Molekuláris biológiai adatbázisok és adatbázis keresések. Barta Endre Tóth Gábor MBK Bioinformatikai Csoport

Átírás

1 Molekuláris biológiai adatbázisok és adatbázis keresések Barta Endre Tóth Gábor MBK Bioinformatikai Csoport

2 Adatbázisok: megvalósítás Szöveges adatbázis általában szekvenciális, néha indexelt megfelelő programmal indexelt bináris formába alakítható (pl. EMBOSS/dbiflat, BLAST/formatdb) flatfile emberi olvasásra is alkalmas XML (extensibe Markup Language; DTD: Document Type Definition) adattárolás és adatmegjelenítés különválik számítógépes programmal dolgozandó fel Bináris ASN.1 ( Abstract Syntax Notation 1 ) adatcsere szabvány Relációs adatbázis keresztreferenciák, logikai kapcsolatok kezelése többszörös indexelhetőség bonyolult lekérdezések lehetősége gyors hozzáférés az adatokhoz adatbáziskezelő program Molecular phylogenetics 2

3 XML formátum (példa) Molecular phylogenetics 3

4 Relációs adatbázisok szerkezete Tábla 1 Mező 1 Mező 2 Mező n Tábla 2 Mező 3 Mező 4 Mező n Egy DNS adatbanknál egyszerű, de egy nagyobb adatbanknál sokkal bonyolultabb struktúra Molecular phylogenetics 4

5 Kereszthivatkozások (táblák összekapcsolása) Tábla 1 (GenBank) Mező 1 (LOCUS) Mező n taxid pl Több rekord is mutathat ugyanarra a fajra Tábla 2 (Taxonomy) Mező 1 (taxid, pl. 3702) Mező n (fajnév) Arabidopsis thaliana Molecular phylogenetics 5

6 Szekvencia adatbázis szerkezete Tábla (pl. GenBank) Rekord 1 (Annotáció) szöveges keresés Mező 1 (pl. Locus) Mező 2 (pl. Definition) Stb. (Szekvencia) hasonlóság keresés Mező n (pl. cgagcatgcatctagtagcagcgtactac) Molecular phylogenetics 6

7 Szöveges keresés adatbázisokban Flatfile-ban keresés egy szóra, szórészletre A találat sorát (pl. UNIX grep) és környezetét látjuk csak, holott mi az egész rekordra lennénk kíváncsiak Megoldás: adatbázismotorok SQL (Simple Query Language), pl. MS Access, Oracle, MySQL stb. ENSEMBL, UCSC (MySQL) EMBL, InterPro (Oracle) Saját motor ACEDB SRS (icarus) Molecular phylogenetics 7

8 Keresés alapfilozófiája SQL: SELECT * (összes olyan rekord) FROM tábla (pl. GenBank) WHERE mező1 CONTAINS/SIMILAR/IDENTICAL (LIKE) valami AND SORT BY DISPLAY stb. Ezeket össze lehet fűzni Pl. keressük az összes burgonya szekvenciát SELECT * FROM GenBank WHERE OS= Solanum tuberosum Molecular phylogenetics 8

9 Dinamikus weboldalak Megadjuk, hogy mit akarunk keresni Kiválasztjuk, hogy miben A szerver ezt átalakítja pl. egy SQL paranccsá (sokszor ezt meg is lehet nézni) Az SQL parancsot végrehajtja egy vagy több adatbázison (ezek lehetnek különböző szervereken) A kapott eredményt on-the-fly átalakítja és megjeleníti a kliens böngészőn Molecular phylogenetics 9

10 Keresési stratégiák Megfelelő kulcsszavak kiválasztása Szélesebbtől a szűkebb fele 2 legfontosabb hiba: Túl sok találat Túl kevés találat Általában mindegy hogy kisbetű vagy nagybetű Kifejezéseket idézőjelbe Logikai kifejezések használata a AND b = akkor, ha mindkettő megvan az adott rekordban a OR b = bármelyikben megvan a BUT(AND)NOT b = a benne van, de b nincs Molecular phylogenetics 10

11 Molekuláris biológiai adatbázisok típusai Elsődleges adatbázisok DNS (RNS) adatbázisok (International Nucleotide Sequence Database Collaboration) EMBL (European Bioinformatics Institute, EBI) GenBank (National Center for Biotechnology Information, NCBI) DDBJ (DNA DataBank of Japan) (pl. térszerkezeti adatbázisok) Másodlagos v. származtatott adatbázisok Fehérje adatbankok Motívum adatbankok Egyéb (nem szekvencia) adatbázisok (Nucleic Acids Res. januári első száma) Molecular phylogenetics 11

12 Molecular phylogenetics 12

14 Elsődleges adatbázisok Mi a közös a 3 elsődleges adatbankban? International Nucleotide Sequence Database Collaboration adatcsere naponta taxonómia projekt azonos accession number közös feature table Elég eggyel foglalkozni, főbb adatokban nincs különbség Eltérő adatbázis-szerkezet/formátum formátumkonverzió: pl. readseq (UNIX), seqret (EMBOSS), ForCon (Windows) Molecular phylogenetics 14

15 Adatbázisok története Honnan jönnek az adatok? Irodalomban közölt adatok kézi bevitele Papíron beküldött szekvenciák (pl. GCG-ben Submission form ) Floppy Csak akkor fogadták el a cikket, ha a benne lévő szekvenciát már beküldték valamelyik adatbankba, innentől adatbankok szinkronizálása Internet (WWW, ) egyedileg a kutatók által nagyobb adagokban a szekvenáló központokból Molecular phylogenetics 15

16 Adatbázisok és a tárolókapacitás növekedése (MBK vs. EMBL) 1990: MicroVax szerver 2x 160 Mbyte HDD 50 Mbp 1993: SUN SparcServer x 512 Mbyte HDD 150 Mbp 1997: SUN Ultra Enterprise II 4x 9 Gbyte HDD 1 Gbp 2002: SUN Fire V480 8x 180Gbyte HDD 38 Gbp Szekvencia + annotáció + index: ~140 Gbyte (2004) Molecular phylogenetics 16

18 Adatbázisok exponenciális növekedése EMBL: rekordok száma (millió) EMBL: nukleotidok száma (gigabázis) Molecular phylogenetics 18

19 Adatbázisok szerkezete Úgynevezett flatfile formátum EMBL: 64,8 Gb 38,3 millió rekord ( ) (WGS szekcióval együtt) GenBank Release 140 (2004. február) 32,6 millió szekvencia 37,9 milliárd nukleotid (37,9 gigabázis) ~127 Gbyte (indexekkel együtt ~143 GByte) Szekciók/divíziók Rendszertani kategóriák alapján De inkább ahogy történelmileg alakult Rekordok (vagy entry -k) Mezők Annotáció Szekvencia Molecular phylogenetics 19

20 EMBL szekciók Eredeti felosztás: Pl ben vírusok, prokarióták, eukarióták stb. Release 18, february 1989 Division Entries Nucleotides Artificial Chloroplast Genetic elements Mitochondrial Prokaryotic Viral/Phage Eukaryotic Unclassified Unannotated Total Nagy mennyiségű szekvenálás újabb szekciók bevezetése (pl. EST, HTG, GSS stb.), valamint egyes szekciók felosztása vált szükségessé Molecular phylogenetics 20

21 Főbb EMBL szekciók I. EST: expressed sequence tag (cdns részl. szekv.) STS: sequence tagged site (PCR) GSS: genome survey sequences (random genomi) HTG: high throughput genomic (unfinished) WGS: whole genome shotgun PLN: növények FUN: gombák PRO: prokarióta ORG: organellum VRL: vírus PHG: bakteriofág PAT: szabadalommal védett SYN: szintetikus Molecular phylogenetics 21

22 Főbb EMBL szekciók II. HUM: humán MUS: egér ROD: egyéb rágcsáló MAM: egyéb emlős VRT: egyéb gerinces INV: gerinctelen Molecular phylogenetics 22

23 Különböző EMBL szekciók mérete EMBL Release 78 EST HTG Molecular phylogenetics 23

24 EMBL: megoszlás fajok szerint (első 10) Nukleotidok száma: ecetmuslica egyéb kutya csimpánz ember patkány egér Molecular phylogenetics 24

25 Egy EMBL rekord (részlet) ID HSCYCLOX standard; mrna; HUM; 3387 BP. XX AC M90100; XX SV M XX DT 30-MAR-1992 (Rel. 31, Created) DT 04-MAR-2000 (Rel. 63, Last updated, Version 7) XX DE Homo sapiens cyclooxygenase-2 (Cox-2) mrna, complete cds. XX KW cyclooxygenase-2; prostaglandin synthase. XX OS Homo sapiens (human) OC Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; OC Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo. XX RN [1] RP RX MEDLINE; RX PUBMED; RA Hla T., Neilson K.; RT "Human cyclooxygenase-2 cdna"; RL Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89(16): (1992). XX DR GOA; P DR SWISS-PROT; P35354; PGH2_HUMAN. XX FH Key Location/Qualifiers FH FT source FT /db_xref="taxon:9606" FT /mol_type="mrna" FT /organism="homo sapiens" FT /cell_type="endothelial" FT /tissue_type="umbilical vein" Molecular phylogenetics 25

26 Egy EMBL rekord (folytatás) FT 5'UTR FT /gene="cox-2" FT CDS FT /codon_start=1 FT /db_xref="goa:p35354" FT /db_xref="swiss-prot:p35354" FT /gene="cox-2" FT /EC_number=" " FT /product="cyclooxygenase-2" FT /protein_id="aaa " FT /translation="mlaralllcavlalshtanpccshpcqnrgvcmsvgfdqykcdct FT RTGFYGENCSTPEFLTRIKLFLKPTPNTVHYILTHFKGFWNVVNNIPFLRNAIMSYVLT FT... FT KGLMGNVICSPAYWKPSTFGGEVGFQIINTASIQSLICNNVKGCPFTSFSVPDPELIKT FT VTINASSSRSGLDDINPTVLLKERSTEL" FT sig_peptide FT /gene="cox-2" FT mat_peptide FT /gene="cox-2" FT /EC_number=" " FT /product="cyclooxygenase-2" FT 3'UTR FT /gene="cox-2" FT polya_signal FT /gene="cox-2" XX SQ Sequence 3387 BP; 1010 A; 712 C; 633 G; 1032 T; 0 other; gtccaggaac tcctcagcag cgcctccttc agctccacag ccagacgccc tcagacagca 60 aagcctaccc ccgcgccgcg ccctgcccgc cgctgcgatg ctcgcccgcg ccctgctgct tacctgaact tttgcaagtt ttcaggtaaa cctcagctca ggactgctat ttagctcctc 3360 ttaagaagat taaaaaaaaa aaaaaag 3387 // Molecular phylogenetics 26

27 Főbb mezők az EMBL adatbankban ID egyedi azonosító, (entryname dataclass; molecule; division; sequencelength BP.) AC accession number, változatlan, erre kell hivatkozni SV szekvencia verzió DT létrehozás, módosítás ideje DE description, a szekvencia rövid leírása KW kulcsszavak O? teljes taxonómiai besorolás R? referenciák DR adatbázis keresztreferenciák CC megjegyzések FT feature table: a szekvencia egy-egy részének a tulajdonsága XX üres, csak térkitöltő SQ szekvencia // rekord vége Molecular phylogenetics 27

28 Annotáció: EMBL vs. GenBank EMBL: ID egyedi azonosító AC egyedi azonosító! = GenBank ACCESSION SV entry verzió (volt: NI) DE rövid leírás OS faj OC taxonómiai besorolás FT feature table : tulajdonság/pozíció FT CDS kódoló szekvencia (PID) GenBank: LOCUS kihalóban? formátum miatt marad ACCESSION egyedi! = EMBL AC VERSION entry verzió * GI = EMBL NI DEFINITION rövid leírás SOURCE faj triviális neve ORGANISM faj, taxonómia FEATURES feature table tulajdonság/pozíció CDS kódoló szekvencia /protein_id /db_xref tr. fehérje GI No. * Accession.Version GI: NCBI belső azonosító (ld. BLAST DB) Molecular phylogenetics 28

29 Egy GenBank rekord (részlet) LOCUS HUMCYCLOX 3387 bp mrna linear PRI 31-DEC-1994 DEFINITION Homo sapiens cyclooxygenase-2 (Cox-2) mrna, complete cds. ACCESSION M90100 VERSION M GI: KEYWORDS cyclooxygenase-2; prostaglandin synthase. SOURCE Homo sapiens (human) ORGANISM Homo sapiens Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo. REFERENCE 1 (bases 1 to 3387) AUTHORS Hla,T. and Neilson,K. TITLE Human cyclooxygenase-2 cdna JOURNAL Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), (1992) MEDLINE PUBMED COMMENT Original source text: Homo sapiens umbilical vein cdna to mrna. FEATURES Location/Qualifiers source /organism="homo sapiens" /mol_type="mrna" /db_xref="taxon:9606" /cell_type="endothelial" /tissue_type="umbilical vein" gene /gene="cox-2" 5'UTR /gene="cox-2" Molecular phylogenetics 29

30 Egy GenBank rekord (folytatás) CDS /gene="cox-2" /EC_number=" " /codon_start=1 /product="cyclooxygenase-2" /protein_id="aaa " /db_xref="gi:181254" /translation="mlaralllcavlalshtanpccshpcqnrgvcmsvgfdqykcdc TRTGFYGENCSTPEFLTRIKLFLKPTPNTVHYILTHFKGFWNVVNNIPFLRNAIMSYV... VEVGAPFSLKGLMGNVICSPAYWKPSTFGGEVGFQIINTASIQSLICNNVKGCPFTSF SVPDPELIKTVTINASSSRSGLDDINPTVLLKERSTEL" sig_peptide /gene="cox-2" mat_peptide /gene="cox-2" /product="cyclooxygenase-2" /EC_number=" " 3'UTR /gene="cox-2" polya_signal /gene="cox-2" BASE COUNT 1010 a 712 c 633 g 1032 t ORIGIN 1 gtccaggaac tcctcagcag cgcctccttc agctccacag ccagacgccc tcagacagca 61 aagcctaccc ccgcgccgcg ccctgcccgc cgctgcgatg ctcgcccgcg ccctgctgct tacctgaact tttgcaagtt ttcaggtaaa cctcagctca ggactgctat ttagctcctc 3361 ttaagaagat taaaaaaaaa aaaaaag // Molecular phylogenetics 30

31 EMBL adatbázis fejlődése EMBL Sequence Version Archive Nem csak az adatok, hanem az adatbázis szerkezete is folyamatosan változik elsősorban a feature table új keresztreferenciák más adatbázisokkal Molecular phylogenetics 31

32 Szekvencia-beküldés az adatbankokba EMBL: WEBin ( GenBank: BankIt ( EMBL/GenBank: Sequin (lokálisan futó PC-s program) (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/sequin/) Molecular phylogenetics 32

33 WEBIN Molecular phylogenetics 33

35 Fehérjeszekvencia adatbázisok I. Swiss-Prot Kollaborációban készíti a SIB és az EBI Protein tudásbázis (ExPASy = Expert Protein Analysis System) Legjobban annotált adatbázis (kézi annotáció) Jó keresztreferenciák Non-profit kutatóknak ingyenes EMBL-hez hasonló adatbázis-szerkezet Szekvenciák lassú megjelenése TrEMBL Translated EMBL Automatikusan annotált SP-TrEMBL és REM-TrEMBL Molecular phylogenetics 35

36 Fehérjeszekvencia adatbázisok II. PIR (Protein Identification Resource) PIR-PSD Formátum: NBRF/PIR Kézi annotáció Keresztreferenciák (SWISS-PROT jobb!) Szupercsalád-besorolás 4 szekció: PIR1, PIR2, PIR3, PIR4 (legjobban annotált: PIR1) Megszűnik beolvadt az UniProt adatbázisba Genpept Lefordított GenBank CDS-ek (NCBI) Mint TrEMBL Molecular phylogenetics 36

37 Fehérjeszekvencia adatbázisok III. Universal Protein Resource (UniProt) Az EBI/SIB Swiss-Prot + TrEMBL és a PIR-PSD egyesítésével létrehozott adatbank EBI + SIB + PIR UniProt Consortium (2002) Három adatbázisréteg: UniProt Archive (UniParc) az összes publikus fehérjeszekvencia (nem redundáns) UniProt Knowledgebase (UniProt) megbízhatóan, konzisztensen és gazdagon annotált központi fehérjeszekvencia-adatbázis UniProt Non-redundant Reference (UniRef) kondenzált szekvenciakészlet UniProt tudásbázis: két rész kézzel annotált rekordok: Swiss-Prot (2004 végéig licenszköteles) számítógéppel elemzett rekordok (kézi annotáció előtt): TrEMBL UniRef UniRef100 (=UniProt), UniRef90, UniRef50 Molecular phylogenetics 37

38 Egy UniProt (Swiss-Prot) rekord ID AHA1_HUMAN STANDARD; PRT; 338 AA. AC O95433; Q96IL6; Q9P060; DT 16-OCT-2001 (Rel. 40, Created) DT 16-OCT-2001 (Rel. 40, Last sequence update) DT 15-SEP-2003 (Rel. 42, Last annotation update) DE Activator of 90 kda heat shock protein ATPase homolog 1 (AHA1) (p38) DE (HSPC322). GN AHSA1 OR C14ORF3. OS Homo sapiens (Human). OC Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; OC Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo. OX NCBI_TaxID=9606; RN [1] RP SEQUENCE FROM N.A. RA Michaud J., Chrast R., Rossier C., Papassavas M.P., Antonarakis S.E., RA Scott H.S.; RT "Isolation of a novel gene underexpressed in Down syndrome."; RL Submitted (JUN-1999) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases. DR EMBL; AF111168; AAD ; -. DR EMBL; AJ243310; CAB ; -. DR EMBL; AF164791; AAF ; -. DR EMBL; BC000321; AAH ; -. DR EMBL; BC007398; AAH ; ALT_INIT. DR EMBL; AF161440; AAF ; -. DR PIR; JC7769; JC7769. DR Genew; HGNC:1189; AHSA1. DR InterPro; IPR007821; DUF704. DR Pfam; PF05146; DUF704; 1. FT CONFLICT EA -> CL (IN REF. 4). SQ SEQUENCE 338 AA; MW; E6B686DDD8D7D729 CRC64; MAKWGEGDPR WIVEERADAT NVNNWHWTER DASNWSTDKL KTLFLAVQVQ NEEGKCEVTE VSKLDGEASI NNRKGKLIFF YEWSVKLNWT GTSKSGVQYK GHVEIPNLSD ENSVDEVEIS VSLAKDEPDT NLVALMKEEG VKLLREAMGI YISTLKTEFT QGMILPTMNG ESVDPVGQPA LKTEERKAKP APSKTQARPV GVKIPTCKIT LKETFLTSPE ELYRVFTTQE LVQAFTHAPA TLEADRGGKF HMVDGNVSGE FTDLVPEKHI VMKWRFKSWP EGHFATITLT FIDKNGETEL CMEGRGIPAP EEERTRQGWQ RYYFEGIKQT FGYGARLF // Molecular phylogenetics 38

39 Nem redundáns adatbázisok NCBI NRDB egyesített GenPept, PDB szekvenciák, SWISS-PROT, PIR nem azonos (!) fehérjék (polimorfizmus és szekvenálási hibák miatt redundáns) nr: indexelt BLAST formátumban letölthető OWL ( összetett, nem redundáns fehérje adatbázis egyetlen aminosavban eltérő szekvenciák közül csak 1 marad prioritási sorrend: SWISS-PROT, PIR1-PIR4, GenPept, NRL-3D NCBI UniGene egyedi gének átfedő EST-k klaszterezésével 10 állat: pl. humán, egér, patkány, szarvasmarha, béka, zebrahal 7 növény: pl. rizs, búza, árpa, kukorica TIGR TC (Tentative Consensus) klaszterezett és összefűzött EST-szekvenciák Molecular phylogenetics 39

43 Fehérje-mintázat, -motívum és profil-adatbázisok ADATBÁZIS VERZIÓ REKORDOK Swiss-Prot PRINTS TrEMBL Pfam PROSITE patterns INTERPRO adatbázis dec. PROSITE preprofiles N/A 131 ProDom InterPro Smart TIGRFAMs PIR SuperFamily SUPERFAMILY Molecular phylogenetics 43

44 Az INTERPRO adatbázis generálása Molecular phylogenetics 44

45 PROSITE adatbank Protein családok és domének adatbázisa Biológiailag szignifikáns: Helyek Mintázatok Profilok Ezek alapján lehet eldönteni, hogy egy adott fehérje milyen csoportba tartozik Molecular phylogenetics 45

46 Pfam (Protein families database of alignments and HMMs) Gyűjteménye a: Többszörös illesztéseknek, és a Hidden Markov modelleknek A legtöbb protein domént tartalmazza Pfam-A: Kurátorok által annotált domének Pfam-B: Automatikusan generált domének Fehérjék doménszerkezetének vizsgálata dex.shtml Molecular phylogenetics 46

47 PRINTS adatbázis Protein fingerprint -ek gyűjteménye fingerprint = konzerválódott motívumok csoportja UNIPROT-ból nyerik ki RINTS/ Molecular phylogenetics 47

48 PRODOM protein domén adatbázis Automatikus keresése a homológ doméneknek Módszer: rekurzív PSI-BLAST ent/html/home.php Molecular phylogenetics 48

49 SMART (Simple Modular Architecture Research Tool) Genetikailag mozgó domének vizsgálata Domén felépítés vizsgálata Több mint 500 domén részletes annotációja Molecular phylogenetics 49

50 TIGRFAM Protein családok gyűjteménye Többszörös illesztések Funkcionálisan rokon fehérjék azonosítása ml Molecular phylogenetics 50

51 PIR SuperFamily (PIRSF) Klasszifikációs rendszer A fehérjék teljes aminosav sorrendjének az evolúciós elemzésén alapul A családok tagjai monofiletikusak és homeomorfak Molecular phylogenetics 51

52 SUPERFAMILY Ismert szerkezetű fehérjék Hidden Markov Model profilok A SCOP adatbázisban alkalmazott szerkezeti osztályozáson alapul Molecular phylogenetics 52

53 Evolúciós adatbázisok I., Tree of Life Biológusok közös erőfeszítése egy teljes törzsfa kialakítására Molecular phylogenetics 53

54 Evolúciós adatbázisok I., Treebase Filogenetikai kapcsolatok adatbázisa Adatokat a kutatók küldik be treebase/index.html Molecular phylogenetics 54

55 3-D fehérjetérszerkezeti adatbázisok PDB (Protein Data Bank) Research Collaboratory for Structural Bioinformatics, USA kísérletesen meghatározott szerkezetek (röntgendiffrakció, NMR, MRI) MMDB NCBI: fehérje és nukleinsav; PDB egy része (elméleti modellek nélkül) EBI-MSD (~PDB) SCOP CATH EBI: 3-D szerkezetek hierarchikus osztályozása 4 szint: osztályok, gombolyok, szupercsaládok, családok) Molecular phylogenetics 55

56 Genomi adatbázisok I. NCBI 159 baktérium- és archeon genom (néhány fajból több törzs) 7 gomba, 10 egyéb eukarióta COGs (Clusters of Orthologous Groups) teljes eubaktérium és archeon, valamint élesztő genomok (jelenleg 43 teljes genom, 30 fő filogenetikai vonalból) ortológ gének csoportjai (fehérje-blast alapján) legalább 3 fajban előforduló nagyon hasonló fehérjék COGnitor program felhasználás: funkciópredikció egy adott genomból hiányzó konzervált COG - annotálatlan gén detektálása Molecular phylogenetics 56

60 Genomi adatbázisok II. ENSEMBL (Sanger Institute, EBI) integrált genom annotációs rendszer automatikus genomannotációs csövezeték genom böngésző szabad szoftver (MySQL motor) eredetileg humán annotációra fejlesztették most: humán, (csimpánz), egér, patkány, (tyúk), zebrahal, fugu, moszkító, ecetmuslica, C. elegans, C. briggsae Molecular phylogenetics 60

62 Kontig nézet Molecular phylogenetics 62

63 UCSC genom böngésző ENSEMBL amerikai alternatívája Néha frissebb az annotáció Kevesebb szervezet Új géncsalád böngésző Molecular phylogenetics 63

64 UCSC Genome Browser (példa) Molecular phylogenetics 64

65 Gén-ontológia (GO) The Gene Ontology Consortium bármely élő szervezetben megtalálható géntermék leírására hierarchikus besorolás egységes terminológia 3-féle ontológia: molekuláris funkció biológiai folyamat sejtalkotórész online: pl. Mouse Genome Initiative GO Browser GOA Molecular phylogenetics 65

68 NCBI adatbázisok LocusLink / RefSeq / Entrez Gene LocusLink: kiindulópont egy genetikai lókusz (pl. gén) egyedi azonosító: LocusID kapcsolt információ: pl. fenotípus, térképpozíció, homológ gének RefSeq: egyedi gének (nem redundáns) mrns és fehérje szekvenciák humán, egér, patkány, szarvasmarha, zebrahal, ecetmuslica Taxonomy taxonómiai adatbázis OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) humán gének és genetikai betegségek PubMed (bibliográfiai adatbázis) magában foglalja a MEDLINE adatbázist azonosító: PMID (PubMed identifier), MUID (MEDLINE unique identifier) Molecular phylogenetics 68

69 Keresés az annotációkban I. NCBI Bármilyen adatbázisrekord (Annotáció) szöveges keresés Mező 1 (pl. Locus) Mező 2 (pl. Definition) Stb. (Szekvencia) hasonlóság keresés Mező n (pl. cgagcatgcatctagtagcagcgtactac) Molecular phylogenetics 69

70 Integrált információkeresés I. NCBI Entrez NCBI (National Center of Biotechnology Information, Bethesda, USA) >20 részadatbázis Molecular phylogenetics 70

81 Keresés az annotációkban II. SRS Bármilyen adatbázisrekord (Annotáció) szöveges keresés Mező 1 (pl. Locus) Mező 2 (pl. Definition) Stb. (Szekvencia) hasonlóság keresés Mező n (pl. cgagcatgcatctagtagcagcgtactac) Molecular phylogenetics 81

82 Sequence Retrieval System (SRS) Adatbázis indexelő és kereső rendszer Thure Etzold kezdte el fejleszteni a 90-es évek elején Heidelbergben az EMBL-ben 1996-tól az EBI-ben 1999-től a Lion Biosciences-ben közösen az EBIvel 5.1-es verzió szabad (de a legújabb adatbázisokkal már nehéz használni) 6.0-ás verziótól akadémiai liszenszet lehet kérni 7.0-ás verziótól EMBOSS integrálva van és helyileg: Molecular phylogenetics 82

83 Mire jó az SRS? Keresés mindenfajta adatbázis annotációban Szekvenciák letöltése egy faj, vagy egy adott taxonómiai egységhez tartozó szekvenciák egy adott annotált tulajdonsághoz tartozó szekvenciák (pl. intronok, domének) adott szekvenciákhoz tartozó referenciák keresése legmegfelelőbb adatbázis keresése Molecular phylogenetics 83

84 Segítség az SRS használatához Lehet keresni a dokumentációban (természetesen az is egy adatbázis) Meglehet nézni on-line vagy le lehet tölteni PDF formátumban a teljes dokumentációt Legfontosabb az SRS User Guide SRS-t lehet Linux alá is telepíteni, ilyenkor az SRS Administrators Guide ad segítséget Természetesen minden oldalról van link Molecular phylogenetics 84

85 Mit lehet keresni az SRS segítségével? Az összes adatbázis összes mezőjében bármilyen szöveget ID, Elérési szám (accession number) Definíció Organizmus Szekvenciához kapcsolódó referencia Feature (pl. domén, kötőhely stb.) Molecular phylogenetics 85

86 Hogyan működik az SRS? Az adatbázis felbontása rekordokra és mezőkre ID TRBG361 standard; mrna; PLN; 1859 BP. AC X56734; S46826; SV X DT 12-SEP-1991 (Rel. 29, Created) DT 15-MAR-1999 (Rel. 59, Last updated, Version 9) DE Trifolium repens mrna for noncyanogenic beta-glucosidase KW beta-glucosidase. Molecular phylogenetics 86

87 Adatbázis felbontása rekordokra és mezőkre Molecular phylogenetics 87

88 Indexelés Molecular phylogenetics 88

89 SRS kezdőoldal Molecular phylogenetics 89

90 Keresés a szekvenciákban Bármilyen adatbázisrekord (Annotáció) szöveges keresés Mező 1 (pl. Locus) Mező 2 (pl. Definition) Stb. (Szekvencia) hasonlóság keresés Mező n (pl. cgagcatgcatctagtagcagcgtactac) Molecular phylogenetics 90

91 Hasonlósági keresések adatbázisokban Optimális illesztéssel: nagyon időigényes, csak célhardveren Sokprocesszoros számítógép vagy számítógép-klaszter, párhuzamos processzálás Erre a célra fejlesztett chip Heurisztikus algoritmusok használata Bizonyos elhanyagolásokkal, gyakran tapasztalati úton beállított algoritmusok, paraméterek és statisztika Sok tesztfuttatással igazolt használhatóság Sebességnövekedés bizonyos fokú érzékenységvesztés árán FASTA (W. Pearson fejlesztette) BLAST (az NCBI-nál fejlesztik; S. Altschul), PSI-BLAST Molecular phylogenetics 91

92 FASTA FASTA2 és FASTA3 (Lipman és Pearson, 1985; Pearson és Lipman, 1988; Pearson, 2000) FASTA3 programcsomag (ftp://ftp.virginia.edu/pub/fasta) Rövid (10 nukleotidnyi) keresőszekvenciák is használhatók A keresés időigénye nagyban függ az alkalmazott k-tuple értéktől Molecular phylogenetics 92

93 FASTA algoritmus (1) a kereső ( query ) és az adatbázisszekvencia között közös szavak (ktuple) keresése (2) az azonos átlón található szavak összefűzése és pontozása a helyettesítési mátrix-szal database sequence database sequence query sequence query sequence 10 legjobb szegmens: Init1 score Molecular phylogenetics 93

94 FASTA algoritmus (3) eltérő, de egy bizonyos eltoláson belüli átlók egyesítése és pontozása (helyettesítési mátrix + hézagbüntetések) (4) optimális lokális illesztés egy sávban (S-W alg.) database sequence database sequence query sequence: Initn score query sequence: Opt score Molecular phylogenetics 94

95 A FASTA3 csomag programjai Molecular phylogenetics 95

96 Mikor melyik programot használjuk? Molecular phylogenetics 96

97 FASTA a weben WWW: (EBI) (Institut Pasteur) Molecular phylogenetics 97

98 BLAST BLAST ( a leggyorsabb, helyben is futtatható (pl. blastp Linux PC-n is hamar lefut) gyors, lokális illesztéseket végez szekvenciaillesztésre optimalizált, nem motívumkeresésre statisztikai módszerek alkalmazásával becsüli a találatok szignifikanciáját NCBI-BLAST két verziója: (régi, nem enged hézagokat), (új, hézagokat enged: gapped BLAST ) WU-BLAST 2.0 Warren Gish (Washington University) implementációja (hézagokat enged) Molecular phylogenetics 98

99 BLAST algoritmus (Altschul et al., 1990, 1997) (1) W hosszúságú szavakból szomszédos szó lista generálása L hosszúságú kereső szekvencia Maximum L-W+1 szó (w~3 fehérjékre) Mátrix használata (PAM vagy BLOSUM, stb.) szó-lista T (threshold) pontértékű szavakból (2) Szavak adatbázis: tökéletes egyezések keresése adatbázis-szekvenciák tökéletes egyezések (3) Találatok kiterjesztése és a legjobb lokális illesztés megkeresése: HSP-k S pontértékkel kereső szekv.: adatbázis szekv.: EGDCVFDGMIGSDQGSL E C+ +G G+D GS+ EAGCLQNGQRGTDVGSV X G S D Q G S L R F D G F D V E C D G T D V G S V M D E I P N D F E C Molecular phylogenetics 99

100 BLAST algoritmus és statisztika A keresés lépései: W hosszúságú szavak ( word ) keresése találatok pontozása szubsztitúciós mátrix használatával nagy pontértékű találatok kiválasztása: HSP-k ( High scoring Segment Pairs ) HSP-k kiterjesztése mindkét irányban (szubsztitúciós mátrix használatával), amíg a szekvencia el nem fogy, vagy az egyezés már nem szignifikáns végeredmény: MSP-k ( Maximal scoring Segment Pairs ) Statisztikai szignifikanciabecslés: E érték: hasonló vagy nagyobb pontértékű találat véletlen előfordulásának várható száma; minél kisebb, annál jobb. Molecular phylogenetics 100

101 BLAST programok NCBI BLAST lokális futtatásánál a p opcióval kell megadni, pl.: blastall p blastp Molecular phylogenetics 101

102 NCBI BLAST Paraméterek: W (-W opció): blastn alapértelmezés: 11 (kompromisszum: szinte minden véletlen illeszkedést kizár, de divergált homológokét is) szűrés (-F opció): kis komplexitású régiók N-ekre vagy X-ekre cserélése a keresőszekvenciában; alapértelmezés: igen (T); blastn: DUST, többi: SEG és/vagy XNU; pontosabban is specifikálható (pl. szűrés csak a szó-lista létrehozásánál) opció: nem (F) szubsztitúciós mátrix (-M opció): BLOSUM45, BLOSUM62, BLOSUM80, PAM30, PAM70 E-határérték ( expected score threshold ) (-e opció); alapértelmezés: 10 blastn: egyező (M) és nem egyező (N) nukleotidok pontszámának aránya; alapértelmezés: M = 5, N = -4 ( M/N = 1.25; ~47 nukleotid PAM); minél nagyobb az arány, annál távolabbi szekvenciákat talál meg Molecular phylogenetics 102

103 BLAST programok WWW: NCBI-BLAST: (NCBI) (EBI) WU-BLAST: (EBI) (Institute Pasteur) (és sok más helyen, gyakran speciális adatbázisokkal, pl. fajok szerint) Lokálisan futtatható: blastall FASTA formátumú adatbázis formázása és indexelése: formatdb -i nr -o T BLAST keresés: blastall -p blastp -d nr -i query.fasta o \ out.query Molecular phylogenetics 103

104 Potenciális műtermékek, fals pozitívok Forrásai: Kis komplexitású régiók Repetitív elemek Figyelmeztető találatok (pl. Alu szekvencia) Vektor-szennyezés Megoldás: keresőszekvencia maszkolása, szűrése Kis összetételi komplexitású régiók: BLAST-ba beépítve: seg ill. xnu (aminosav), dust (nukleotid) kis komplexitású régiók, mikroszatellitek maszkolása Mikroszatellitek (SSR): Sputnik ( mikroszatellitek (SSR) azonosítása; Windows, UNIX TRF (Tandem Repeat Finder) mikroszatellitek (SSR) azonosítása; Windows, UNIX Molecular phylogenetics 104

105 Kis komplexitású régiók szűrése SEG (fehérjékre) HILCDEVNEGDEENEDFLPS HILCXXXXXXXXXXXXFLPS DUST (nukleinsavakra) GCTCAAAAAATAAAAACACG GCTCNNNNNNNNNNNNCACG Molecular phylogenetics 105

Több megjelenítése