 milliméterenkénti beosztások vannak, tehát a tárgymikrométer skáláján két egymás utáni beosztás közti távolság mindig 10 mikrométer. A mikrométer-egyenérték megállapításakor a mérőokulárt és tárgymikrométert, miután az okulárba nézve mindkettőnek a skáláját egyidőben élesen látjuk, egymással párhuzamba állítjuk (az okulár forgatásával és a tárgyasztalon levő tárgymikrométer mozgatásával) úgy, hogy részben fedjék egymást, és skáláik 0 (nulla) pontjai egybeessenek (a mérőokulár skálája legyen kissé a tárgymikrométer skálája fölött). Ekkor megnézzük, hogy a két párhuzamos skálán melyik két beosztás esik pontosan egybe a zéruson kívül. Ha például a 100. okulárbeosztás egybeesik a 43. tárgymikrométer-beosztással, akkor ez azt jelenti, hogy a mérőokuláron 100 beosztás megfelel 430 mikrométernek, vagyis az adott objektívvel az okulármikrométer skálájának egy beosztása 4,30 mikrométernek felel meg. (1 beosztás = 4,3 ) Ezek ismeretében a tárgymikrométer helyébe a mikroszkóp asztalára ráhelyezzük a vizsgálandó preparátumot, és a vizsgált rész hosszát átfedő okulárskála-beosztások számát megszorozva a mikrométer-egyenértékkel (egy beosztásköz valós hosszával), megkapjuk az illető tárgy méretét, amit mikrométerben fejezünk ki. Példa: egy sejt átmérője 5 okulárskála-beosztásnk felel meg és a mikrométer-egyenérték = 4,3. Ilyenkor tehát a sejt átmérője = 5 x 4,3 = 21,5 Méréskor a mérőokulárt úgy forgatjuk, hogy skálája a mérendő anyag két végpontja között haladjon át, és leolvassuk a vizsgált tárgy által átfedett beosztások számát (úgy, mint egy vonalzón). 14

15 II. LABORGYAKORLAT A GYÖKÉR ELSŐDLEGES SZERKEZETE A KÉTSZIKŰEK KÉPVISELŐINÉL, A RÉTI BOGLÁRKÁNÁL 1. A gyakorlat célja - metszeteket készíteni és megismerni a gyökeret felépítő szöveteket, sejteket - a gyökér szerkezete (szövetek) és a működése (a víz és a benne oldott sók felvétele és szállítása, tápanyag raktározás, egyes anyagok pl. alkaloidok szintézise) közötti összefüggések feltárása, megértése 2. Szükséges eszközök Binokuláris mikroszkóp ( x nagyítás), tárgylemez, fedőlemez, Petri-csésze, óraüveg, csipesz, bonctű, éles borotva vagy penge, kongóvörös-krizoidin, vizes glicerin, réti boglárka gyökér, nőszirom gyökér, bodzabél. 3. A gyakorlat menete A réti boglárka (lásd 1 ábra) gyökér csúcsától néhány milliméterre kezdődő és kb. 1 cm hosszú, szabad szemmel is felismerhető gyökérszőrök övezetéből és a fölötte folytatódó, hosszabb, érdes övezetből, bodzabélbe ágyazva, jól vágó pengével vagy borotvával több egyenletesen vékony keresztmetszetet készítünk, ügyelve, hogy a perifériától a középpontig sehol se hatoljunk ferde síkban az anyagba. A szinte átlátszó metszeteket bonctű segítségével (anélkül, hogy átszúrnánk őket), néhány percre az óraüvegben levő festékbe süllyesztjük (ügyelve, hogy ne a festék felületén ússzanak). Célravezető a kongóvörös és krizoidin keverékével, a toluidinkékkel, a jódozott cink-kloriddal, a metilénkék és ruténiumvörös keverékével vagy a kármin és jódzöld keverékével történő festés. Festés után a metszeteket jól ki kell mosni, majd a legvékonyabbnak látszó 4-5 metszetet tiszta tárgylemez közepére helyezett nagy vízcseppben vagy vizes glicerinben, fedőlemezzel buborékmentesen lefedve előbb 10X-es objektívvel, majd az egyes szöveti elemeket 20X-os nagyítással, az endodermiszt pedig 40X-essel is tanulmányozzuk. A legsikerültebb készítményt a mikroszkópból lerajzoljuk, majd állandósítjuk megolvasztott glicerines zselatinba ágyazva, ügyelve, hogy lefedéskor ne kerüljenek levegőbuborékok a fedőlemez alá. 15

16 1 ábra. A réti boglárka (forrás: Az elsődleges szerkezet tanulmányozására alkalmas bármely növény gyökerének (akármelyik elágazásának) a csúcs közelében levő felszívó övezete. A harasztoknál, sok egyéves lágyszárú kétszikűnél és a legtöbb egyszikű zárvatermőnél a gyökérnek csak elsődleges szerkezete van. Az elsődleges állandósult szövetek a gyökérszőrök övezetében három egymást borító rétegbe szerveződnek a gyökér szerkezetében (felületi bőrszövet, kéregrész és központi henger), melyek a következő szerkezeti tulajdonságokat mutatják: A RIZODERMISZ a gyökér jellegzetes elsődleges védőszövete és egyben felszívószövete is. Egyetlen sejtsorból, élő sejtjei oldalirányban szorosan egymáshoz kapcsolódnak, minden faluk vékony cellulóz sejtfal. A külső sejtfalak sohasem kitinizálódnak és nem borítja őket kutikularéteg. A rizodermisz szintjén sohasem találunk sztómákat, fedőszőröket, kapaszkodó, kiválasztó vagy érző trichómákat. A rizodermisz legtöbb sejtje kifelé erősen megnyúlt és vékony, a talajrögök közé hatoló, csúcsnövekedésű, rövidéletű, egysejtű FELSZÍVÓ GYÖKÉRSZŐRÖKké alakult. Ezeket nagyon nehéz keresztmetszeti képben megfigyelni, mert könnyen elszakadnak és soha sincsenek a vízszintes metszési sík irányában egyenesen kiterülve, így csak alapi részük látható. A felszívó övezet feletti érdes övezetben már az intakt gyökéren sincsenek ép gyökérszőrök, csupán ezek elhalt és eltört alapi maradványai láthatók, sok esetben pedig az egész rizodermisz elpusztul és leválik, védő szerepét pedig az alatta levő sejtsor veszi át, mely egyben szigetel is, de felszívó működést nem végez. 16

17 Az EXODERMISZ a kéreg külső rétege, és a kétszikűekre jellemzően egyetlen sejtsorból áll. Sejtjei a felületre merőlegesen enyhén megnyúltak, hasáb alakúak, szorosan kapcsolódnak egymáshoz, és kifejlődésük során elhalnak, mert falaik szigetelő szuberinnel egyenletesen átitatódva elparásodnak. Így az exodermisz egy elsődleges parásodott szövet, bár működési szempontból védő szerepet tölt be, a kéregalapszövettel közös eredete van (az alapmerisztémából származik). A felszívó övezetben a gyökérszőrök irányában az exodermisz egy-egy sejtjének falai nem parásodnak el, hanem vékonyak és cellulóz természetűek maradnak. Ezek az ÁTERESZTÖ SEJTEK, mert rajtuk halad keresztül a gyökérszőrök által a talajból felszívott víz a benne oldott ásványi sókkal a gyökér belsőbb részei felé. Az érdes övezetben, ahol a rizodermisz már leszakadt, a gyökeret az exodermisz borítja és védi. A KÉREGPARENCHIMA a gyökérre jellemző módon nagyon vastag, sok sejtsorból áll; vékony cellulózfalú élő sejtjei aránylag nagyok, gömbölyűek vagy tojásdad alakúak, lazán kapcsolódnak egymáshoz, tehát sok közöttük a levegővel telt sejtközötti járat. Bennük nagy mennyiségű, erős fénytörésű keményítőszemcse halmozódik fel, tehát raktározó alapszövetet képviselnek. A gyökérszőrök által felszívott víz és a benne feloldott ásványi sók eléggé hosszú utat tesznek meg vízszintes irányban a sok kéregparenchimasejt belsejében, sejtfalaikban vagy ezek felületén vékony, filmszerű rétegként. Az ENDODERMISZ a kéreg legbelső, sajátosan differenciálódott sejtsora; a kéregparenchimáénál apróbb sejtjei egymáshoz oldalirányban szorosan kapcsolódnak szabályos térbeli elrendeződésben. Keresztmetszetben körgyűrű alakjában (térben hengerpalástként) veszik körül a gyökér központi hengerét. A gyökérszőrök övezetének alsó határától felfele haladva az érdes övezeten át a gyökérnyak felé, az endodermisznek három egymásutáni fejlődési stádiuma figyelhető meg a sejtfalak módosulásai alapján. Ezek közül a réti boglárka élete folyamán általában csak az első kettő alakul ki. Az ELSŐDLEGES ENDODERMISZ jellemzője, hogy a két oldalsó, valamint a felső és az alsó antiklinális sejtfalak középső harmadába egy-egy szuberincsík rakódik, ami gátat vet a víz sejtfalakban történő tovahaladásának a központi hengerbe, és a kéregparenchimából jövő teljes vízmennyiséget arra kényszeríti, hogy az endodermisz élő sejtjeinek belsejében (a szinplasztikus úton) jusson át a faedények felé. Ezeket a szuberinöveket CASPARY-FÉLE CSÍKOKnak nevezzük, keresztmetszetben pedig az endodermiszsejtek két antiklinális oldalfalának középtájékán egy-egy duzzadtabb, lencseszerű foltként, a metszet kezelése (elsősorban a rögzítéssel járó vízvesztés) során csökkenő turgeszcenciájú sejtek zsugorodásakor rücskösödő, hullámosan ráncolt Caspary-féle pontként láthatjuk nagyobb nagyítással. Az érdes övezet felé haladva az endodermisz sejtjeinek minden fala egyenletesen átitatódik szuberinnel, és így megjelenik az elparásodott MÁSODLAGOS ENDODERMISZ. A gyökér azon részében, ahol még folytatódik a vízfelszívás, a faedénynyalábok irányában levő endodermiszsejtek fala nem parásodik, vékony cellulóz sejtfalként átengedi a vizet és ezt a faedények felé irányítja, így ezeket ÁTERESZTŐ SEJTEKnek nevezzük. A KÖZPONTI HENGER vagy SZTÉLE a gyökérnek sokkal kisebb része, mint a kéreg, és a belső alapszövetbe ágyazott szállítószöveteket tartalmazza. 17

18 kéregparenchima periciklus háncsedények faedények 2.ábra. A központi henger mikroszkópos szerkezete a réti boglárkánál A PERICIKLUS a központi henger legkülső sejtsora, szorosan simul az endodermisz belső felületéhez, apró, lapos, vékony cellulózfalú élő sejtekből áll, melyek közül egyesek sokáig megőrzik merisztématikus képességüket, és fontos szerepük van az oldalgyökerek (elágazások) képződésében és a gyökér kambiuma egyes részeinek létrehozásában. Az elsődleges szerkezetű gyökér legjellemzőbb megkülönböztető szerkezeti tulajdonsága az összes földfeletti szervhez viszonyítva az, hogy a kétféle szállítószövet egyetlen ponton sem érintkezik egymással, tehát KÜLÖNÁLLÖ FANYALÁBOKat és HÁNCSNYALÁBOKat tartalmaz, melyek egymással váltakoznak és oldalirányban bélsugarak választják el őket. A kétszikűek gyökerének jellemző tulajdonsága, hogy a szállítónyalábok száma kicsi: sem a faedénynyalábok, sem a háncsedénynyalábok száma nem haladja meg a 6-ot; a boglárka gyökerében általában 4 vagy 5 fanyaláb és ugyanennyi háncsnyaláb figyelhető meg. A FAEDÉNYNYALÁBOK sugárirányban helyezkednek el; egy nyaláb keretében az elsőként létrejött, keskenyebb üregű faedényeket tartalmazó PROTOXILÉM a nyaláb külső, periciklus felöli részét alkotja, míg a fiatalabb, tágabb üregű faedényeket (pl. nagy mennyiségű ligninlerakódású gödörkés falú tracheákat) tartalmazó METAXILÉM a sztéle központja felé helyezkedik el. Tehát az elsődleges szerkezetű gyökérben az újabb faedények a már meglevőkhöz viszonyítva befelé képződnek, vagyis a xilém differenciálódási iránya CENTRIPETÁLIS, maga a xilém pedig EXARCH (az első faedény a nyaláb külső pólusán található). A faedények között helyenként keskeny, kerek körvonalú, cellulóz sejtfalú faparenchimasejtek is találhatók. A HÁNCSEDÉNYNYALÁBOK a fanyalábok között, a periciklus alatt kerek vagy ovális keresztmetszeti körvonalú szigetekként figyelhetők meg, és kongovörössel erős pirosra színeződnek. A háncsnyalábban is a protofloémet alkotó első sejtek kívül, a metafloém pedig belül helyezkedik el, de optikailag nem különíthetők el egymástól. Tehát a floém is EXARCH, differenciálódási iránya centripetális. Tágabb üregű rostacsövekből és a hozzájuk kapcsolódó, keskenyebb: szintén cellulóz sejtfalú de sűrűbb citoplazmájú kísérősejtekből áll. Habár legtöbb kétszikűnél háncsparenchimasejtek is vannak, ezek a boglárkánál 18

19 hiányoznak. A bélparenchima helyét a boglárkánál, és általában a kétszikűeknél, az elsődleges szerkezet teljes kifejlődésekor egy-egy tágüregű metaxilém-edény foglalja el. Így tulajdonképpeni bélszövet nincs a gyökér középpontjában, a xilém pedig sugárirányban elkeskenyedő ágakkal csillag alakú (az ágak a faedénynyalábok, melyek a gyökér közepén találkoznak). A bélszövetből csak a faedénynyalábok két oldalán radiálisan elhelyezkedő és periciklusig tartó parenchimatikus BÉLSUGARAK maradnak meg, enyhén megnyúlt, vékony cellulóz sejtfalú élő sejtekkel, melyek egymástól oldalirányban elválasztják a fanyalábokat a velük váltakozó háncsnyaláboktól. Így tehát a bélsugarak száma egyenlő a faedénynyalábok és a háncsedénynyalábok számának összegével. Megjegyzendő, hogy őszire a boglárka gyökerének érdes övezetében megjelenik a sztéle szintjén egy kezdetleges, részleges másodlagos szerkezet is. 19

20 III. LABORGYAKORLAT A GYÖKÉR ELSŐDLEGES SZERKEZETE AZ EGYSZIKŰEK KÉPVISELŐINÉL, A NŐSZIROMNÁL 1. A gyakorlat célja - metszeteket készíteni és megismerni a gyökeret felépítő szöveteket, sejteket - a gyökér szerkezete (szövetek) és a működése (a víz és a benne oldott sók felvétele és szállítása, tápanyag raktározás, egyes anyagok pl. alkaloidok szintézise) közötti összefüggések feltárása, megértése 2. Szükséges eszközök Binokuláris mikroszkóp ( x nagyítás), tárgylemez, fedőlemez, Petri-csésze, óraüveg, csipesz, bonctű, éles borotva vagy penge, kongóvörös-krizoidin, vizes glicerin, réti boglárka gyökér, nőszirom gyökér, bodzabél. 3. A gyakorlat menete A kongóvörös és krizoidin keverékével történő festésen kívül jó kontrasztot biztosit a szafraninnal és vezuvinnal való kettős festés is. A nőszirom (1. ábra) gyökerének keresztmetszetét ugyanúgy készítjük, mint a boglárka gyökerének esetében, és a következő szerkezeti elemeket figyelhetjük meg. 1.ábra. A nőszirom (Iris germanica) 20

21 A RIZODERMISZ egyetlen sejtsorból áll, sejtjeinek minden sejtfala pektocellulózikus jellegű. Sok sejt gyökérszőrré alakult, melyek könnyen letöredeznek. A rizodermisz alatt, az egyszikűekre jellemzően több (2-4) sejtsorból álló parásodott réteg, a KUTISZ található, a kétszikűek gyökerében levő exodermisz megfelelőjeként. Szintén a kéregparenchimával közös eredetű, a gyökérszőrök irányában minden sejtsorában ÁTERESZTÖ SEJTEK találhatók, melyek cellulóz falába nem rakódik szuberin. A rizodermisz lehullása után az érdes övezetben a kutisz borítja és védi elsődleges parásodott szövetként a gyökeret a kedvezőtlen környezeti hatásoktól (hideg, szárazság, paraziták, szennyező anyagok stb.). A KÉREGPARENCHIMA vastag rétegként sok sejtből áll, melyek rendezetlenül helyezkednek el, nem alkotnak szabályos sorokat, vékony cellulózfalúak és nagy mennyiségű tartalék tápanyagot raktározhatnak. Az ENDODERMISZ egyetlen szabályos sejtsorként veszi körül a központi hengert, és egyszikűeknél a leggyakrabban HARMADLAGOS fejlődési állapotában figyelhető meg a gyökér egész élete folyamán fennmaradó elsődleges szerkezetben. A krizoidinnel élénk világossárga színre való festődésnek köszönhetően jól megfigyelhető, hogy ezen harmadlagos endodermisz sejtjeinek antiklinális oldalfalai és periklinális belső fala (miután elparásodott és újabb cellulózréteggel gazdagodott) nagymértékben elfásodikm, jelentős mennyiségű lignin centripetális irányú lerakódása révén. Így keresztmetszetben a sejtfalak karjaival kifele mutató patkó vagy U alakban vastagodottak, a periklinális külső fal pedig sokkal vékonyabb marad. A gyökér azon részében, ahol meg felszívó működés folyik, a faedénynyalábok irányában levő endodermiszsejtek vékony cellulózfalúak maradnak, áteresztő sejteket képezve. A PERICIKLUS az endodermiszen belüli apró élő parenchimatikus sejtek egyetlen sorából áll. A központi henger terjedelmesebb, mint a kétszikűek gyökerében. Az egyszikűekre jellemző, hogy gyökerük sztéléje SOK SZÁLLÍTÓNYALÁBot tartalmaz, a kétszikűektől eltérően legalább 7 faedénynyaláb és 7 háncsedénynyaláb van jelen, egymással váltakozva. A FAEDÉNYNYALÁBOK száma a nőszirom gyökerében általában 6-14 között változhat, külső részüket a szűkebb üregű edényeket tartalmazó, elsőként létrejött protoxilém, belső felüket pedig a néhány tágüregű trachea által képviselt, fiatalabb metaxilém képezi. A HÁNCSEDÉNYNYALÁBOK a fanyalábokkal váltakoznak és ugyanolyan számban vannak jelen. Mind a protofloém, mind pedig a metafloém rostacsövekből és kísérősejtekből áll. A gyökér közepén, az egyszikűekre jellemző módon, megmarad a BÉLSZÖVET, mely kezdetben parenchimatikus, de a sejtfalakba való egyenletes és nagymértékű ligninlerakódás miatt SZKLERENCHIMATIZÁLÓDIK, és az oldalirányú tépőhatásnak ellenálló szilárdító középtengelyt alkot. 21

22 endodermisz áteresztő sejtek háncsedények faedények 2.ábra. A nőszirom gyökerének mikroszkópos szerkezete (forrás: A bélszövetből a szállítónyalábok közé a periciklus irányába keskeny BÉLSUGARAK indulnak ki, kapcsolatot teremtve a sztéle központi és kerületi részei között. Az eddigi megfigyelések alapján fontos megjegyezni, mely szerkezeti tulajdonságok alapján lehet felismerni általánosan és megkülönböztetni a többi növényi szervtől a gyökeret, másrészt pedig azt, hogy milyen jellegek alapján lehet felismerni azt, hogy kétszikű vagy egyszikű növény gyökeréről van szó. Ezen különbségek kiemelésének céljából összefoglaljuk a legfontosabb tudnivalókat. Összefoglalás A GYÖKÉR elsődleges szerkezetének sajátos jellemzői: 1. a rizodermisz felszívó gyökérszőrökkel, kutikula, sztómák és más típusú trichómák nélkül; csak a felszívó övezetben található meg; 2. a kéreg külső rétegét parásodott falú sejtek alkotják, köztük áteresztő sejtekkel; 3. a kéreg nagy kiterjedésű, sok sejtsorból áll, a központi hengernél szélesebb; 4. a kéreg legbelső sejtsorát sajátosan alakult endodermisz képezi, melynek van elsődleges, másodlagos és harmadlagos fejlődési állapota; 5. a központi henger kívülről mindig egy sejtsoros periciklussal kezdődik; 6. a kétféle szállítószövet külön nyalábokat alkot, a faedénynyalábok szabályosan váltakoznak a háncsedénynyalábokkal; 7. a faedénynyalábban a protoxilém kívül, a metaxilém belül helyezkedik el. 22

23 A KÉTSZIKŰEK elsődleges szerkezetű gyökerére jellemző: 1. az egyetlen sejtsoros exodermisz; 2. kisebb számú (2-6) faedénynyaláb és háncsedénynyaláb; 3. a bélparenchima helyének átvétele egy metaxilém-edény által. Az EGYSZIKŰEK gyökerére jellemző: 1. a több sejtsoros kutisz; 2. a patkó alakban ligninnel vastagodott falú sejtekből alkotott harmadlagos endodermisz; 3. a központi henger nagyobb kiterjedésű, mint a kétszikűek gyökerében; 4. nagyobb számú (legalább 7, de akár több tíz) fa- és háncsedénynyaláb; 5. megmaradó és gyakran szklerenchimatizálódó bélszövet. 23

24 IV. LABORGYAKORLAT A SZÁR ELSŐDLEGES SZERKEZETE A KÉTSZIKŰEKNÉL: RÉTI BOGLÁRKA 1. Gyakorlat célja - megismerni a növényi szár sejt és szövettípusait - a kétszíkű zárvatermő növényekre (pl. réti boglárka) és egyszikűekre (pl. kukorica) jellemző szár szerkezetének megismerése, összehasonlítása - a szár másodlagos szerkezetének vizsgálata a hársfánál. Fásszárú növények szárának vastagodása, évgyűrűk kilakulása. 2. Szükséges eszközök Binokuláris mikroszkóp ( x nagyítás), tárgylemez, fedőlemez, Petri-csésze, óraüveg, csipesz, bonctű, éles borotvapenge, kongóvörös-krizoidin festék, vizes glicerin, réti boglárka szár, kukorica szár, hársfa hajtás, bodzabél. 3. A gyakorlat menete A festékfölösleg kimosása után az egyenletesen vékonynak látszó metszetek közül néhányat vízcseppben tárgylemez és fedőlemez között tanulmányozunk, előbb kis nagyitású objektívvel az általános kép rögzítése érdekében, majd nagyobb nagyítással a belső szerkezet egyes részleteinek jobb megfigyelése végett. Mivel a boglárka föld feletti szára csak tavasztól őszig, egyetlen vegetációs időszakon át élnek (egyéves növény), elsődleges szerkezetet mutatnak. Keresztmetszeti képen a következő szerkezeti elemeket figyelhetjük meg. Az EPIDERMISZ egyetlen sejtsorként veszi körül a szár többi szöveteit. Apró, izodiametrikus élő sejtjei oldalirányban szorosan egymáshoz kapcsolódnak, sejttartalmuk színtelen. A gyökér rizodermisszel ellentétben a hajtás epidermisz ssohasem képez felszívószőröket, és tartalmaz sztómákat. A boglárka sztómakészülékében a zárósejtek az epidermisz síkjában helyezkednek el, és nem övezik őket melléksejtek. Más növényeknél az epidermisz védő, kiválasztó vagy kapaszkodó, egysejtű vagy többsejtű trichómákat is képezhet. A rizodermisszel ellentétben az epidermisz sejtjeinek külső fala másodlagosan módosul: a boglárkánál is, akár a legtöbb esetben, kutinizálódik és összefüggő KUTIKULA borítja, mely csak a sztómák osztióluma szintjén szakad meg. A KÉREG sokkal keskenyebb, mint a gyökér esetében. Külső, epidermisz alatti sejtsorát lemezes kollenchima képezi, mert a periklinális sejtfalak cellulózzal megvastagodnak. A kéreg többi 5-10 sejtsora tipikus alapszövet, gazdag sejtközötti járatrendszerrel és vékony cellulóz sejtfalakkal; sejtjei gömbölydedek és nem rendeződnek szabályos sorokba. A kéreg külső részének sejtjei asszimiláló parenchimát alkotnak, kloroplasztiszokat tartalmaznak és nappal fotoszintetizálnak, hiszen az átlátszó 24