IN VITRO SEJTVONAL VIZSGÁLATOK GYÓGYSZERTECHNOL EPITÉLSEJT MODELLEK GYSZERTECHNOLÓGIAI GIAI VONATKOZÁSAI. Deli Mária A GYÓGYSZERFEJLESZT

Átírás

1 IN VITRO SEJTVONAL VIZSGÁLATOK GYÓGYSZERTECHNOL GYSZERTECHNOLÓGIAI GIAI VONATKOZÁSAI LEPITÉLSEJTLSEJT Deli Mária MTA Szegedi Biológiai Központ Biofizikai Intézet Molekuláris Neurobiológiai Csoport EPITÉLSEJT Sejttenyészetek a biofarmáciában Nazális epitélsejtvonal modell Bélepitél sejtvonal modell Toxicitás vizsgálatok Permeabilitás vizsgálatok Összefoglalás A GYÓGYSZERFEJLESZT GYSZERFEJLESZTÉS S LÉPÉSEIL IN VIVO BARRIEREK ÉS S GYÓGYSZER GYSZERÁTJUTÁS molekula Molekula fejlesztés 2-3 év 5,000-10, ,000 Preklinikai fejlesztés 3-5 év 1 10,000 Klinikai vizsgálatok 5-10 év A klinikai vizsgálatokon egyes ígéretes molekulák mégsem váltják be a reményeket, és nem lesznek gyógyszerek fő okok toxicitás nem megfelelő farmakokinetikai tulajdonságok Target azonosítás Molekula szintézis zis Vezér- molekula azonosítás Vezér- molekula optimalizálás Klinikai vizsgálatok In vivo barrierek: vér-agy gát placenta testis Hámsejt barrierek bőr légutak hámja (orr, tüdő) gasztrointesztinális felszín év egy gyógyszer kifejlesztése millió USD költség IN VIVO BARRIEREKEN VALÓ ÁTJUTÁS S BECSLÉSE SE A gyógyszermolekulák felszívódásának, megoszlásának és természetes barriereken való átjutásának vizsgálata már a molekula fejlesztés és optimalizálás korai fázisában döntő. Módszerek az in vivo permeabilitás becslésére számítógépes molekula modellezés (in silico) anyagmegoszlás kétfázisú rendszerekben (n-oktanol/víz, liposzóma /puffer) mesterséges membránok (PAMPA) sejttenyészeten alapuló modellek (epitél- illetve endotélsejtek, sejtvonalak) izolált szerveken perfúzió állatkísérletek Előnyök és hátrányok etikai szempontok: EU irányelvek, állatkísérletek kiváltása gyorsaság, hatékonyság (automatizálás, nagy áteresztőképesség) költségek KOMPLEXITÁS S PIRAMIS test szervek sejtek sejtmembránok liposzómák izotróp lipofil fázisok, pl. oktanol A sejttenyészetek köztes komplexitást képviselnek az állatkísérletek és az izotróp lipofil fázisok között: alacsony közepes throughput, ún. added value assay 1

2 SEJTTENYÉSZT SZTÉSES SES STANDARDIZÁLÁSA SA TENYÉSZT SZTÉSES SES EPITÉLSEJT EK Sejtek és sejtvonalak kontrollált eredete ATCC: American Type Culture Collection ECACC: European Collection of Cell Cultures Standard tápfolyadék, letesztelt szérum, pontos összetételű szérumhelyettesítő Pontosan megadott tenyésztőfelszín műanyag, üveg, bevont filterek Standard kísérleti körülmények a mérések során: megadott sejtszám reprodukálható sejtszám a növekedés azonos fázisaiban reprodukálható elektromos ellenállás adatok jellegzetes sejtmorfológia (pl. egysejtrétegek, sejtalak) jellegzetes TJ képződés transzporterek jellegzetes expressziója epitélsejtek Transwell filterek permeabilitás mérése ellenállás mérése EPITÉLSEJT Sejttenyészetek a biofarmáciában Nazális epitélsejtvonal modell Bélepitél sejtvonal modell Toxicitás vizsgálatok Permeabilitás vizsgálatok Összefoglalás INTRA GYÓGYSZERBEVITEL GYSZERBEVITEL Helyi hatás: allergia, nátha, fertőzés Szisztémás gyógyszerbevitel: krízis terápia (epilepszia, migraine) Vakcinálás: antigének, DNS vakcinák Út a központi idegrendszerbe: megkerüli a vér-agy gátat Előnyei: gyors abszorpció (3-5 perc) a máj first-pass metabolizmusának elkerülése Biohasznosulás: ~ 1%: inzulin, kalcitonin ~10%: morfin, sumatriptan ~60%: butorphanol ~90%: fentanyl Forgalomban lévő szisztémás hatással rendelkező nazális készítmények: calcitonin (Novartis), desmopressin (Ferring), sumatriptan (GSK), buserelin (Sanofi-Aventis), fentanyl (Nycomed Pharma) TRANSZPORT AZ EPITÉLIUMON KERESZTÜL AZ ORRÜREG REG HÁMJH MJÁNAK ÉS S AZ AGY EREINE INEK PERMEABILITÁSA 2 % fluoreszcein + Evans kék, intravénásan RR: légzőhám, RO: szaglóhám BO: szaglógumó, CTX: frontális agykéreg 2

3 NAZÁ BARRIEREK RPMIRPMI-2650 SEJTVONAL Humán nazális epitél sejtvonal anaplasztikus nazális septum Moore et al Epitélsejt tulajdonságok: egy- vagy többsejtrétegben nő hengeres, polarizált sejtmorfológia mikrovillusok és mukoid bevonat epitélsejtréteg szaglóideget burkoló OEC sejtek piros: claudin-5 immunfestés zöld: ZO-1 immunfestés sejtközötti kapcsolatok (nyilak) Wolburg et al., Histochem. Cell Biol., 130: , 2008 RPMIRPMI-2650 SEJTVONAL NAZÁ ÉS BÉ BÉLEPITÉ EPITÉLSEJT Tenyésztési körülmények: MEM+10% FBS Sejtsűrűség a tenyészet indításakor: 5 x 105 sejt/cm2 Konfluencia elérése 3-4 nap alatt Barrier funkció: TEER: 45 Ω x cm2 Sejttenyészetek a biofarmáciában Nazális epitélsejtvonal modell Bélepitél sejtvonal modell Toxicitás vizsgálatok Permeabilitás vizsgálatok Összefoglalás Papp FD4: 9,2 x 10-6 cm/s piros: β-catenin immunfestés kék: sejtmag CACOCACO-2 SEJTVONAL CACOCACO-2 SEJTVONAL - TRANSZPORTEREK Humán vastagbél adenocarcinoma Caco: carcinoma of colon (Fogh és mtsai., 1977) Epitélsejt tulajdonságok: egysejtrétegben nő hengeres, polarizált sejtmorfológia mikrovillusok apikálisan szoros zárókapcsolatok (TJ) dezmoszóma (D) interdigitáció (ID) Karrier mediálta transzport (kétirányú, tápanyagok) hexóz transzport rendszerek (GLUT-1, 2, 3, 5) glükóz, mannóz aminosavak (System L, B, X) Ala, Arg, Gln, Glu, Phe fémion transzporter (DMT-1) C-vitamin transzporter (SVCT-1) Aktív er P-glikoprotein Receptor mediálta transzcitózis Di-tripeptid transzporter (PepT1, HPT1) Vékonybél enzimek : szukráz-izomaltáz laktáz aminopeptidáz-n dipeptidil-peptidáz IV piros: ZO-1 immunfestés kék: sejtmag 3

4 CACO-2 2 MODELL JELLEMZŐI TRANSZPORTUTAK BÉLEPITB LEPITÉLSEJTEKENLSEJTEKEN Sejtsűrűség a tenyészet indításakor: 10 5 sejt/cm 2 Konfluencia elérése 2-3 nap Stacioner állapot elérése nap Sejtszám stacioner állapotban 4 x 10 5 sejt/cm 2 TEER x cm 2 P app fluoreszcein 4 x 10-7 cm/s 1. Passzív transzcelluláris, azaz sejten keresztüli transzport 2. Passzív paracelluláris, azaz sejtek közötti transzport 3. Aktív, karrier mediálta sejten keresztüli transzport 4. Transzcitózis CACO-2 ÉS IN VIVO TRANSZPORT EPITÉLSEJT Sejttenyészetek a biofarmáciában Nazális epitélsejtvonal modell Bélepitél sejtvonal modell Toxicitás vizsgálatok Permeabilitás vizsgálatok Összefoglalás Artursson et al., Adv Drug Deliv Rev, 2001 SEJTKÁROSOD ROSODÁS S MÉRÉSE M LAKTÁT T DEHIDROGENÁZ Z FELSZABADULÁS Laktát-dehidrogenáz felszabadulás sejtpusztulás mérése MTT festék átalakítás életképesség mérése sejtmembrán károsodás hatására az intracelluláris laktát dehidrogenáz enzim felszabadul (nekrotikus) sejtpusztulást mér 100 % toxicitás: 1% Triton X 100 detergens kolorimetriás végpont teszt (Roche kit) abszorbancia mérése 492 nm hullámhosszon Caco-2 egysejtréteg tenyésztés 96-lyukú lemezen excipiens dózis-függő toxikus hatást mutat Valós idejű jelölésmentes sejtanalízis Kettős fluoreszcens sejtmagfestés 4

5 MTT FESTÉK ÁTALAKÍTÁS a sárga MTT festéket enzimek a mitokondriumokban és a sejtplazmában kék formazán kristályokká alakítják életképességet mér 100 % életképesség: kontroll (nem kezelt) sejtek 100 % toxicitás: 1% Triton X 100 detergens kolorimetriás végpont teszt abszorbancia mérése 570 nm hullámhosszon MIKROELEKTRONIKUS SEJTÉRZ RZÉKELÉS valós idejű jelölésmentes sejtanalízis impedancia mérés 96-lyukú tenyésztőlemez arany elektródákkal xcelligence (Roche) műszer 100 % életképesség: kontroll (nem kezelt) sejtek 100 % toxicitás: 1% Triton X 100 detergens Caco-2 egysejtréteg tenyésztés 96-lyukú lemezen excipiens dózis-függő toxikus hatást mutat RPMI 2650 sejtek E-lemez kinetika mérése excipiens dózis-függő toxikus hatást mutat Control D ,01% M ,01% Triton X 1% D ,03% M ,03% M ,1% D ,1% FLUORESZCENS SEJTMAGFESTÉS morfológiai módszer élő sejteket fluoreszcens festékkel inkubáljuk bis-benzimid (kék) minden sejtmagot megfest ethidium homodimer-1 (piros) csak az elpusztult sejtek magját festi meg fotózás: fluoreszcens mikroszkóppal EPITÉLSEJT Sejttenyészetek a biofarmáciában Nazális epitélsejtvonal modell Bélepitél sejtvonal modell Toxicitás vizsgálatok Permeabilitás vizsgálatok Összefoglalás üveg fedőlemezen tenyésztett RPMI 2650 sejtek excipiensek dózis-függő toxikus hatást mutatnak PERMEABILITÁS S MÉRÉSÉRE M RE HASZNÁLT JELZŐANYAGOK Paracelluláris jelzőanyagok nem lehetnek receptorok, transzporterek, enzimek ligandjai fluoreszcens vagy izotóp jelölés nem jelölt ligand: HPLC, LCMS fluoreszcein, szukróz, mannitol (ms: Da) FITC-dextránok, (FITC)-inulin (ms: Da) szukróz Transzendoteliális transzport markerek albumin (nem-specifikus transzport) fluoreszcein bármilyen receptor ligand: peptid, protein, lipoprotein, stb. A JELZŐANYAG ÁTJUTÁSÁNAK MÉRÉSEM 1 felső kompartment luminális vagy apikális V L luminális térfogat (pl. 500 µl) luminális koncentráció (ismert) Δt mérési gyakoriság 1 időpont: pl. 60 perc vagy 120 perc több időpont: pl perc 2 alsó kompartment abluminális vagy bazális/bazolaterális V A abluminális térfogat (pl µl) [C] A abluminális koncentráció (mért) 5

6 CLEARANCE SZÁMÍTÁS IN VITRO EN PS: FELSZÍNRE SZÁMÍTOTT PERMEABILITÁS A clearance az a luminális kompartment térfogat (ml, µl) amelyikből a jelzőanyag egységnyi idő alatt teljesen kikerül (diffúzió vagy filter-hatás következtében) az abluminális kompartmentbe Az in vitro modelleken végzett clearance számítás hasonlít a vese clearance kiszámításához: clearance (ml) = [C] vizelet vizelet térfogat [C] artéria clearance (µl) = [C] A V A [C] A abluminális jelzőanyag koncentráció V A abluminális kamra térfogata kezdeti luminális jelzőanyag koncentráció A PS kiszámításához a clearance adatokat az eltelt idő függvényében ábrázoljuk, vagyis ez nem más, mint az adott idő alatt átjutó clearance (µl/min) az adott felszínre vonatkoztatva Az egyenes meredekségét (átlag és standard hiba) lineáris regresszió analízis segítségével határozzuk meg Clearance Time [min] PSf az üres filter clearance értékének meredeksége PSt az egysejtréteg clearance értékének (összes=filter+monolayer) meredeksége PERMEABILITÁSI KOEFFICIENS : P app a látszólagos permeabilitási koefficienst (P app ) a Fick törvény alapján számoljuk a permeabilitás koncentrációtól és felszíntől független mérésére szolgál mértékegysége cm/s a barrieren keresztüli anyagátjutás sebességét jelöli MIT JELENT A P app ÉRTÉK K A GYAKORLATBAN? magas P app érték - gyors penetráció: alacsony P app érték - lassú penetráció: szabad (transzcelluláris lipid-mediált) diffúzió influx transzport mechanizmus paracelluláris barrier efflux mechanizmus P app (cm/s) = [C] A V A A Δt Caco-2 modell Hatóanyag/ jelzőanyag Antipyrin Koffein Transzport mechanizmus transcellular diffusion transcellular diffusion P app (x10-6 cm/s) Indomethacin transcellular diffusion 51.8 V A abluminális térfogat (cm 3 ) A membrán felszín (cm 2 ) kiindulási luminális anyag koncentráció (ng/ml) [C] A abluminális koncentráció (ng/ml) Δt mérés időtartama (sec) Verapamil Quinidine Loperamid Digoxin Vinblasztin Cimetidin Atenolol paracelluláris diffúzió 0.7 Lucifer yellow paracelluláris diffúzió 0.5 Fluoreszcein paracelluláris diffúzió 1.4 P app A GYAKORLATBAN: AZ EPITÉLSEJT ALKALMAZÁSA RPMI 2650 sejtrétegek FITC-dextrán permeabilitás dózis-függő növekedése excipiens hatására ÖSSZEFOGLALÁS A sejttenyészeten alapuló modellek - fontos eszközei a preklinikai gyógyszerfejlesztésének - adatokat szolgáltatnak az in vivo permeabilitás és toxicitás becsléséhez Target Molecule Lead identification synthesis compound identification Pre-Clinical investigations Clinical Trial - a Caco-2 sejtvonal a vékonybélen, az RPMI-2650 az orrnyálkahártyán való gyógyszerfelszívódás tenyésztéses modellje 6