A nociceptinerg rendszer változása hepatológiai kórképekben, különös tekintettel a hepatocelluláris carcinomára

Átírás

1 SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA A nociceptinerg rendszer változása hepatológiai kórképekben, különös tekintettel a hepatocelluláris carcinomára Doktori (Ph.D.) értekezés DR. HORVÁTH ANDREA Témavezeto: Dr. Szalay Ferenc, Ph.D. Semmelweis Egyetem, I. sz. Belgyógyászati Klinika Budapest,

2 Szigorlati Bizottság: Elnök: Prof. Dr. Papp János Ph.D. Tagok: Dr. Tímár Júlia Ph. D. Dr. Horváth Gábor Ph.D. Hivatalos Bírálók: Dr. Werling Klára Ph.D. Dr. Szalai László Ph.D. 2

3 TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE...5 I. BEVEZETÉS...7 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS...9 A. a nociceptin és receptora A nociceptin és a nociceptin-receptor elnevezése A NOP receptor A NOP receptor ligandjai (nociceptin, nocistatin, nociceptin II, exogén ligandok) A nociceptin intracelluláris jelátviteli mechanizmusai A nociceptin metabolizmusa és bioaktív metabolitjai...17 B. A nociceptin neurokémiai hatásai Központi idegrendszeri hatások Perifériás hatások...20 C. A nociceptin farmakológiai hatásai Központi idegrendszeri hatások A nociceptin perifériás hatásai...25 D. A nociceptinerg rendszer klinikai vonatkozásai: humán vizsgálatok Fibromyalgia A nociceptinerg rendszer jellemzése különbözo fájdalommal járó betegségekben...30 E. A non-nociceptinerg opioid rendszer és a májbetegségek kapcsolata...33 F. A hepatocelluláris carcinoma...34 III. CÉLKITUZÉSEK A. Humán vizsgálatok...37 B. Experimentális hepatocelluláris carcinoma modell...38 IV. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK A. HUMÁN VIZSGÁLATOK Kontroll csoport Beteg csoport Stádiumbeosztás...41 B. KÍSÉRLETES ÁLLATMODELL Májcirrhosis és hepatocelluláris carcinoma modell Fischer-344 patkányokon Vér, liquor, és májszövet mintavétel Laboratóriumi paraméterek Szövettani feldolgozás...43 C. Mérési módszerek: Plazma, CSF, májszövet nociceptin és nocistatin tartalmának meghatározása radioimmunoassay segítségével Mintavétel, elotisztítás, és extrakció Szöveti nociceptin és nocistatin meghatározás Májszövet Ascites nociceptin szintjének vizsgálata...44 D. Extrakció...44 E. A radioimmunoassay módszer leírása...45 F. Statisztikai analízis

4 V. EREDMÉNYEK A. Plazma nociceptinszint vizsgálatok krónikus májbetegekben...47 B. ESETISMERTETÉS: Primer biliáris cirrhosis talaján kialakult hepatocelluláris carcinoma; plazma nociceptin szint követése a daganat kialakulásával párhuzamosan...51 C. Hepatocelluláris carcinoma és cirrhosis modell Fischer-344 patkányban...54 D. a nocistatin szint kísérletes hepatocelluláris carcinomában...61 E. A nociceptin tartalom vizsgálata humán daganatos májszövetben és az azt körülvevo nem daganatos májszövetben...62 F. Nociceptin szintje különbözo etiológiájú daganatokban...64 G. A nociceptintartalom kimutatása ascitesben...65 VI. MEGBESZÉLÉS A. Plazma nociceptin szint vizsgálatok hepatológiai kórképekben...67 B. Primer biliáris cirrhosis talaján kialakult hepatocelluláris carcinoma: a plazma nociceptin szint követése a daganat kialakulásával párhuzamosan: az eset megbeszélése...69 C. Kísérletes májcirrhosis és hepatocelluláris carcinoma...70 D. a nocistatin szint kísérletes hepatocelluláris carcinomában...73 E. A nociceptin tartalom vizsgálata humán daganatos májszövetben és az azt körülvevo nem daganatos májszövetben...73 F. Extrahepatikus daganatok és májmetasztázisok...73 G. nociceptintartalom kimutatása ascitesben...74 VII. KONKLÚZIÓ VIII. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK IX. ÖSSZEFOGLALÓ X. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

5 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 5HT Ach APN Ca camp CHO CRF DA EDTA EFS EGFR EP ERK GABA GPRC HCC i.c.v. JNK K LTP MAPK mrns NF?-B N/OFQ NA NCAM NMDA NOP NPY NT szerotonin acetilkolin aminopeptidáz N kalcium ciklikus adenozil-monofoszfát tengerimalac petefészeksejtek kortikotropin releasing faktor dopamin ethylén-diamin-tetraacetát elektromos terület stimuláció epidermális növekedési faktor receptor endopeptidáz extracelluláris jel mediált kináz gamma-amino-vajsav G proteinhez kapcsolt receptor hepatocelluláris cacinoma intracerebroventrikuláris c-jun NH2-terminális kináz kálium tartós potenciáció mitogén aktivált protein kináz messenger ribonukleinsav nukleár faktor kappa B nociceptin/orphanin FQ noradrenalin idegsejt adhéziós molekula N-metil-D-aszpartát nociceptin receptor neuropeptid Y nocistatin 5

6 ORL1 opioid receptor-like 1 receptor PAG periaqueductalis szürkeállomány PKC protein kináz C PLC foszfolipáz C ppn/ofq prepronociceptin PTX pertussis toxin RT-PCR real-time polimeráz láncreakció SP substance P STAT signalling transductor and activation of transcription TGFa transforming growth faktor alfa TH tyrozin-hidroxiláz TM tuberomamillaris 6

7 I. BEVEZETÉS M ég nincs tíz éve (1995), hogy a nociceptint (N/OFQ) és receptorát (NOP), mint az opioid peptid család egy új tagját elsoként leírták. 1, 2 A peptid az eltelt idoben a farmakológiai kutatások homlokterébe került. Ma már számos központi idegrendszeri és perifériás hatása ismert, és továbbra is kiterjedt kutatás folyik szerepének élettani és kórtani körülmények közötti megismerése, valamint farmakológiai jelentoségének tisztázására. A nociceptin a nevét, a fájdalomérzetet befolyásoló tulajdonságáról kapta. 3 A nociceptin egy 17 aminosavból álló polipeptid, amely szerkezetében leginkább a dinorfin-a-hoz hasonlít. A nagy hasonlóság ellenére a nociceptinben, a többi opioid peptidtol eltéroen, az elso helyen tirozin helyett fenilalanin található. Hasonlóság mutatkozik még a C-terminálison lévo aminosavig terjedo szakaszban, amelynek azonban a receptoraktivációban nincs szerepe. A szerkezeti egyezések ellenére a nociceptin nem kötodik a klasszikus?-,?-, és?- opioid receptorokhoz. 2 A pre-pronociceptinbol (ppn/ofq) enzimatikus hasítással képzodik a központi idegrendszerben és a periférián egyaránt. Ebbol a 176 aminosavat tartalmazó polipeptidbol a nociceptinen kívül több biológiailag aktív neuropeptid, mint a nocistatin és a nociceptin II hasad le, amelyek nem a NOP receptoron, hanem saját receptoraikon fejtik ki hatásukat. 4 A pre-pronociceptin génje emberben a 8. kromoszómán, a 8p21 régióban található. 5 A nociceptin receptora az állatkísérletes adatokkal egyezoen 18 számos humán idegrendszeri struktúrában megtalálható. Szerepet tulajdonítanak a nociceptinnek a stresszhatás kapcsán fellépo vegatatív és viselkedési reakciókban, a szorongás és a stressz érzelmi komponenseinek összehangolásában, vegetatív funkciók szabályozásában, mint az artériás vérnyomás, a szívfrekvencia, a légzés és az endokrin szabályozás, a figyelem, a tanulás, és a memóriafunkciók, a fájdalomérzés, és a hypothalamo-hypophyseális rendszer muködésének szabályozásában. A hepatocelluláris carcinoma (HCC) a leggyakoribb primer májdaganat, amely foként a krónikus májcirrhosis szövodményeként alakul ki. Évente a világon több mint új esetet regisztrálnak. Két és félszer annyi férfi lesz májdaganatos, mint no. Az esetek gyakorisága évrol-évre no, és földrajzi és nemi megoszlásokat mutat. 6, 7 A fo kockázati tényezok a hepatitis B és C vírusok, az alkohol, az aflatoxin, az orális antikoncipiensek, a dohányzás mellett számos úgy nevezett minor kockázati tényezo 7

8 is szerepel, mint az öröklodo anyagcserezavarok, étkezési szokások és kemikáliák (arzén). A HCC szurése az egész világon kulcsfontosságú, annak ellenére, hogy nem áll rendelkezésünkre egyetlen 100%-ig specifikus és szenzitív módszer sem. A szérum alfa-fetoprotein egy olyan markere a HCC-nek, amelynek szenzitivitása 39-65%, specificitása 76-94%, a pozitív prediktív értéke pedig 9-50%. 8, 9 Bár a nociceptint már tíz éve felfedezték, és a farmakológiai kutatások száma nagy, a klinikai kutatások száma csekély. A Semmelweis Egyetem Gyógyszerhatástani Intézete és az I. sz. Belgyógyászati Klinika kutatócsoportja bebizonyította, hogy Wilson kórban emelkedett a nociceptin szint. A kutatások azon fázisába kapcsolódtam be, amikor egy Wilson kóros betegben kiugróan magas plazma nociceptin szintet mértünk. Késobb igazolódott a beteg hepatocelluláris carcinomája. Célunk primer hepatocelluláris carcinomában, illetve egyéb hepatológiai betegségekben a nociceptinerg rendszer vizsgálata volt. Továbbá kísérletesen létrehozott hepatocelluláris carcinoma modellen kívántuk vizsgálni a plazma, liquor, agy és májszövet nociceptin tartalmát. Módszert dolgoztunk ki különbözo májból, valamint ascitesbol történo nociceptin meghatározásra. Humán hepatocelluláris carcinoma szövetben, valamint azt körülvevo cirrhotikus részben mértük meg a nociceptintartalmat. 8

9 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS A. A NOCICEPTIN ÉS RECEPTORA 1. A nociceptin és a nociceptin-receptor elnevezése A klasszikus opioid receptorokkal nagy homológiát mutató új receptort ORL1-nek 26 (opioid-receptor-like 1) késobb OP4-nek nevezték el. 10 A nociceptin-receptor szerkezete és transzdukciós mechanizmusa alapján az opioid receptorcsalád új, negyedik tagjának tartották. A klasszikus nem szelektív opioid receptor ligandok (pl. naloxon) alacsony affinitást mutatnak az ORL1 receptorhoz, ugyanakkor rendkívül nagy affinitással kötodnek a?-,?-,?-, receptorokhoz. Az orphan, azaz árva nevet ez alapján a tulajdonsága alapján kapta. Maga a ligand, a nociceptin is számos nevet kapott az eltelt bo tíz évben: nociceptin (NC, Noc, Noci), orphaninfq receptor nevet (OFQR, NOR hasonlóan a klasszikus opioid receptorokhoz MOR, DOR, és KOR). Ezt követoen a IUPHAR évi nevezéktan jelentésében a receptor az NOP (nociceptin-receptor) és az N/OFQ (nociceptin) elnevezést kapta. 2. A NOP receptor A NOP receptor génje a humán 20. kromoszóma q régiójában található. 1 A 370 aminosavból álló fehérje 7 hidrofób, egyenként aminosavból álló transzmembrán domént tartalmaz, amelyet intra- és extracelluláris variábilis régiók kapcsolnak össze. Három aszparaginhez kötött glikolizációs hely található az N- terminális régióban (Asn 21, Asn 28, Asn 39 ), cisztein residuumok az extracelluláris hurkon (Cys 123, Cys 200 ), és potenciális acilációs helyek a C-terminális intracelluláris régióban (Cys 324 ). (1. ábra) A többi opioid receptor a transzmembrán doménekben és az intracelluláris hurkokban mutat hasonlóságot a NOP-pal. A szekvenciaazonosság az NOP, a?-,?-, és?-opioid receptorok között igen magas (63-65%-os homológia). 11 9

10 NH2 Q286: köti a nociceptint, de funkcionálisan inaktív S-S P P P P P P P P N133W: folyamatosan aktiválja az ORL1 receptort A216K, T3051I és VQV ( )IHI: köti a nociceptint és a dinorfin A-t Asp 130,Tyr 131, Phe 220, Phe 224 és Trp 276 : a ligand köto régióban vannak COOH 1.ábra A NOP receptor szerkezete (New et al.) Az immunhisztokémiai vizsgálatok eredménye szerint a NOP receptor megtalálható a központi idegrendszeri szabályozó rendszer szinte valamennyi magcsoportjában, így az adrenerg/noradrenerg, kolinerg, dopaminerg, szerotonerg magcsoportokban. A NOP receptor és mrns-e nagy koncentrációban van jelen az adrenerg rendszer részét képezo locus coeruleus területén. Mivel a locus coeruleus összetett feladatokat lát el az agyban, ezért feltételezhetoen a nociceptinerg rendszernek is szerepe van számos, a stresszhatás kapcsán fellépo vegetatív és viselkedési reakcióban. A nociceptin nagy mennyiségben van jelen az amygdalában, a septohippocampalis régióban, a thalamicus és a hypothalamicus magvakban, valamint a paraventricularis hypothalamusban 12, 13. Ezek a területek részt vesznek a félelem, a szorongás és a stressz érzelmi komponenseinek összehangolásában. A NOP receptor szintén nagy koncentrációban kimutatható nucleus tractus solitarii-ban és az oldalsó retikuláris magcsoport területén. Ezek a magcsoportok olyan vegetatív funkciók szabályozásában vesznek részt, mint az artériás vérnyomás, a szívfrekvencia, a légzés és az endokrin szabályozás. 14 A NOP receptorok megtalálhatók az elülso bazális kolinerg complexben, a telenkefalon és a tegmentális magcsoportok területén. A kolinerg neuronok kapcsolatban állnak a kérgi területekkel a hippocampusszal, a thalamus-szal, és az agytörzsi területekkel, amelyek a figyelem, a tanulás, és a 10

11 memóriafunkciók szabályozásában vesznek részt. Ezen kívül jelen vannak a szintén kolinerg rostokat tartalmazó retina amakrin sejtjein. 15 A NOP receptor mrns expressziója a substancia nigra területén azt mutatja, hogy a nociceptin hatással van a mozgáskoordinációt szabályozó nigro-striatralis dopaminerg rendszerre. A NOP receptor jelenléte a ventrális-tegmentális area területén arra utal, hogy a nociceptinerg rendszer befolyásolja a mezokortikolimbikus rendszeren keresztül a motivációt, a hangulatot, és a gondolkodást. 16 A raphe magvak a központi idegrendszeri szerotonin szintézis helyei, ahol szintén nagy mennyiségben megtalálhatóak a NOP receptorok és a receptor mrns is. A nociceptin a raphe magvak területén a K + -áram fokozásán keresztül gátolja a neuronális aktivitást. 17 A nociceptin jelen van a nucleus raphe magnusban, így a szerotonerg rendszerre (raphe-magvak) hatva a fájdalomérzés supraspinalis kontrolljában tölt be szerepet. 18 A NOP receptor aktiváció mutatkozik a kérgi szerotonin felszabadulás legfontosabb preszinaptikus modulátorának. 19 gerincvelo hátsó szarvának valamennyi rétegében reprezentált, legnagyobb mennyiségben a II. laminában; elsosorban az interneuronokban van jelen. A NOP receptor központi idegrendszeri eloszlása alapján feltételezheto volt, hogy ligandjai a fájdalomérzet kialakulására, a tanulásra, az emlékezésre, a figyelemre, az érzelmekre, a mozgásra, a szimpatikus, paraszimpatikus és érzo neuronokra, valamint a hypothalamo-hypophyseális tengely muködésére egyaránt hatással lehetnek. A NOP receptor jelenléte bizonyított a perifériás idegrendszer mellett a különbözo perifériás szövetekben is. Azonosították patkány bélen 174, egér vas defferensen 20, tengerimalac gyomor-bél traktusában, májában 21. RT-PCR-al igazolták jelenlétét a tengerimalac idegdúcaiban, mint a prevertebrális és paravertebrális szimpatikus idegdúcokban, valamint a nyaki idegdúcokban. A receptorkötési vizsgálatok alapján a nociceptin nagy affinitással kötodik patkány retinán 15 és szíven 22. Humán vizsgálatok, és állatkísérletek is kimutatták perifériás szövetekben is: a 23, 24, 25 belekben, vas deferens-ben, a lépben, a májban valamint a limphocytákban. A 3. A NOP receptor ligandjai (nociceptin, nocistatin, nociceptin II, exogén ligandok) Az opioid receptor család negyedik tagjának a felfedezése óriási lökést adott az opioidok kutatásának. Az új G-proteinhez kapcsolt receptor egyértelmuen az opioid 11

12 receptorokhoz hasonlított, de nem kötötte meg az opiátokat hasonló affinitással, mint a többi receptor. 26 Egy évvel késobb két egymástól független kutatócsoport azonosította az új receptor ligandját, a 17 aminosavból álló neuropeptidet, amelyet az egyik kutatócsoport nociceptinnek 2, a másik pedig orphanin FQ-nak nevezett el. 27 Így az agyi opiátoknak ma öt csoportját ismerjük: dinorfinok, endomorfinok, enkephalinok, bétaendorfinok és a nociceptin. A N/OFQ a 176 aminosavból álló prekurzor molekulából a pre-pronociceptinbol (ppn/ofq) hasad le, amelynek génje a 8. kromoszóma 8p21 régiójában található. 5 Prekurzor K R K K K R R R Peptidek Nocistatin N/OFQ OFQ II (1-17) OFQ II (1-28) ábra A prepronociceptin és hasítási termékei. A többi prekurzor molekulához hasonlóan a ppn/ofq a nociceptinen kívül egyéb biológiailag aktív peptidet is tartalmaz, mint a nocistatin (NT) és a nociceptin II (N/OFQII). A ppn/ofq mrns központi idegrendszeri eloszlása nagyon hasonló a NOP eloszlásához. 5 Mindketto az agy legtöbb régiójában megtalálható, kivéve a kisagyban. A nociceptin jelentos mennyisége a paraventricularis hypothalamusban (mint a corticotropin-releasig faktor (CRF) forrása), arra utal, hogy a nociceptin a hypothalamo-hypophyseális rendszer muködésének is szabályozója. A camp analógok indukálják a ppn/ofq gén expresszióját, a fehérje szintézisét és szekrécióját NS20Y neuroblastoma sejtvonalon

13 1. táblázat Az immunreaktív nociceptin mennyisége különbözo agyi régiókban (Witta és munkatársai 2004) Régió N/OFQ fmol/mg Régió N/OFQ fmol/mg átlag ± SEM átlag ± SEM Cortex Basális magok Prefrontális 10.6 ± 0.92 Nucleus caudatus 4.83 ± 0.46 Frontális 7.95 ± 2.21 Putamen 4.48 ± 0.86 Cingulum ± 0.74 Globus pallidus 2.2 ± 0.43 Parahippocampus 4.87 ± 0.93 Substantia nigra 7.93 ± 0.75 Insula ± 1.31 Somotomotoros 7 ± 0.84 Thalamus Somatosensoros 8.99 ± 0.82 Nucleus thalamus anterior ± 4.46 Temporális 7.39 ± 2.29 Dorsomediális 8.78 ± 2.4 Occipitális 5.9 ± 0.55 Ventrális 4.02 ± 0.79 Fehérállomány 0.72 ± 0.2 Pulvinar 8.3 ± 2.02 Laterális 7.3 ± 2.92 Limbikus rendszer Mediális ± 6.77 Hippocampus 7.69 ± 1.3 Habenula 4.41 ± 1.2 Hypothalamus Septum ± 6.76 Anterior/preoptikus ± 4.83 Amygdala ± 2.44 Supraoptikus ± 4.72 paraventrikuláris ± 4.3 Cerebellum Ventromediális ± 9.83 Cortex 1.94 ± 0.23 Magok 0.91 ± 0.1 Agytörzs Fehérállomány 0.61 ± 0.12 Nucleus ruber 3.61 ± 0.88 Nucleus pontin 1.66 ± 0.18 Gerincvelo Pontine tegmentum ± 2.89 Hátsó szarv ± 9.24 Locus coeruleus ± Elülso szarv 6.75 ± 0.95 Retikulum ± 3.82 Szürkeállomány ± Trigeminus nucleus ± 4.13 Funiculus 0.47 ± 0.04 Ventromedulláris medulla Fontos szerepet tulajdonítanak a nociceptinnek az akut stresszre adott válasz endogén szabályozásában 29, miután más fontos stressz neuropeptidek hatásának összehangolásában is részt vesz, mint a CRF, a cholecystokinin (CCK), a neuropeptid Y (NPY), és a supstance P (SP) esetében bizonyított. 30 A nocistatin a nociceptin antagonistájának bizonyult, de kimutatták, hogy a nociceptin II egyes hatásait is antagonizálja. Míg a nociceptin a legtöbb fajban azonos aminosavszerkezetu, addig a nocistatin szerkezete minden fajban más és más. Egyedül a karboxiterminális hexapeptid orzi a közös eredet nyomait, és felelos a központi 13

14 idegrendszeri hatásért. Az opioid peptidek rendelkeznek az N-terminális régióban egy motívummal (Tyr-Gly-Gly-Phe), amelyben elhelyezkedo tirozin felelos a receptorhoz kötodésért 31, 32. Ezeket a konzervatív régiókat a nociceptinben a dynorphin-a rokon régióira cserélve, az új vegyület elveszíti a NOP köto képességét, de képes lesz aktiválni a?- és?-opioid receptorokat. 33 Bár a NOP receptor sok konzervatív régióval rendelkezik, még sem található meg benne a hagyományos opioid-köto zseb, amely a többi opioid receptor ekvivalens helyén a ligand kötéséért felelos. Okuda-Ashitaka írta le eloször, hogy a nocistatin (NT) kis dózisban antagonizálja a nociceptin hatásait, nagy dózisban azonban nem. 34 Humán vizsgálatok igazolták az NT jelenlétét az agyszövetben, a liquorban. 35 A nocistatin a camp termelés fokozásával fejti ki hatását, az eddig még részletesen fel nem térképezett nocistatin receptoron keresztül. 36 Inoue és munkatársai megállapították, hogy mind a nocistatin, mind a nociceptin közös intracelluláris jelátviteli utakat aktivál G i/o, foszfolipáz C és substance P felszabadításával a kapszaicin érzékeny I-típusú C-rostokon. 37 A nocistatin tompítja a gátló GABAerg és glycerinerg interneuronokat a hátsó szarvban, ahol a N/OFQ gátolja a glutamáterg szinaptikus transzmissziót. 38 Mogil egy összefoglaló közleményben az addigi eredmények részletes elemzése után, feltételezte, hogy a krónikus fájdalom fokozott nocistatin termeléssel jár a gerincvelo hátsó szarvában. 39 A nociceptin II (azonos a bpnp-4-vel) a prepronociceptinbol lehasadó szintén 17 aminosavból álló polipeptid. Kevés kutatócsoport foglalkozott még ezzel a heptadekapeptiddel, az eredmények ellentmondásosak. Dózisfüggo analgéziát hoz létre mind spinális, mind supraspinalis alkalmazás után. 40 Japán kutatók megfigyelték, hogy a nociceptin II nocistatinszeru tulajdonságokat hordoz spinálisan injektálva, ugyanakkor spinális adogolásával nem lehet analgéziát kiváltani. 41 A NOP receptor farmakológiai ligandjait két nagy csoportra bonthatjuk: peptid és nem peptid ligandokra. A 17 aminosavból álló N/OFQ legjobban a dynorphin A-hoz hasonlít. Az N-terminális aminosav, amelyben különbözik a többi általános opioidtól, a fenilalanin (a tirozin helyett). Ez a különbség elég ahhoz, hogy ne tudjon a klasszikus opioid receptorokhoz kötodni. Varani és munkatársai kimutatták, hogy a fenilalanint tirozinra cserélve visszanyeri azt a képességét, hogy kapcsolódjon a?-, µ- és a d-opioid receptorokhoz. 42 A C-terminális amidálása megorzi a vegyület eredeti funkcióját és affinitását. A kezdeti kutatások kimutatták, hogy a legkisebb aktív aminosavrészlet a C- 14

15 terminális négy aminosav, bár a N/OFQ(1-13)OH már elveszíti a receptor affinitását és kevésbé eros. 4. A nociceptin intracelluláris jelátviteli mechanizmusai Bebizonyították, hogy a NOP receptor a többi opioid receptor szubtípushoz hasonlóan G i/o -proteinhez kapcsolódik, amely adenyl ciklázt, befelé irányuló K + - és feszültségfüggo Ca 2+ -csatornákat aktivál. Amikor a nociceptin és a többi opioid receptor intracelluláris jelátviteli mechanizmusait összehasonlították, egy különös paradox jelenséget figyeltek meg: a N/OFQ gyakran közömbösíti az opioidok hatását, bár látszólag ugyanazon a szignál-transzdukciós úton hat. A magyarázatot erre a kérdésre többek között az adhatja, hogy a NOP és többi opioid receptor az idegrendszer különbözo régióiban helyezkedik el, és a neuronális hálózat más-más lépését befolyásolja 43, más neuron csoportokat 44, 45, 46 aktivál a fájdalom szabályozásában. Adenyl cikláz A NOP kapcsolódik a másodlagos jelátviteli rendszerhez, az adenyl ciklázhoz. A NOP receptorral fertozött CHO és a HEK-293 sejtekben a nociceptin gátolja a forskolin 47, 48 stimulálta camp akkumulációt. Foszfolipáz C/Ca 2+ A NOP receptor aktivációja a foszfolipáz C/Ca 2+ /protein kináz C (PKC) intracelluláris jelátviteli rendszert hozza muködésbe. A PKC aktivációját a CHO sejteken figyelték meg, amelyek stabilan expresszálják a NOP receptort. A válasz PTX (pertussis toxin) szenszitív és gátolható a PKC inhibitorokkal, Ca 2+ -chelátorokkal és a foszfolipáz C (PLC) inhibitorokkal. 49 Ez a receptor aktiválási mintázat hasonlít az opioid receptoroknál megfigyelheto G ß? -alegység által létrehozott PLC ß -egység aktivációjához 50, 51, bár ennek az alegységnek a szerepét a nociceptin aktivációjában még nem bizonyították. A PLC ß stimulációjának szerepe még nem egyértelmu a nociceptinerg rendszer muködésében, bár néhány tanulmány igazolta, hogy a nociceptin által generált PKC aktiváció fokozott szuperoxid képzodéséhez vezet, amely károsítja a sertés piális artériáit hypoxia/ischemia után. 52 A G a16 és G a14 alegységek számos G i - kapcsolt GPCR-val (G-protein coupled receptor) lépnek interakcióba, lehetové téve, hogy azok aktiválják a PLCß jelátviteli rendszert. 15

16 MAPK (mitogén aktivált protein kináz) jelátviteli rendszererek A GPCR a sejt proliferációt és differenciációt szabályozza MAPK rendszer által. Ezek a szerin/treonin protein kinázok számos transzkripciós faktort képesek foszforilálni. 53 Legalább 3 MAPK szubtípust ismerünk: az extracelluláris szignál-regulált kinázok (ERK), amelyeket foként a növekedési faktorok stimulálnak, a c-jun NH2-terminális kinázok (JNK), és a p38 MAP kinázok, amelyek a celluláris stresszhatásokra érzékenyek. 54, 55 A N/OFQ stimulációja az NOP receptor expressziójához, amely az ERK indukciója által (PTX-szenzitív mechanizmus) az Elk-1 és a Sap1a transzkripciós faktorok aktiválásához vezet. 56 Ezt a folyamatot gátolni lehet a PKC és a foszfolipáz C inhibíciójával 57, 58, ami azt feltételezi, hogy p21 ras -független utak közvetítik a választ. Feltételezik, hogy a Gß?-alegység aktiválja ezt a folyamatot a PI3K/Src/SOS/p21 ras jelátviteli rendszeren keresztül. A STAT (signalling transducer and activator of transcription) proteinek számos cytokin, növekedési faktor és hormon mediátorai, és olyan immunológiai folyamatokat befolyásolnak, mint a sejtproliferáció, az apoptosis, és a differenciálódás. Kimutatták, hogy a nociceptin rendelkezik a neuronális differenciációt befolyásoló képességgel. 59 Az opioid receptorok is aktiválják a MAPK utat, de a többi opioid receptorral ellentétben számos szembetuno különbség van a szabályozásban. Mindhárom opioid receptor a G ß? -függo úton aktiválja a NOP receptort. A nociceptin parciálisan gátolja az N-típusú Ca 2+ -csatornákat 60, de a N/OFQ esetében az ERK aktivációja részlegesen függ a PLC aktivációjától. A jelátviteli mintázatban található eltérés a G i/o -kapcsolt receptoroknál figyelheto meg, amely magyarázatot adhat a nociceptin és a többi opioid eltéro in vivo hatásaira. Bár ezeknek a mechanizmusoknak a lényegét még nehéz fiziológiai funkciókra fordítani, de így is belátható, hogy a nociceptin gátolja a többi opioid hatását molekuláris szinten. Feszültség-függo Ca 2+ csatornák Az humán neuroblastoma sejtvonalon, amely endogén módon expresszálja a NOP receptort, a nociceptin parciálisan gátolja az N-típusú Ca 2+ -csatornákat. 60 A patkány hátsó gyöki ganglionjaiban és az egerek kis nociceptív trigeminális ganglionjaiban is megfigyelték, hogy a nociceptin szupresszálja a nagy-feszültségu, N-típusú Ca , 62 csatornákat. 16

17 Befelé irányuló K + -csatornák Xenopus oocytákon végzett vizsgálatok igazolták, hogy a NOP receptor képes aktiválni a K + -csatornákat. 63, 64 A NOP receptort expreszáló neuronokban a receptor és a K + csatornák funkcionálisan kapcsolódnak egymáshoz. A nociceptin aktiválja a befelé irányuló K + -csatornákat minden PAG (periaqueductalis szürkeállomány) neuronban és gátolja a gyors GABAerg és glutamáterg posztszinaptikus áramban a PAG neuronok nagy részében. 65 Összefoglalva elmondhatjuk, hogy a N/OFQ preszinaptikus inhibitoros és posztszinaptikus aktivációja által rendelkezik azzal a képességgel, hogy befolyásolja a PAG analgéziát, viselkedést és autonóm funkciókat irányító idegsejtjeit. Ca 2+ K + ORL 1 ORL 1 Ga 16 Ga 12 Ga 14 Pl3K? Rac Ga PLC ß?? Ga 1/o/z 14/16???? Src SOS Ras AC camp PKA ATP PKC IP 3 Ca 2+ raktár JAK2 JNK ERK p38 STAT3 STAT3 C-Jun Elk-1 p108 ATF-2 Sap1a CREB 3. ábra Intracelluláris jelátviteli mechanizmusok a sejtben és a sejtmagban a nociceptin receptor aktivációja után (New és munkatársai vizsgálata alapján) 5. A nociceptin metabolizmusa és bioaktív metabolitjai A nociceptin metabolizmusa patkány hyppocampusában két lépésben zajlik. Az elso lépésben az 1-13 aminosav hasítódik le, majd az 1-9 aminosav. A hasítási helyek az Arg 12 -Lys 13 és az Arg 8 -Lys 9 aminosavpárok. Érdekes, hogy mind az 1-13, mind az 1-9 fragmenseknek a C-terminális vége az Ala-Arg-Lys triplet. Ezt a mintázatot ismeri fel az enzim

18 A heptadekapeptid nociceptint az aminopeptidáz N (APN) illetve az endopeptidáz (EP) négy kritikus helyen hasítja a Phe 1 -Gly 2, Ala 7 -Arg 8, Ala 11 -Arg 12, és Arg 12 -Lys 13 67, 67 kötéseknél. Az így keletkezett metabolitok, N-, és C-terminális részek teljesen inaktívak az NOP receptoron, hiszen az aktiválásához szükséges minimális aktív szekvenciát N/OFQ (1-13) már nem tartalmazzák. 4 A gerincveloben a neutrális szerin endopeptidáz hasítja a nociceptint N/OFQ (1-11), majd (1-6 fragmensre). 68 Sejtkultúrákon igazolták, hogy a nociceptin 1-13 és 1-9 fragmensekre bomlik. A hasítást fémek és SH-reagensek gátolják, bizonyítva, hogy a metabolizmusban részt vevo enzimek metallo-endopeptidázok. 69 Ezeken a sejtkultúrákon a morfin képes mind a nociceptin felszabadulását, mind a metabolizmusát befolyásolni. 70 Humán perifériás vérmintában a hasítást foként az aminopeptidáz N végzi, amely egy Zink-kötött proteolitikus ectoenzim. Szelektív gátlása (EDTA) szinte teljes (95?2,6%) védelmet nyújt a nociceptin metabolizmusa ellen. A fo fragmensek a N/OFQ (3-17), (4-17) és az (5-17). 71 A kortikális régióban viszont az endogén opiátoktól eltéroen (EP 24.12), az endopeptidáz (EP 24.15) aktivitás a meghatározóbb. Az N-terminális 1-13 vég lehasítása teljes inaktivitást jelent az NOP receptoron (a C- termiális nem aktív). 72 B. A NOCICEPTIN NEUROKÉMIAI HATÁSAI 1. Központi idegrendszeri hatások In vitro vizsgálatok alapján kimutatták, hogy a N/OFQ gátolja az adrenalin felszabadulást tengerimalac, patkány és egér kortikális agyszeleteken 73, 74 és egér cerebelláris, hippocampális és hipothalamikus agyszeleteken 75, a dopamin felszabadulást egér striátumában 76, a szerotonin felszabadulást a patkány cortexében 77, 78 és egérben 75, 4. és a glutamát felszabadulást patkány cortex szeleteken 79. Bár a nociceptin a legtöbb agyi régióban gátolja ezeknek a neurotranszmittereknek a felszabadulását, nagyságrendbeli különbség mutatkozik a gátlás mértékében. 80 A naloxon gátolta a patkány cortex szeleteken a noradrenalin (NA) felszabadulást 74, ugyanakkor a magas koncentrációban adott naloxon nem befolyásolta a nociceptin gátlását a noradrenalin 73, szerotonin 74, és felszabadulásra 79. A nociceptinnek ez a gátló 18

19 hatása a noradrenerg neuronok preszinaptikus? 2- autoreceptoraihoz kapcsolt NOP receptoron keresztül valósul meg. 150 Számos közlemény bizonyítja, hogy az opioid peptidekhez hasonlóan a N/OFQ általános hatása az Ach felszabadulás gátlása. 81, 82 Patkány agyának striátumában in vitro és in vivo végzett vizsgálatok egyaránt azt mutatják, hogy az opioid peptideknek Ach felszabadulást gátló hatása van 81, 82, amely a?-opioid receptorok aktivációja révén fokozza a dopamin (DA) felszabadulást. 83 A nociceptin hatására létrejövo NOP aktiváció gátolja a kolinerg transzmissziót, ugyanakkor ez a hatás független a?-receptor hatástól mivel a nociceptinnek elhanyagolhatóan csekély az aktivitása a klasszikus opioid receptorokon. 11 In vitro patkány kortikális szinaptoszomában a nociceptin koncentrációfüggo mértékben gátolja mind a spontán, mind pedig a K + kiváltotta [ 3 H] - 5-HT kiáramlást. Így ez a neuropeptid a kérgi szerotonin felszabadulás legfontosabb preszinaptikus modulátora 19, jelentos szerepe van a központi idegrendszeri 5HT mediált biológiai funkciók irányításában. In situ hibridizációs vizsgálatok eredményei alapján az adenozin, és a dopamin neurotranszmissziót gátló kezelés nem okoz változást a nociceptin expresszióban szeptális és striatrális területen. 84 Az a tény, hogy a dopaminerg neurotranszmisszió gátlása a szeptum és a striatum területén nem befolyásolja a nociceptin expressziót arra utal, hogy a nociceptinnek a félelem, a szorongás és a stressz érzelmi komponenseinek összehangolásában tulajdonított hatása a dopaminerg rendszer közvetlen befolyásolásának eredménye lehet. A nociceptin és a nocistatin glutamát és GABA szinaptikus transzmisszióját, befolyásoló hatását patkány laterális amygdala sejteken vizsgálva, a nociceptin koncentráció-függo mértékben csökkentette a glutamát receptor- mediálta excitátoros posztszinaptikus potenciál (EPP) amplitúdóját, de a GABA receptor-mediált inhibitoros posztszinaptikus potenciál (IPP) mértékét is. 85 A nociceptin a morfinnal ellentétben jelentosen gátolta a tuberomammillaris (TM) neuronokban a hisztamin felszabadulást. A csökkenés a lassú K + áram fokozódásával hozható összefüggésbe. 86 A?-receptor mediálta hisztamin felszabadulás antinocicepciót hoz létre. A nociceptinnek a fájdalom kialakulásában betöltött szerepének egy 19

20 lehetséges útja, hogy gátolja az opioid kiváltotta hisztamin felszabadulást a TM neuronokból. In vivo tanulmányok során az intracerebroventrikárisan (i.c.v.) adott N/OFQ csökkentette a dopamin felszabadulást altatott patkányokban a nucleus accumbensben 87, a ventrális tegmentális areában 88, amely utóbbi bizonyítja, hogy a N/OFQ befolyásolja a mezolimbikus dopaminerg rendszert. Szintén i.c.v. adott nociceptin viselkedésfarmakológiai teszten dózis-függo mértéku anxiolitikus hatást okozott 89, már nem szedatív dózisban is. Ez a hatás valószínusíthetoen a nociceptinnek az akut stresszre adott válasz szabályozásában betöltött fontos szerepére utal, de ennek a mechanizmusa még nem ismert. Jenck és munkatársai feltételezték, hogy a félelem és a szorongás kialakulásában a CRF, a CCK, a NPY és a SP mellett a nociceptin szerepe egyaránt valószínusítheto, amelyek a GABA és monoamin rendszerek szabályozásán keresztül fejtik ki hatásukat Perifériás hatások Altatott nyulak retináján a nociceptin dózis-függo mértékben csökkentette a fény által kiváltott acetil-kolin felszabadulást. 90 Patkány gyomor-bél traktusában csökkenti az elektromos inger kiváltotta izom-összehúzódást és Ach felszabadulást mind a gyomorban, mind pedig a vékonybélben, de a vastagbélben azonban nem. 91 A nociceptin egyéb neurokémiai, perifériás hatásait az egyes perifériás szervrendszerekre kifejtett nociceptinerg hatások részben ismertetem. C. NOCICEPTIN FARMAKOLÓGIAI HATÁSAI 1. Központi idegrendszeri hatások a) A nociceptin és a fájdalom, fájdalomérzet Az agyi opiátoknak ma öt csoportját ismerjük: dinorfinok, endomorfinok, enkephalinok, béta-endorfinok és a nociceptin. 92 Viselkedés-vizsgálatok megerosítették, hogy a nociceptinnek fájdalomkelto és fájdalomcsillapító hatása egyaránt van. A peptid és receptor széles központi idegrendszeri eloszlása alapján feltételezheto, hogy számos idegi funkciót befolyásol. A többi opioid vegyülettel mutatott közös tulajdonság ellenére, a N/OFQ minden csak nem közönséges fájdalomcsillapító. Az elmúlt két 20

21 évtized során ismertük meg az agy saját kábítószereit, az endogén opiátokat és kannabinoidokat, amelyeknek meghatározó szerepe van a fájdalom csillapításában. Az exogén adott nociceptin gátolja, vagy fokozza az opioid analgéziát akár i.c.v. adjuk akár az agy olyan speciális régiójába, amelyrol ismert, hogy µ-opioid hatást közvetít. Tompítja az opioidok és nem-opioidok által kiváltott analgéziát, valamint az akupunktúra okozta érzéskiesést, interferál az a2- adrenerg agonista clonidin és GABA agonista baclofen okozta analgéziával. 3, 93, 94, 95 Mogil és munkatársai arról számoltak be, hogy N/OFQ fájdalomra adott válaszai önmagában nagyon különbözoek. Egyes szerzok szerint az i.c.v. adott nociceptin nem befolyásolja a fájdalomérzetet, más szerzok szerint hyperalgesiát vált ki. Yang és munkatársai analgéziáról számoltak be. 96 A különbségekre adott lehetséges magyarázatok egyike az, hogy az i.c.v. adott peptid a különbözo agyi régiókban másképpen hat és a cél struktúrájától függ a hatása. Ha az amygdalába injektáljuk a N/OFQ-t, akkor analgéziát 97, míg a középagy periaqueductalis állományába adva hyperalgesiát 98, a rostrális ventrális medullába adva két különbözo kutatócsoport sem tudott fájdalmat befolyásoló hatást kimutatni. 99, 100 Az i.c.v. adott nociceptin antagonizálja a morfin analgéziát, de önmagában nincs antiopioid hatása gerincveloi szinten. Egyes megfogalmazások szerint a nociceptin supraspinalisan antiopioid peptidként és spinalisan opioid peptidként viselkedik. 101 A fentiekbol is látható, hogy a nociceptinnek, a fájdalom kialakulásában, szabályozásában rendkívül összetett hatássa van. Egy új megközelítés szerint a prosztaglandin és a nociceptinerg rendszer kölcsönhatása lehet a magyarázat a nociceptinnek a fájdalom kialakulásával kapcsolatban megfigyelt ellentétes hatásaira. 36 A farmakológiai antagonisták kifejlesztése után, az eredmények az endogén peptid pronociceptív vagy antianalgesztikus hatásáról számoltak be. 102 A nociceptinnek és a NOP központi idegrendszerben való elhelyezkedésébol fakadóan fontos szerepet játszhat a fájdalomérzet kialakításában, és komplex hatást közvetíthet a gerincvelobol történo fájdalom továbbításában is. Elektrofiziológiai vizsgálatok igazolták, hogy a C-rostokból eredo ismétlodo elektromos impulzus a gerincvelo hátsószarvi neuronjainak eros izgalmát váltja ki, amely N-metil- D-aszpartát (NMDA) receptor antagonisták gátolnak. A gerincveloi hátsó szarvi neuronok izgalmi állapota szerepet játszik a neuropáthiás és a gyulladásos fájdalom kialakulásában és fenntartásában. 103 Patkányoknak i.t. különbözo dózisban adott 21

22 nociceptin dózis-függo mértékben gátolja az izgalmi tüneteket. A nociceptin által kiváltott gátló hatást csak igen nagy dózisú naloxonnal lehet antagonizálni. A nociceptin patkány hippocampusban is gátolja a hosszan tartó izgalmi tünetek kiváltását, amely NMDA receptor antagonistákkal is gátolható. 104 Decerebrált patkányok lumbális gerincbe adott nociceptin a mozgató neuronok supramaximális ingerlését követoen dózis-függo mértékben erosíti a flexor reflexet. 105 Az i.t. adott nagyobb dózisú nociceptin viszont koncentráció-függo mértékben csökkentette a flexor reflexet. Courteix és munkatársai patkányokban kísérletesen létrehozott neuropathia modelleken (diabetszes és traumás) vizsgálták a nociceptin hatását a hyperalgesiára és a morfin analgéziára. Az i.t. adott N/OFQ etiológiától függo antinocicepciót hozott létre, amelyet az opioid receptorok közvetítenek. A nociceptint morfinnal kombinálva az antinociceptív hatás felerosödött (szinergizmus), amelyet a szerzok ígéretes lehetoségnek tartanak a neuropathia kezelésében. 106 A nociceptin szerepe a nociceptív transzmisszióban a szélesköru vizsgálatok ellenére sem tisztázott, ugyanakkor a Society for Neuroscience 1998-ban izgalmas jövot jósolt a peptidnek. 107 b) A nociceptinerg rendszer és a kognitív funkciók: a tanulás és a memória A klasszikus opioidok, mint a béta-endorfin és a dynorphin szerepet játszanak a tanulási és memória folyamatokban. A NOP nagy mennyiségben kimutatható az anterior cingulumban, a frontális cortexben és a hippocampusban, amely alátámasztja, hogy a N/OFQ szerepet kap a kognitív funkciók szabályozásában. Knockout egerek tanulási képességét és a memóriáját vad típusú egerekével hasonlították össze labirintus teszten (a rövidtávú és a munkamemória használatát igényli). A nociceptin receptor hiánya a spontán viselkedésváltozásban nem mutatkozott meg. 108, 109, 110 A figyelem és a tanulási képesség növekedése nociceptinreceptor knockout egerekben feltételezhetoen, de nem kizárólag a dopaminerg funkciócsökkenés eredménye lehet. 108 A N/OFQ hatása a tartós potenciáció-ra (LTP) posztszinaptikus hatás, amely a gyrus dentatus granuláris sejtjeinek a gátlásával, valamint az NMDA receptor mediálta ionáramok gátlásával függ össze. 111 Mamiya és munkatársai a nociceptin hatását vizsgálta a tanulásra, valamint a hosszú távú memóriára. Igazolták, hogy a nociceptin negatívan befolyásolja a tanulási és 22

23 memóriafolyamatokat az NMDA receptor befolyásolásával, valamint a N-CAM (neuronal cell adhesion molecule) expressziójának fokozásával. 112 c) A nociceptierg rendszer és a motiváció (reward) Az opiátokhoz hasonlóan, az amphetamin, a kokain, és az alkohol pozitív megerosítést (reward) hoznak létre. A ventrális tegmentális nucleus accumbensének aktivitációja úgy jöhet létre, hogy növekszik a dopaminfelszabadulás az amphetamin, vagy csökken a dopamin visszavétele a kokain esetében, azaz minden esetben megno a dopamin koncentráció. Az i.c.v. nociceptin adását követoen altatott patkányokban a dopamin felszabadulás csökkenését lehetett megfigyelni a nucleus accumbensben. 113 Tartós agyi kanüllel rendelkezo egereken vizsgálták a nociceptin hatását az opiát vagy a pszichostimuláns kiváltotta feltételes reflexekre, vagy a naloxon-indukálta averzióra. Mind a morfin, mind a kokain indukálta eroteljes téraverziót a nociceptin csak enyhe mértékben gátolta. Gátolta a pozitív megerosítést mind narkózisban, mind pszichostimulánsok hatására. 114 d) A nociceptin és a táplálkozás Az i.c.v. adott N/OFQ fokozza a táplálékfelvételt jóllakott patkányokban. 115 Rövid ideig tartó, enyhe hyperphagia jelentkezett akkor, ha a nociceptint határozott agyi régiókba injektálták, mint a nucleus accumbens, a hypothalamikus ventromediális mag és a nucleus tractus solitarii. 116, 117 A nociceptin enyhe orexigén (étvágyfokozó) választ vált ki hasonlóan a klasszikus opioidokhoz. A rendelkezésre álló adatok alapján feltételezheto, hogy a nocieptin nem önmagában, hanem más neuropeptiderg rendszerrel együtt szabályozza a táplálékfelvételt. Felteheto, hogy a N/OFQ gátolja azokat a jelátviteli utakat, amelyek a táplálékfelvétel leállításában szerepet játszanak, mint a vasopressin, a-msh 118, és a CRH 119. e) A nociceptinerg rendszer szerepe a mozgásban Számos klinikai vizsgálat indult, annak felderítésére, hogy a nociceptin befolyásolja-e nigrostriatális (mozgásszabályozó) dopaminerg neuronokat, ezáltal a motoros viselkedést is. Marti és munkatársai leírták, hogy a substantia nigra pars reticulátájában jelenlévo NOP receptorok, amelyeket az endogén N/OFQ aktivál, fiziológiás gátló 23

24 funkciót tölt be a motoros viselkedésre patkányban. 120 Egereknek i.c.v. adott nociceptin mind a horizontális, mind a vertikális locomotor aktivitás csökkenését, ataxia létrejöttét, valamint az egyensúlyérzék elvesztését okozza. 121 Ugyanakkor az i.t. adott N/OFQ-t serkento hatású a locomotoros aktivitásra és a felderíto viselkedésre. Patkányoknak i.c.v. adott nociceptin tartós motoros gátlást, a koordinációs zavarokat, az egyensúly elvesztését és az izomtónus csökkenését okozza. A hatásokhoz 2-3 napon belül tolerancia alakul ki, és ez a hatás megmarad a kezelést követo 7. napig. 122 Ha a nociceptint közvetlenül a hippocampusba juttatjuk, nem hat a patkány motoros teljesítményére. 123 Ezekben az állatokban a nociceptin által kiváltott csökkent motoros aktivitás speciálisan supraspinális hatásnak tunik. Az eredmények ellenére a NOP receptor knockout egerekben nem hat a spontán és felderíto mozgásokban. 124 f) A nociceptin és az endokrin és neuroendokrin rendszer A nociceptin és a NOP hypothalamusban is kimutatható, így feltételezheto, hogy befolyásolja a hypophysis hormonok elválasztását. Az i.c.v. adott N/OFQ csökkenti a növekedési hormon szintet, de a prolaktin és a kortikotropin szintet nem befolyásolja patkányban. A nagy dózisú N/OFQ antagonizálja a növekedési hormon hatásait, növeli a prolaktin és a kortikotropin szintet a stresszhatásnak kitett állatokban. 125 A hypothalamuson keresztül stimulálja a TRH és TSH felszabadulást. 126 Részlegesen antagonizálja a stressz hatására létrejövo növekedési hormonszint csökkenést és fokozza a prolaktin és kortikotropin szintnövekedést. Ezek a hatások valószínuleg, nem kizárólagosan a NOP receptoron keresztül valósulnak meg. Igazolták, hogy a N/OFQ stresszellenes hatású, valamint kifejezett hyperphagiát vált ki éhezo patkányokban. A CRF-rol ismert, hogy a stressz fo mediátora, valamint hogy az anorexia kiváltásában szerepe van. Ciccocioppo és munkatársai bizonyították, hogy a nociceptin NOP rendszer farmakológiai célpontja lehet a CRF által kiváltott antianorexiás hatásnak. 127 Az i.c.v. adott nociceptin aktiválta a stressz tengelyt (limbikus rendszer- hypothalamushypophysis-mellékvesekéreg tengely), akkor is, ha nincs stresszt kiváltó faktor. Számos metabolikus folyamat szabályozásában és a stressz befolyásolásában is részt vesz. 128 A nociceptin emeli a stressz-kapcsolt magatartási mintázatok számát, valamint a kortikoszteron szintet világos-sötét félelem teszt során patkányokban

25 Lippl és munkatársai izolált patkány gyomron vizsgálták a bazális szomatosztatin szekréció változását. Alacsonyabb dózisban a gátlás a NOP receptoron, míg nagyobb dózisban csak részben opioid receptoron keresztül valósul meg a gátlás. 173 g) A nociceptin és az alkoholabúzus I.c.v. adott N/OFQ csökkenti az önkéntes 10%-os etanol bevitelét a Marchigian Sardinian alkohol-kedvelo patkányokban. A kísérlet a receptor farmakológiai jellemzését tuzte ki célul. A receptor hatás közvetítésében a C-terminális 13 aminosavból álló rész vesz részt, amely meghatározza az aktivitást. A szelektív NOP receptor antagonista (Nphe 1 )N/OFQ(1-13)NH 2 gátolja az N/OFQ hatását az etanol bevitelre. A N/OFQ gátolja az elektromos hatásra létrejövo stressz után a visszatérést az alkohol-kereso magatartáshoz. A nociceptin és receptora szerepet játszhat az alkoholabúzus farmakológiai kezelésében. 130 Aktivációja tompítja az alkohol pozitív megerosíto hatását, és megelozi környezeti faktorok (szag, fény, zaj) által kiváltott alkohol kereso magatartás visszatérését A NOCICEPTIN PERIFÉRIÁS HATÁSAI A NOP receptort számos központi idegrendszeren kívüli területen kimutatták patkányban, úgymint belek, vas deferens, máj, lép és szív, valamint humán lymphocytákon. A nociceptinnek számos biológiai hatását bizonyították perifériás preparátumokon. 132 A perifériás hatások elsosorban a transzmitterfelszabadulást befolyásolják hasonlóak a többi opioid perifériás idegrendszerre kifejtett neuromodulátoros hatásaihoz. a) A nociceptin és a légzorendszer Tengerimalac légcsövén igazolták, hogy a nociceptin a légutak falában lévo immunreaktív idegrostokon hat, amelyek különböznek a tachykinin tartalmú rostoktól. 133 Részt vesz a légutak fiziológiai szabályozásában a tachykininerg neurotranszmisszió befolyásolásával. 134 A tachykinin tartalmú érzo rostokon a nociceptin indukálta hyperpolarizáció a befelé-egyenáramú K + csatornákon keresztül gátolja a kapszaicin 135 és a fenoterol által érzékenyített bronchokonstrikciót 136. Az elektromos stimulusra 137, 138 kiváltott non-adrenenerg non-cholinerg (NANC) bronchuskonstrikciót gátolja. 25

26 Összefoglaló közlemények jelentek meg arról, hogy a N/OFQ és receptora a többi endogén opioiddal együtt szerepet kaphat az asthma kezelésében 139 és a köhögéscsillapításban 140, 141, 142 Az intrathoracikus légutak mechanikus stimulációjával kiváltott köhögések száma és mélysége is csökkent az intravénás nociceptin adására macskában. 143 A gastrooesophagalis reflux betegség köhögést, bronchuskonstrikciót és gyulladást vált ki a betegek többségében, amely a tachykinin felszabadulás következménye. Rouget és munkatársai azt vizsgálták, hogy az intraoesophagealisan adott HCl, hogyan befolyásolja a légutak plazma extravasatioját. A N/OFQ saját receptorán keresztül csökkenti a plazma extravasatiot a tachykinin felszabadulás közvetett gátlásával. Ugyanakor az substance P okozta extraváziót nem befolyásolja. 144 b) A nociceptin és a cardiovascularis rendszer Intenzív cardiovascularis kutatások folynak, amióta a NOP receptorról kimutatták, hogy azokon a pre-, és/vagy postganglionáris szimpatikus és paraszimpatikus neuronokon is jelen vannak, amelyek az ereket, a szívet, valamint azokat a szerveket is beidegzik. Ugyanezek a receptorok a gyulladás, az arteriális hypertenzió és a kardiális és cerebrális ischemia kialakulásában is közremuködnek. 145 A nociceptin nm-os koncentrációban jelentos vazorelaxáns hatással van az elozetesen phenilephrinel kezelt macskavese, mezenteriális, szív és combcsont érintetlen endotheliumú artériáin. Patkányon végzett vizsgálatok szerint a nociceptin szintén vazorelaxáns hatású az artériákon. 146 Giuliani és munkatásai a nociceptin hatására artériás vazokonstrikciót és bradikardiát hoztak létre. 147 Egyes kutatók szerint a N/OFQ hipotenziót, bradikardiát okoz a NOP receptor hatásnak 148,149, míg mások i.c.v. adott N/OFQ hypotenzív, bradikardizáló, a vesében szimpatoinhibitoros és diuretikus hatását nem centrális a2-adrenerg vagy centrális opioiderg receptor hatásnak tartották. 150 Venkatesan és kutatócsoportja szerint a nociceptin által okozott gátlás a GABAerg neuronokon keresztül valósul meg és növeli a paraszimpatikus hatást, amely szerepet játszhat a bradikardia kiváltásában. 151 Az N- típusú Ca-csatornák blokkolása után a nociceptin gátolta a neurotranszmitter felszabadulást a szimpatikus neuronokból, amely szerepet játszhat a cardiovascularis rendszer depressziójában. 152 A nociceptin hatását vizsgálták oubain által kiváltott noradrenalin és acetilkolin felszabadulásra és igazolták, hogy a N/OFQ gátolja a 26

27 cardiális autonóm neurotranszmissziót a preszinaptikus NOP receptoron keresztül. 153 Shah és munkatársai patkány nuclues tractus solitariusba adott nociceptinnel igazolták, hogy a commisurális subnucleus NOP részt vesz a kardiovaszkuláris rendszer szabályozásában. 154 A nociceptin növelte az antinatriuretikus peptid szintjét neonatális kardiális myocytákon. 155 Arrythmiában mind a perifériás, mind a centrális NOP receptor stimulációja növeli a kardiális ellenállást az acotinine által kiváltott szívritmuszavar ellen. 156 c) A nociceptin és a cerebrovasculáris rendszer Régóta ismert, hogy a klasszikus endogén opiodok (enkephalin, dynorphin) az agyi erek hemodinamikájának szabályozásában szerepet játszanak. 157 Armstead és munkatársai igazolták eloször, hogy a hypoxiás-ischemiás károsodást követoen a N/OFQ részt vesz a piális artériák NMDA indukálta vasodilatációjában. Feltételezték, hogy a nociceptin indukálta PKC-függo O 2- keletkezése a nociceptin felszabadulás függvénye. 158 ischemia/reperfúzió okozta károsodást követon nem csak az adenilát cikláz és a K(ATP) csatorna-függo, hanem a camp és a K(Ca)-csatorna-függo mechanizmusok is szerepet kapnak a nociceptin okozta vasodilatációban. 159 Az Szerepet játszik a hypoxaemiásischémiás károsodás létrejöttében, a szuperoxid anion koncentrációjának emelésével, amely a károsodott piális artériák NMDA-függo vasodilatációja után szabadul fel. 160 Ugyanez a kutatócsoport igazolta, hogy a megváltozott ciklooxigenáz metabolizmus részt vesz a károsodott vazodilatáció létrejöttében cerebrális sérülést követoen patkányban 161, 162, valamint, hogy a protein-kináz K és a mitogén-aktiválta proteinkináz K szintén szerepet kap az N/OFQ-indukálta hypercapnia létrejöttében, amit a 163, 164, 165 piális artériák vazodilatációja hoz létre. d) A nociceptin és gasztrointesztinális rendszer A nagy dózisú nociceptin gátolja a gyomor és vékonybél passage-t in vivo. 166 Késobb kimutatták, hogy ez a gátlás régióspecifikus. A N/OFQ gátolja a kolinerg neurotranszmissziót a gyomorban és a vékonybélben, míg a stimulálja a colon kontrakciót, gátolva a plexus myentericust. 167, 168 Kimutatták a NOP-t sertés bélrendszerén, valamint igazolták, hogy a receptor befolyásolja az intesztinális 27

28 simaizom kontrakciót és a mukozális transzportot. 169 A szubkután adott kisebb dózisú nociceptin fokozza a colon motilitását, míg a dynorphin A nagyobb dózisban ( nmol/kg) gátolja. 170 Gyomor motoros izgalmát váltja ki, feltételezhetoen nem a paraszimpatikus, vagy szimpatikus idegeken keresztül, hanem a gyomor saját beidegzése által 171, a motilitás neuromodulátoros befolyásolása mellett, az intesztinális véráramlás fokozásában, az aktív ion transzportban és az immunitás szabályozásában is szerepet játszik 172. Gátolja a szomatosztatin szekréciót a gyomorban. Alacsonyabb koncentrációban a saját receptorán, míg magasabb koncentrációban opiát receptoron keresztül hat. 173 Centrális úton is befolyásolja a gasztrointesztinális propulzív aktivitást és a gyomorsav szekréciót patkányban. 174 e) A nociceptin és az urogenitális rendszer A NOP receptort kimutatták az egér 2, a patkány 175,és a nyúl 176 és humán 177 vas deferensen. A N/OFQ valamennyi felsorolt fajban gátolta a vas deferens kontrakcióját. A nociceptin i.v. és i.c.v., adását követoen jelentosen növeli a vese perctérfogatát, de csökkenti a Na + -kiválasztást. Altatott patkányokban gátolja az EFS (elektromos stimuláció) által kiváltott hólyagkontrakciót, a medence területét szabályozó idegek preés posztszinaptikus gátlása révén. Ez a hatás a gátolt excitátoros transzmitter felszabadulásnak tulajdonítható, a hólyag postganglionáris kolinerg motoros idegekben. 178 Tengerimalacból izolált vesemedence preparátumon az EFS pozitív inotrop hatást fejt ki a perifériás kapszaicin szenzitív primer afferens neuronok idegvégzodéseibol felszabaduló tachykinin befolyásolásán keresztül. 179 Az opioidokhoz hasonlóan a nociceptin is koncentráció-függo mértékben gátolja az érzoidegek transzmisszióját az urogenitális rendszerben az excitátoros transzmittereken keresztül (tachykinin) hat, a húgyhólyagnál tapasztaltakhoz hasonlóan. 180 Hadrup és munkatársai a NOP receptor aquaresire (sómentes vizelet kiválasztás növekedés) kifejtett hatását vizsgálták. Eredményeik igazolták, hogy a vese gyujtocsatornáiban elhelyezkedo NOP receptorok stimulációja az egészséges és a kongesztív szívelégtelenségben szenvedo állatokban az aquaresis növekedését váltja ki, amelyet a vasopressin független aquaporin-2 downregulációja okoz