Az immunanalitikában felmerülő in vivo és in vitro interakciók az endokrin és a sürgősségi labordiagnosztikában. Toldy Erzsébet

Átírás

1 Az immunanalitikában felmerülő in vivo és in vitro interakciók az endokrin és a sürgősségi labordiagnosztikában Toldy Erzsébet Pécsi Tudomány Egyetem, ETK, Diagnosztikai Intézet Gyakorlati Diagnosztikai tanszéki Csoport és Vas megyei Markusovszky Kórház, Központi Laboratórium, Szombathely Synalab Hungary Kft. Országos laboratóriumi medicina szakmaterületi továbbképzés. Főszervező: Prof. Dr. Fekete Mátyás május 12. Budapest

2 Az immunanalitikai módszerek használatának gyakorisága napjainkban Paraméterek Endokrin, tumormarker, autoimmun Sürgősségi Gyógyszerszint, haematologia Egyéb 95 % 62% 38% Immuno-assay

3 Immunanalitikai vizsgálatok a sürgősségi laboratóriumi vizsgálatok terén Vesefunkció: cystatin C Cardiologiai markerek: CK-MB-mass, Troponin I és T, pro-bnp Akut fázisproteinek: CRP, Procalcitonin Haemostasis: D-dimer Gyógyszerszint monitorozások: Digoxin, MTX, Extrauterin, v. ectopiás terhesség: hcg Életet veszélyeztető endocrin diszfunkció: ft4, Cortisol Intraoperativ monitorozás: PTHi, Insulin, ACTH

4 Sürgősségi diagnosztika: ACS ACS ST-eleváció NINCS VAN ctn mérés Negatív Pozitív Instabil angina NSTEMI STEMI

5 A diagnosztikus folyamat: az összes idő legnagyobb hányadát a preanalitikai fázis teszi ki Postanalitikai fázis: Leletközlés, referencia tartománnyal Lelet interpretáció Analitikai fázis 25% 14% 61% 75% 37% Preanalitikai fázis a laboratóriumon kívül: beteg állapota, előkészítése mintavételi körülmények a biológiai minta adottsága minta szállítás 24 % Preanalitikai fázis a laboratóriumban: centrifugálás, tárolás minta-előkészítés Guder W.G. és mtsai: Samples: From the Patient to the Laboratory 2003.

6 Módszer szenzitivitás Anyagmennyiségek a vérben Immunanalitikai módszerrel mért paraméterek koncentráció viszonyai a plazmában ECLIA MEIA IRMA RIA Mikroanalitika 95% sürgősségi markerek: ng Gasztrin Szabad T3 Szabad progeszteron Szabad T4 TSH Szabad tesztoszteron Progeszteron T3 Tesztoszteron Vitamin D T4 Glükóz 1 ml vérben oldott molekulák számának a logaritmusa

7 Immuno-assay: több mint 50 éve Hormon Hevesy Gy R. Yalow S. & S.A. Berson 1960 H. Koehler & A. Mielstein 1975 Nobel-díjasok

8 Ambient assay - R. Ekins Az eredmény függ a szérum-mátrixtól Fehérjefrakciók mennyisége és aránya = Hormon ph Ionerősség - döntő fontosságú a komplexek kialakulásához Globulin Albumin

9 Beteg Kontroll Beteg Kontroll Gamma globulin frakció: 1, 6 % Mindhárom Ig osztály méréshatár alatt

10 Immuno-assay-vel mért paraméterek szintjének változásai az IgG és az albumin adását követően SZÁZALÉKOS ELTÉRÉS IgG IgG+Albumin IgG IgG + Albumin -50 PTH hcg hgh IGF1 PRL

11 Az interferencia független az analitikai módszertől ECLIA MEIA TSH ft4 ft3 IgG adása után -60% -40% -20% 0 20% 40% 60% ft3 TSH ft4 ft3 ECLIA MEIA IgG+Albumin 40 adása 60 után

12 in vitro protein manipuláció Equilibrium Dializis után mért X= Rutin szabad thyroxin assay A rutin ft4 módszereket úgy fejlesztették ki, hogy legyőzzék a gyakoribb fehérjefrakció rendellenességeket, cserében viszont az albumin-szint függők. Ezzel a módszer szenzitivitásának is ártanak. Chapter 6a THYROID FUNCTION TESTS: Assay of Thyroid Hormones -Carole Spencer,University of Southern California Technical Director, Updated 1 January 2010

13 Abnormális hormoneredmények, klinikai konzekvenciával járnak! Emelkedett hormonszint: hcg szükségtelen műtét, kemoterápia Calcitonin finomtű biopszia Prolactin MR, felesleges bromocriptin kezelés Kortisol CT, (topical szteroid) Testosteron felesleges további vizsgálatok ft4 felesleges thyreostaticus kezelés Alacsony szintek: hcg Insulin choriocarcinoma félrekezelése insulinoma félrediagnosztizálása Alison MJ et al: Unusual results and the role of the the clinical endocrinologist. Clin Endocrinol 2006:

14 Preanalitikai körülmények In vivo: - általános élettani állapot - vérvételi körülmények - mintában lévő nem kívánatos szubsztanciák In vitro: - vérvételi cső, szállítás - centrifugálás - minta azonosítás - tárolás

15 Preanalitika: a beteg előkészítése és állapota Mintavétel időpontja Testhelyzet, mozgás Alimentaris állapot Stress Terhesség Súlyos betegség

16 A hormonok fluktuációja Krono-biológiai változások Változás az életkorral : GH, IGF1, E2, Testosteron, DHEAS FSH Ciklikus: Biológiai pl. menstruációs ciklus Napi, éjszakai: ACTH, Cortisol, PRL, Aldosteron, Testosteron Szezonális pl. D-vitamin Egyéb történés: testhelyzet, evés ACTH napi ritmus: reggel magas (idős emberben ~3 órával korábban), este alacsony. Vak egyénekben nincs napi ritmus.

17 Élettani állapotok: pszichés vagy fizikális stress ACTH, Cortisol, katecholaminok, TSH, PRL, hgh, AVP, Oxytocin., Aldosteron, PRA, ANP Stress hatás időtartama, súlyossága Kisebb Nagyobb pl. betegség műtét Infekció TNF-α IL-1,6 májban : 5 MD aktivitás, T3, Akut fázisreakciók Vermes és mtsai, 2001 Csökken: A T4, TSH hormonkötő-proteinek

18 Neuroendokrin válasz súlyos betegségben Hypophysis -adrenális tengely aktiváció Hypophysis -genitális és pajzsmirigy Eltolja a szokásos referencia tartományokat További komplikációk: -változás a táplálkozásban -gyógyszerhatások tengely inhibició

19 Gyógyszerhatások In vivo Béta blokkolók: PRA ACE-, AR- blokkolók: PRA Ca-csatorna blokkolók: ALD PRL Spironolacton: ALD Antikoncipiensek: BP, PRL Amiodaron ft4 ft3 Adrenerg szerek: TSH Neuroleptikumok, antidepresszánsok: PRL In vitro Steroid assayk-ben számtalan metabolit és gyógyszer zavarhat Heparin, phenytoin, carbamazepin, salicylat,-ft4,ft3 Biotin Fluoroforok Exogén T4 mérése szubsztituált betegekben Insulinnal, v. GH-val kezelt beteg

20 A biológiai minta rendkívüli adottsága, amely rejtett hibaként jelentkezhet az analitika során 1.) Rendkívül magas, vagy alacsony transzport proteinek, vagy rendhagyó (paraproteinek) proteinek. 2.) A mérni kívánt biomolekula rendkívül magas koncentrációja 3.) A módszert zavaró endogén immunglobulinok jelenléte. 4.) Az antitest-antigén komplex kialakulását zavaró pharmakonok jelenléte.

21 Transzport proteinek 1.) Peptideket szállítók: CRH-BP (placenta, 38 KD, CRH-t inaktiválja), IGFBP- 1-6, Albumin (Calcitonin, PTH, ACTH) 2.) Szteroid hormonokat szállítók: CBG, SHBG, D-vitamin -BG 3.) Pajzsmirigy hormonokat szállítók: TBG, Albumin, Transthyretin (prealbumin)

22 A módszerek mérési tartománya véges Kontroll Acromegalia aktív Acromegal remis. GH-hiány Az assay mérési tartománya PAOLO MARZULLO P et al.: Usefulness of Different Biochemical Markers of the Insulin-Like Growth Factor (IGF) Family in Diagnosing Growth Hormone Excess and Deficiency in Adults, J. Clin Endocrin & Metab, 2001; 86:

23 Rendkívül magas hormonszint: "High Dose Hook" jelenség Captures antitest 1. Jelölt antitest Jel nagysága Antigén Szilárd fázis Tévesen leolvasott alacsony koncentráció Valós magas koncentráció

24 Interferenciáért felelős endogén antitestek I. Specifikus antitestek az analit ellen II. Heterophyl antitestek III. Reuma faktor IV. Human anti-animal-antitestek V. Human-antihuman-antitestek (HAHA)?

25 Immunglobulinok okozta keresztreakciók feltételei 1.) Az analitre nézve antigénkötőmolekularésszel rendelkező specifikusantitestek jelenléte a szérumban. 2.) A zavaró specifikus antitest koncentráció viszonya a módszer méréstartományát elérő, vagy azt meghaladó legyen. 3.) Aspecifikus immunglobulinok kóros mennyiségi arányai.

26 I. Specifikus autoantitestek Izotípusuk: főként IgG, de leírtak már IgM, IgA-izoformát is Gyakoriságuk- eltérő: Prolactin: S S S S S S S S S S I I I g g g G G G normál populáció: 2%, hyperprolactinaemia: 21-46% Tg: DTC-ben 26%, T4, T3: normál 0,3-1,8%, betegekben: 5-25%, TSH: 0.02% Leírtak már: ctn-i és T, Procalcitonin, CRP esetében is, főként álnegatív eseteket antitest interferencia miatt. I g GH 2 O H 2 O S

27 II. Heterophyl antitestek prevalencia: 0,5-12% III. Reuma faktor Előfordulásuk: a normál populációban (idősebb kor): 5-10%, autoimmun betegekben gyakrabban. RA kezdeti stádium első év: 40-60%, később: 80% - Úgy viselkednek, mint a heterophyl antitestek: minden faj immunglobulinjához hozzákötődnek. IV. Human anti-animal-antitestek (HAMA) Szérum koncentrációi: µg/l-g/l is lehet, évekig perzisztálhatnak a keringésben Előfordulásuk: 1-80% is lehet.

28 A human anti-animal antitestek ellen keletkező további antitestek Állati antitest Human anti-izotípiás antibody Human anti-idiotípiás antitest Human anti-anti idiotípiás antitest Kricka: Clin. Chem

29 Az állati antitestek ellen keletkező IgG interakciók Tévesen magas Tévesen alacsony ) ) Y Y Y * Y YY *Y Szilárd fázishoz kötött specifikus Ab Anti idiotípiás Ab *Jelet adó Ab Anti-anti idiotípiás Ab vagy Anti izotípiás Ab

30 MIT TEHET A LABORATÓRIUM? Plauzibilítási kontroll Visszatekintő biokémiai kontroll (delta check) Blokkoló ágenseket használó assay-k beszerzése Analitikai megközelítések

31 Kell-e szűrni antitest interferenciákra a laboratóriumban? IGEN, ha a populáció jelentős %-át érinti és az eredmény a döntéshozatalban meghatározó. pl. bbprl, Tg Az anamnesis megköveteli Laboratóriumé a felelősség!

32 Az antitest interakciók kiküszöbölése: LEHETETLEN, DE...együtt kell élni vele a következőképpen: Több módszert kell elérhetővé tenni Team munkában: - tudatosítani kell a klinikusokban az immunanalitikai módszerek korlátait, - klinikai összefüggéseket ismertté kell tenni a labor felé.

33 IN VITRO- PREANALITIKA Biológiai minta és cső Teljes vér: - intracelluláris enzimek szabaddáválása, haemolízis (catalase, protease, hydrolase). Antiproteolitikus ágens: Trasylol (aprotinin) Szérum: a legtöbb hormonhoz, illetve antitesthez alkalmas pár kivétellel. Plazma: PRA, Renin, ACTH,Catecholaminok csak EDTA-val (kofaktort köt meg)! Li-heparin nem jó, mert Ab-Ag komplex kialakulását gátolja. Vérvételi cső: - Géles szeparáló csövek használata kerülendő. Interakció a legtöbb assay-vel: az SST-gél abszorbeálja úgy a makro-, mind a kis- (pl. szteroidok) molekulákat. - Üveg, illetve műanyagcsövek (pl. ACTH-t adszorbeáló üvegcső)

34 ctnt szintek torzítása 20% 0% -20% -40% -60% -80% p<0,01 0,035 ng/ml 0,054 ng/ml 0,172 ng/ml 0,178 ng/ml Hgb g/l ctni szintek torzítása 5% 0% -5% -10% -15% 0,42ng/ml 0,54 ng/ml 0,94 ng/ml 1,59 ng/ml Hgb g/l

35 25(OH)-D3-vitamin-preanalitika: fényfüggés Tárolás: alufóliában v. anélkül, szobahőmérsékleten, lesavózva ill. szétválasztás nélkül Az alapértékhez képest négy óra elteltével nem tapasztaltak szignifikáns eltérést, 24 óra múlva azonban mind a lesavózott, mind a szétválasztás nélküli minták esetén szignifikánsan (p<0,001) alacsonyabb értéket mértek de csak a fénynek kitett mintákban. Fénynek kitéve Fénytől védve 25-OH-D 3 (ng/ml) p < 0,001 p < 0,001 NS 0 perc 4 óra 24 óra 24 óra, lesavózva Bekő Gabriella és mtsai, SE, Központi Labor, Poszter: MLDT Pécs, OH-D 3 (ng/ml) NS 0 perc 4 óra 24 óra 24 óra, lesavózva

36 A minták tárolása PTHi rövid távú eltartása plazmában és szérumban Szérum (N=11) Plazma (N=11) C Óra C PTHi szint változások %-ban

37 Módszerfüggő változás az ACTH szintekben a fagyasztásos tárolás során ACTH szint (pg/ml) N.S. ECLMA CLMA p<0,05 Friss minta 2. hét CLMA p < 0,001 ECLMA immunreaktivitás változás %

38 A tárolási idő hatása (-20 fokon): szignifikáns különbség a PRA esetében N=36 PRA RENIN -32* 7.hét -15,2* 5.hét -9,4* 2.hét koncentráció változás %

39 Aldoszteron/PRA vagy Aldoszteron/Renin hányados: pontosan definiált preanalitika mellett is módszerfüggő Guideline Guideline Saját kontroll (N=36) hányadosok ALD/PRA ALD/Renin Clinical practice guidelines, Endocrine Society Funder et al: JCEM

40 Az abszolút referencia tartományt torzító komponensek Egyeden belüli = Egyeden belüli = Egyedek között = Analitikai = + preanalitikai, CV pre Az egészségesnek feltételezett populáció 95%-ára érvényes -2,5% -2,5%

41 A modern orvosi együttműködésben két veszedelmes résztvevő van, az egyik az a klinikai kémikus, aki keveset tud az orvoslásról, a másik az a gyógyító orvos, aki a laboratóriumi eredmények értékeléséről tud keveset. (The American Journal of Digestive Diseases.) Az értéket teremtő szinergia kulcsa a klinikai és laboratóriumi és a vért vevő szakemberek kiváló együttműködésében rejlik.

42 Köszönöm a megtisztelő figyelmet!