BME Vegyészés Biomérnöki Kar MTA Enzimológiai Intézet. Genom Metabolizmus és Javítás Laboratórium

Átírás

1 Az örökítő anyag (DNS) károsodásai kettős szerepben: hiba vagy jel? BME Vegyészés Biomérnöki Kar MTA Enzimológiai Intézet Genom Metabolizmus és Javítás Laboratórium

2 Hogyan tegyünk fel kérdéseket a mai molekuláris biológiában? Kísérlet-vezérelt kutatás Adatbázisok / rendszerbiológia Hipotézis-vezérelt kutatás Esettanulmányok, specifikus problémák Ellenőrzés/Igazolás/ÉRTELMEZÉS!!! mindazon adatokra, melyeket a rendszerszemlélet begyűjtött

3 Választott megközelítés Hipotézis-vezérelt kutatás Esettanulmányok, specifikus problémák Ellenőrzés/Igazolás/ÉRTELMEZÉS!!!

4 Módszerek és problémák Szerkezeti biológia Mechanizmusok vizsgálata Fajspecificitás Folding Enzimkinetika Konformációk spektroszkópiák (CD, fluoreszc.) EPR-ENDOR Multidimenzionális NMR Röntgenkrisztallográfia SAXS Objektumok: Uracil-DNS metabolizmus fehérjéi Élettani szerep vizsgálata Fejlődésbiológia, sejtciklus szabályozás DNS javítás / sejthalál Timinmentes sejthalál mechanizmusa Kifejeződési mintázatok Sejten belüli lokalizáció Proteomika: kölcsönhatási hálózatok Transzgén élőlények Knock-out / RNS interferencia Magi és citoplazmás transzport

5 A mi esetünk: Paradoxon: stabil infotárolás reaktív makromolekulákban?? DNS és sejtbeli környezet: reaktív!! Spontán kémiai módosítások normál élettani körülmények mellett Hogyan lehet feloldani a paradoxont? DNS javító mechanizmusok Genom stabilitás biztosítása Uracil Timin Uracil a leggyakoribb hiba Uracil talán nem csak hiba? Jelátvitel!

6 DNS szerkezet : alkotó elemek O - és foszfátcsoport: -O P O - O

7 Nukleinsav szerkezet

8 A nukleinsavak típusai RNS DNS

9 A nukleinsavak elsődleges szerkezete A polinukleotid lánc direkcionális ( 5 ACGT3 ) A polinukleotid lánc individualitását a nukleotid szekvencia adja. Minden egyed nukleotiszekvenciája más.

10 DNS: Watson-Crick. DE inkább: Franklin- Wilkinson Nature 2 April 1953 MOLECULAR STRUCTURE OF NUCLEIC ACIDS A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid Kísérletes eredmény: Rosalind Franklin Merész hipotézis: Watson és Crick We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose nucleic acid (D.N.A.). This structure has novel features which are of considerable biological interest.... It has not escaped our attention that the specific pairing we postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material (cf Meselsohn and Stahl, 1958)

11 A kettős hélix Séma Valós szerkezet

12 DNS szerkezet : negatív töltés pk a = 1 Nukleotid egységenként egy negatív töltés Láncvégeken + egy negatív töltés

13 DNS szerkezet: kovalens kötések Cukorgyûrû Bázisgyûrû Cukor és bázis szubsztituens csoportok Foszfátészter N-glikozidos: a legkevésbé stabil

14 DNS szerkezet: nem-kovalens kölcsönhatások H-hidak: bázispárosodás Van der Waals (hidrofób kölcsönhatás): átlapolás (aromás gyûrûk pí-elektronok) Hipokromaticitás: az átlapolás miatt a kettõsszálú DNS-beli bázisok elnyelése csökken Felhasználás: olvadási hõmérséklet

15 Miért fontos a DNS hibajavítás? Hogyan fordulnak elõ a hibák? Paradoxon: Stabil info tárolás Instabil memória DNS inherens kémiai reaktivitása (v.ö. ősi RNS világ) főleg a bázisok, ill. az N-glükozidos kötés Tárolás hibái Spontán károsodási folyamatok Öregedés Tumorok - Sejthalál Másolás DNS polimerázok hibái hibái helytelen bázis beépítés (misincorporation) (jó/rossz pár : csak 10 kj) - azonnali visszaolvasó javítás (proofreading) - SSB fehérjék 1 hiba/10,000,000 - replikáció utáni hamis pár javítás: 1/ nukleotid szintek helyes aránya: nukleotid metabolizmus

16 A mi esetünk: Paradoxon: stabil infotárolás reaktív makromolekulákban?? DNS és sejtbeli környezet: reaktív!! Spontán kémiai módosítások normál élettani körülmények mellett Hogyan lehet feloldani a paradoxont? DNS javító mechanizmusok Genom stabilitás biztosítása Uracil Timin Uracil a leggyakoribb hiba Uracil talán nem csak hiba? Jelátvitel!

17 Uracil in DNA? Two pathways Cytosine deamination 500/day/genome MUTAGENIC needs repair system: baseexcision repair (BER) Thymine-replacing incorporation under high dutp/dttp ratios INNOCENT does not need to be repaired, but BER acts on it transforms BER into hyperactive futile cycle How to get rid of uracil in DNA? Two pathways - two enzyme families Prevent thymine-replacement keep dutp/dttp low factor responsible: dutpase dutp dump + PPi dutpase guards against U at T sites ONLY for innocent uracils Remove uracil 5 cut by cleaving the R glycosidic bond O O NH P=O O O N O O 3 R UDG BOTH for mutagenic and innocent uracils N.B.

18 dump dump dutpáz dutp dutp dttp dttp dutpase high dutp/dttp UU UU What happens in lack of dutpase? DNA DNA polymerase polymerase UU CU U UU UU Uracil (U) (U) substituted DNA DNA BER C DNA double strand breaks Chromosome fragmentation CELL DEATH A dump-nek, a dttp prekurzorának termelése precursor provides dttp A dutp szint csökkentése decreases dutp level Lack of dutpase Lack of dutpase Thymine-less cell death (lethal) Mustafi et al, 2003 PNAS Barabás et al 2003 JBC Kovári et al 2004 JBC Barabás et al 2004, JBC Békési et al 2004, JBC Németh et al 2007 NAR Kovári et al 2008 Proteins Tóth et al 2007 JBC Varga et al 2007 FEBS Lett Vértessy 2009 Acc. Chem. Res. Békési et al, 2010 FEBS J Pukáncsik et al 2010 FEBS J Pécsi et al, 2010 NAR Horváth, Vértessy, 2010 NAR Pécsi et al, 2011 PNAS Muha et al 2012 PLoS Genetics

19 Mire jó mindez? - TBC elleni küzdelem - Uracil-DNS jelátvivő szerepének vizsgálata - Sejten belüli transzport vizsgálatok (Muha et al, 2009, Merényi et al, 2010, Róna et al 2011) - DNS károsodás mérése (Horváth és Vértessy, 2010, Nucl. Acids Res.) - Rákellenes terápiák és diagnosztika fejlesztése (Vértessy és Tóth, 2009, Acc Chem Res)

20 dutpáz szerkezet Szimmetrikus homotrimer B A A C C Három aktív centrum Mindhárom monomer résztvesz B N C

21 b E-S S c a E Approach Intermediate, (E-AI) TS mimic intermediate (E-S/E-piP mix) d * e Post-attack Intermediate (E-piP) P f E-P

22 Intermediate structures observed along the reaction coordinate of the dutp hydrolysis: sixteen structures E-I int, mix density Near-attack conformer 2.5 A Note: Wcat and ap densities separate. Intermediate model shown in dark red. Mixture model shown in two shades of green. Light green: the product dump, dark green: the substrate a,b-imino-dutp

23 UTPáz mechanizmus: atomok mozija AspI GlnIV AspIII ArgII SerII TyrIII

24 Fluoreszcencia és gyorskinetika f Trp címke Tyr105 Phe Å Wcat Asp102 Arg85 Elemi lépések kvantitatív leírása

25 Tuberkulózis és malária: közös tulajdonságok Mycobacterium tuberculosis és Plasmodium falciparum: Egyaránt limitált enzimkészlet: dcmp dezamináz és timidin kináz nélkül dutpáz az egyedüli útvonal dtmp felé

26 M. tuberculosis dutpáz inhibitor tervezés HTP in silico screen Fajspecificikus szegmensek Varga et al 2008 PDB ID: 2PY4

27 Munkafolyamat 1. HTS In silico screening 2 millió vegyületre 2. In vitro enzimtesztek vegyületre 3. MTB gátlás 350 vegyületre 4. Humán sejt vizsgálatok 50 vegyületre 5. Állatkísérletek 5 vegyületre 6. Szabadalmaztatás 3 vegyületcsaládra

28 dump dump dutpáz dutp dutp dttp dttp dutpase high dutp/dttp UU UU What happens in lack of dutpase? DNA DNA polymerase polymerase UU CU U UU UU Uracil (U) (U) substituted DNA DNA BER C DNA double strand breaks Chromosome fragmentation CELL DEATH A dump-nek, a dttp prekurzorának termelése precursor provides dttp A dutp szint csökkentése decreases dutp level Lack of dutpase Lack of dutpase Thymine-less cell death (lethal) Mustafi et al, 2003 PNAS Barabás et al 2003 JBC Kovári et al 2004 JBC Barabás et al 2004, JBC Békési et al 2004, JBC Németh et al 2007 NAR Kovári et al 2008 Proteins Tóth et al 2007 JBC Varga et al 2007 FEBS Lett Vértessy 2009 Acc. Chem. Res. Békési et al, 2010 FEBS J Pukáncsik et al 2010 FEBS J Pécsi et al, 2010 NAR Horváth, Vértessy, 2010 NAR Pécsi et al, 2011 PNAS Muha et al 2012 PLoS Genetics

29 Paradigm shift Non-conventional roles for uracil-dna 5-Me-cytosine demethylation Me-C: key epigenetic signal DNA-methyltransferases do not demethylate???? Diverse hypotheses in the literature TDG identified as major factor Mechanism: 5-Me-C:G T:G repair via TDG C:G Nature Jiricny, 2011, Cell, Bellacosa, 2011

30 Paradigm shift Non-conventional roles for uracil-dna hat happens in lack of both dutpase and UDG? Accumulation of uracil-dna (viable) e.g double mutant (dut-ung-) E. coli Bacillus subtilis PBS2 phage Is there any multicellular complex organism with such characteristics? Case of holometabolic insects (metamorphosis): - no UDG (major form) in the genome

31 Lack of dutpase in Drosophila larvae Western Confocal S2 E 1L 2L 3L P dutpase DNA merge Larvae have two types of tissues - larval - imaginal disks dutpase only in imaginal disks Exclusively nuclear Békési et al, 2004, JBC Correlation between survival/death and presence/lack of dutpase

32 Base Excision Repair and uracil-dna glycosylases B U B P P P Four UDG families: B UDG B P P P UNG SMUG1 TDG MBD4 *MAJOR UDG High turn over independently from the context of uracil *Localisation at the replication foci *Single strand selective!? *Much lower turn over *Mismatch specific!!! *Much lower turn over B AP endonuclease B B OH P P P pol β +dntp B B P OH P P B B B Ligase III + P OH P P P

33 Base Excision Repair and uracil-dna glycosylases P P P B U B In Drosophila UDG B B Two Four UDG families: P P P AP endonuclease UNG SMUG1 TDG MBD4 *MAJOR UDG High turn over independently from the context of uracil *Localisation at the replication foci *Single strand selective!? *Much lower turn over (10-4 ) *Mismatch specific!!! *Much lower turn over (10-4 ) B B B OH P P P pol β +dntp B B P OH P P Ligase III B B B P P P + P OH

34 Uracil-DNA in the fruit fly: signalling for cell death during metamorphosis? U-DNA? U-DNA nuclease?

35 Uracil / million bases Uracil / million bases Uracil / million bases Relative dutpase mrna level Relative dutpase mrna level Uracil-DNA in physiological samples: effect of uracil-dna glycosylase and dutpase Drosophila melanogaster Application on physyological samples dutpase developmental and tissue specific downregulation Imaginal primordium (eg. discs) - express dutpase Larval tissues (eg. salivary gland)- no dutpase expression Békési et al, 2004, J. Biol. Chem. 1,00 0,75 0,50 0,25 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,00 E L1 L2 L3 Developmental stages P 0,0 disc sal.gl. 3 rd larval tissues x dutpase silencing by transposon mediated RNA interference x E L1 L2 L3 P Developmental stages 0 disc sal. gl. 3 rd larval tissues 0 control disc RNAi disc RNAi sal.gl. 3 rd larval tissues

36 Uracil / million bases Uracil / million bases Uracil / million bases Relative dutpase mrna level Relative dutpase mrna level Uracil-DNA in physiological samples: effect of uracil-dna glycosylase and dutpase Drosophila melanogaster Application on physyological samples dutpase developmental and tissue specific downregulation Imaginal primordium (eg. discs) - express dutpase Larval tissues (eg. salivary gland)- no dutpase expression Békési et al, 2004, J. Biol. Chem. 1,00 0,75 1,0 0,8 0,50 0,6 0,4 0,25 0,2 0,00 E L1 L2 L3 Developmental stages P 0,0 disc sal.gl. 3 rd larval tissues dutpase silencing Strong lethality at pupal stage x -Uracil-DNA dutpase silencing implications by transposon mediated RNA interference in development Temporary uracil-dna 1.14x intolerance 1500 factor E L1 L2 L3 P Developmental stages 0 disc sal. gl. 3 rd larval tissues 0 control disc RNAi disc RNAi sal.gl. 3 rd larval tissues

37 Evolutionary distribution of dut, ung, ude Insects N Holometabola

38 Genom Metabolizmus és Javítás laboratórium BME VBK ABÉT és MTA Enzimológiai Intézet Csoport Támogatás