A DNS kémiája a bölcsőtől a sírig Vértessy Beáta

Átírás

1 MTA Kémiai Tudományok Osztálya Felolvasó ülés június 18. A DS kémiája a bölcsőtől a sírig Vértessy Beáta

2 Vázlat Általános elvek Célzott problémára fókuszálás DS módosulások szerepei Egy szokatlan bázis a DS-ben Enzimatikus reakció mechanizmus: dutpáz Racionális inhibitor tervezés

3 Hogyan tegyünk fel kérdéseket a mai molekuláris biológiában (kémiában)? Kísérlet-vezérelt kutatás Adatbázisok / rendszerbiológia Omikák Hipotézis-vezérelt kutatás Esettanulmányok, specifikus problémák Ellenőrzés/Igazolás/ÉRTELMEZÉS!!! mindazon adatokra, melyeket a rendszerszemlélet begyűjtött

4 SAGE journals Omikák - Technológiák

5 Választott megközelítés Hipotézis-vezérelt kutatás Esettanulmányok, specifikus problémák Ellenőrzés/Igazolás/ÉRTELMEZÉS!!!

6 Kémiai biológia mi az? Az élettudományok és a kémia/fizika közti határmezsgye Kémiai technológiákat használ a biológiai folyamatok leírásához és megértéséhez Rendszerszemléletű megközelítés: szintetikus biológia/kémia, szerkezeti/molekuláris/sejtbiológiai módszerek Kvantitatív megközelítési módok Dinamikus analízis kinetika! Ismert példa: farmakogenomika kémiai genomika

7 A mi esetünk: Paradoxon: stabil infotárolás reaktív makromolekulákban?? DS és sejtbeli környezet: reaktív!! Spontán kémiai módosítások normál élettani körülmények mellett Hogyan lehet feloldani a paradoxont? DS javító mechanizmusok Genom stabilitás biztosítása Uracil Timin Uracil a leggyakoribb hiba Uracil talán nem csak hiba? Jelátvitel!

8 DS kémiai nézőpontból H O P C Reaktív csoportok sokasága egy lineáris polimerre fűzve

9 DS-polimer reaktív centrumai és a javítás útjai Replikációs hibák UV sugárzás Ionizáló sugárzás Radioterápia Kemoterápia Szabadgyökök Repliszóma leállás Alkilezés Környezeti toxinok adduktok Pirimidin dimerek Hamis párok, inzerciók, deléciók MMR ER Száltörés DSB BRCA BER ER UDG, dutpáz Adott hibákra specializált javítás Alapvető: a módosított kémiai szerkezet felismerése

10 DS károsodások ds DS törés G A T C Hamis pár C-U deaminálás ss törés Timidin dimer AP hely Kovalens keresztkötés M J Larkin Biology & Biochemistry. The Queen s University of Belfast.

11 ÉRZÉKELÉS: 3D 1D Figure 1. Schemes for target site location. Csúszik Ugrál Áthurkol Halford S E, Marko J F ucl. Acids Res. 2004;32: by Oxford University Press

12 Bázis kivágó DS hibajavítás (BER) DS-glikoziláz felismeri a sérült/hibás bázist A sérült/hibás bázis lehasítása, szubsztrát elengedés, AP hely AP endonukleáz a cukor-foszfát gerincet a hibától 5 irányban elvágja Polβ hidrolizálja az 5 dezoxiribóz foszfátot és kitölti a lyukat; ligáz összevarr Jacobs and Schär, DA glycosylases: in DA repair and beyond. 2012, Chromosoma

13 DS módosulás Érzékelők Jelátalakítók Végrehajtók Jelátvitel DS javítás Sejtciklus leállítás Továbbírás Sejthalál

14 Orvosbiológiai vonatkozások DS-módosulások a karcinogenezisben: mutációs gyakoriság hibás gének, pl BRCA Tumorsejtek támadása a DS-károsodás válaszreakciói útján Fertőző mikroorganizmusok elleni küzdelem (mikobaktérium stratégia: hibatűrő polimerázok) Kutatási módozatok Organizmus-szint: humán tumoros vs normál sejtvonalak Drosophila modellek (Szeged, Budapest) In vitro: molekuláris és szerkezeti biológia, kinetika, egyedi molekulavizsgálatok

15 BRCA: egy DS-javító fehérje mutációi a karcinogenezisben

16 A DS kémiai tere limitált! Ez sok korlátot jelent De vannak azért érdekes, ritkább alkotók is! Ritka bázisok: lehet hiba, lehet jel

17 A DS kémiai tere limitált! METILÁCIÓ: citozin, adenin Prokarióták: saját DS definiálása Eukarióták: génkifejeződés szabályozása, epigenetika

18 Szokatlan alkotóelemek: szokatlan szerepek Uracil - Hiba - Jel a immunoglobulin gének diverzifikációjához - Fejlődésbiológiai kapcsoló - HIV genom integrálódáshoz kell - U-DS fágok Ribonukleotidok - Hiba - Távtartó-vezérelt száltörés indukálás (architektúra-elem)

19 Első fejezet: Uracil: hiba, amit javítani kell

20 Dezaminált citozin: mutagén uracil H guanin H O H H H O H citozin H H H H dezaminálás G-C A-U O H O H uracil CH 3 DS replikáció H H O CH 3 H H O CH 3 H adenin H O H timin vagyis: 5-metil-uracil H adenin H O H uracil

21 Timin-helyettesítő uracil: ártalmatlan uracil A-T A-U datp dttp >> dutp datp dttp << dutp DS szintézis DS szintézis H H O CH 3 H H O CH 3 H adenin H O H timin vagyis: 5-metil-uracil H adenin H O H uracil

22 Citozin dezaminálás 500/nap/genom MUTAGÉ Javító rendszert igényel: báziskivágó javítás (BER) Uracil a DS-ben? Két útvonal Timin-helyettesítő beépülés magas sejtbeli dutp/dttp ÁRTALMATLA nem feltétlenül javítandó, de BER szubsztrát hiábavaló ciklust generál

23 * * A G G T C U T A C C A U G T C A G A T T A G C T A C A T C G pol G U A G T C A C G Uracil (dump) DS-ben Bázis kivágó javítás uracil-da Glycosylase UDG A T C G A T Hogyan jön létre? T C C A G A G T dtp pool safeguarding Hogyan távolítható el? APendonuclease APE T C C A G A G T Uracil mentesség biztosítása dutpase dutp hydrolysis KIVÁGÁS : UDG Dezaminált citozinra és timin-helyettesítő uracilra egyaránt DP dmp MEGELŐZÉS : dutpáz Csak timin-helyettesítő uracilra

24 dutpáz hiánya genomi instabilitást okoz dump dump dutpáz dutp dutp dttp dttp dutpase high dutp/dttp U U U U DA DA polymerase polymerase U U U C U U U U U Uracil (U) (U) substituted DA DA BER C DA double strand breaks Chromosome fragmentation CELL DEATH A dump-nek, a dttp prekurzorának termelése precursor provides dttp A dutp szint csökkentése decreases dutp level Lack of dutpase Lack of dutpase Pécsi et al, 2011 PAS Toth et al 2007 JBC Kovári et al 2004 JBC Dubrovay et al 2004 JBC Barabás et al 2004 JBC Békési et al 2004 JBC émeth et al 2007 AR Varga et al 2007 FEBS Lett Vértessy 2009 Acc. Chem. Res. Merényi et al, 2010 FEBS J Pukáncsik et al 2010 FEBS J Pécsi et al, 2010 AR Horváth et al, 2010 AR Békési et al, 2011 FEBS J Muha et al, 2012 PLoS Genetics

25 Timinmentes sejthalál: a kemoterápia egyik fő eszköze dutpáz inhibitor dutp dump THF DA Fluorouracil (FdUMP) TS DHF reductase Methotrexate dttp dtdp dtmp dihydrofolate Az inhibitorok sejthalált indukálnak a dttp / dutp arány perturbálása révén, a timidilát szintáz (TS), dihidrofolát reduktáz (DHF) vagy a dutpáz gátlásával. p53-deficiens tumorsejtekben is működő stratégia!

26 Főbb céljaink A timinmentes sejthalál vizsgálata humán tumoros és normál sejtvonalakban Az uracil-ds szerepének felderítése különböző organizmusokban dutpáz-gátló gyógyszerjelöltek azonosítása: tumorok ellen, de patogén mikroorganizmusok ellen is!

27 Projektek/Módszerek Szerkezeti biológia Mechanistic studies Species-specific characteristics Folding Enzyme kinetics Low resolution conformational spectroscopies (CD, fluoresc.) EPR-EDOR Multidimensional MR X-ray crystallography Mit vizsgálunk: Uracil-DS metabolizmus Élettani szerep Developmental and cellcycle-dependent regulation Role in DA repair / apoptosis Mechanism of thymine-less cell death Expression patterns Subcellular localisation Proteomic search for interacting networks Overexpression Knock-out / RA interference ucleo-cytoplasmic trafficking

28 Superova egykristály diffraktométer Biostruct Laboratórium Kristályosítás és röntgenkrisztallográfia -kis- és makromolekuláris/komplexek- Mosquito kristályosító robot 96 csepp/2 perc Contact: BME CH épület Biostruct laboratórium Homepage: Budapest, 1113 Szt Gellért tér vertessy@enzim.hu, leveles@enzim.hu Képalkotó rendszer/rock Imager

29 dutpáz szerkezet Szimmetrikus homotrimer B A B A C C C Három aktív centrum Mindhárom monomer részt vesz az aktív centrum felépítésében

30 Mg 2+ Mg 2+ dutpáz + + 2H + Asp42 IV Arg120 Arg79 Mg I Gln123 W cat Ala39 Asp95 Val93 mc III Ile94 Ser81 II Ser80 nucleotide Tyr98

31 Intermedierek a reakció koordináta mentén b E-S S c a E Approach Intermediate, (E-AI) TS mimic intermediate (E-S/E-piP mix) d * e Post-attack Intermediate (E-piP) P f E-P

32 Intermedierek a reakció koordináta mentén: 3D szerkezetek különböző intermedierekre E-I int, mix density ear-attack conformer 2.5 A ote: Wcat and ap densities separate. Intermediate model shown in dark red. Mixture model shown in two shades of green. Light green: the product dump, dark green: the substrate a,b-imino-dutp

33 Dissociative mechanism Expected intermediate Reactants Expected intermediate Products Associative mechanism Crystallographic intermediate 1 (E-AI) Crystallographic intermediate 3 (E-piP) Experimentally described intermediates 1-3 Crystallographic intermediate 2 (E-S/E-piP mix)

34 dutpáz gátlás hatása a sejt proliferációra 5-FdUR jelenlétében Survival (% of Control) h 48h 72h 96h Incubation time (hours) gyakran használt kemoterápiás szer dutpaz gatolt kontroll1 kontroll2 dutpáz gátlás nagyban növeli az érzékenységet 5-FdUR-re

35 Timinmentes sejthalál: a kemoterápia egyik fő eszköze Proof of concept: igazoltuk, hogy itt a több helyen való támadás előnyös! DA dutp dttp dtdp dutpáz inhibitor. sirs Fluorodezoxi-uridin dump TS dtmp THF DHF reductase dihydrofolate Methotrexate Az inhibitorok sejthalált indukálnak a dttp / dutp arány perturbálása révén, a timidilát szintáz (TS), dihidrofolát reduktáz (DHF) vagy a dutpáz gátlásával.

36 Szerkezet és mechanizmus alapú inhibitor tervezés Munkafolyamat 1. HTS In silico screening 2 millió vegyületre 2. In vitro enzimtesztek vegyületre 3. Sejtbeli gátlás 350 vegyületre 4. Humán sejt vizsgálatok 50 vegyületre 5. Állatkísérletek 6. Szabadalmaztatás Humán dutpáz: rákos sejtekben túltermelt, védő faktor a tumornak Ha gátoljuk, csökken a tumorsejt életképessége

37 Tuberkulózis és malária: dutpáz, mint közös target fehérje Mycobacterium tuberculosis és Plasmodium falciparum Két fontos enzim hiányzik -dcmp dezamináz -Timidin kináz dutpáz: emcsak a dutp elbontásában, hanem a dump/dttp termelésben is kulcsszerepe van

38 M. tuberculosis dutpáz Mikobaktérium-specifikus szegmensek Specificitási szegmensek : fajspecifikus inhibitorok Varga et al 2008, Pécsi et al 2012 PDB ID: 2PY4

39 Második fejezet: Uracil: jel, ami élettanilag fontos

40 Paradigma váltás Korábban csak hibaként tekintetbe vett DS módosulások új szerepei Uracil, illetve egyéb DS-hibák a javító útvonalakon kívül más jelátviteli útvonalakba is bekapcsolódhatnak

41 Az uracil bázis fontos jelátviteli szignál: IgG gének, indukált dezaminálás adott helyen A megfelelő helyen keletkezett uracil elindítja a DS-száltöréshez vezető utat UG enzim hiánya egérben: immundeficiens tünetegyütteshez vezet

42 DS károsodások ds DS törés G A T C Hamis pár C-U dezaminálás ss törés Timidin dimer AP hely Kovalens keresztkötés M J Larkin Biology & Biochemistry. The Queen s University of Belfast.

43 Hibás bázis vagy metil-citozin BER javítás és epigenetika kapcsolata TDG(UDG)-függő aktív demetiláció DS glikoziláz UG/TDG Kivágott bázis

44 Uracil-DS: - közvetlen mérés a genomi DS-ből a személyre szabott gyógyítás indikátora lehet - mintázatának feltérképezése a jelátviteli funkciók megértéséhez is kell Hogyan mérhető a genomi uracil? Több módszer létezik: kvalitatív, kevéssé érzékeny Tömegspektrometria: viszonylag megbízható, de hosszadalmas, indirekt EGYIK SEM ALKALMAS A KÖRYEZET FELDERÍTÉSÉRE!

45 fluorescence fluorescence Horváth and Vértessy, ucleic Acids Research, 2010 Muha et al PLoS Genetics, 2012 PCR-alapú assay: Közvetlen Egylépcsős Kvantitatív 5 5 Pfu wt pol U Pfu V93 pol U Pfu V93 (1057b) Pfu wt (1057b) Cq Shift Pfu V93 (544b) Pfu wt (544b) Cq shift cycle number cycle number

46 deoxyuridine content (1/million) Viability (%) Cq (Pfu wt) deoxyuridine content (1/million) A A DS-beli wt E. coli uracil tartalom 40 Ung- E. coli Dut-,Ung- E. coli Génhiányos sejtek Cq (Pfu V93) a kvantitatív PCR módszerrel az egyes különböző sejtekben és állapotokban -sejtciklus fázisok, - gyógyszeres kezelés, - génkiütések jól mérhető, tetszőlegesen feltérképezhető C wt MEF Ung-,- MEF Génhiányos sejtek és FUdR kezelés FUdR added ( M) B dut ung 5FUdR (µm) D wt MEF Ung-,- MEF FUdR ( M) Génhiányos sejtek FUdR kezelés Sejtciklus állapotok

47 Uracil-DA in Drosophila dutpáz jelenléte negatív korrelációt mutat a DS-beli uracil szinttel Relative dutpase mra level Relative dutpase mra level dutpase DAPI Muha et al. 2012, PLoS Gen. 1,0 0,8 dutpáz szint WT RAi 0, , ,2 0,0 E L1 L2 L3 Developmental stages P disc sal.gl. Uracil szint

48 Uracil-DA in Drosophila dutpáz gátlása transzgénikus muslicában letális no of TUEL positive cells/img. disc Báb-állapotbeli elhalás WT RAi TUEL assay WT RAi Muha et al. 2012, PLoS Gen WT dut RAi dutpáz gátlás egyes szöveti régiókra irányítható: ahol gátolva van, pontosan ott elhal a szövet! 100% 80% 60% blistered deformed 40% 20% WT MS1096 sira 0% ; DmDut ; DmDut ; DmDut ; DmDut29

49 Ecetmuslica modellszervezet: A dutpáz élet/halál döntést közvetít, a DS-beli uracil jelenléte a fejlődési állapottól függ A dutpáz jelenlétében túlélnek, hiányában elhalnak a szövetek

50 Konklúziók: A DS módosulások karcinogén hatásuk mellett más szerepeket is betöltenek A DS-beli uracil adekvát példája a kettős szerepnek A rákterápiában gyakori gyógyszerek hatásmechanizmusát vizsgáljuk többféle nézőpontból Módszert alkottunk a DS-beli uracil genom-környezetbeli feltérképezésre A dutpáz lényegi voltát igazoltuk, jelenleg a kapcsolódó jelátviteli utakat vizsgáljuk

51 Genom Metabolizmus Laboratórium Köszönet: Hudecz Ferenc Perczel András ELTE Erdélyi Miklós Szabad János Henn László SZBK Genetika

52