Opioid peptidanalógok szintézise szerkezet-hatás összefüggések vizsgálatára

Átírás

1 Tudományos Diákköri Dolgozat BABS FRUZSIA pioid peptidanalógok szintézise szerkezet-hatás összefüggések vizsgálatára Dr. Magyar Anna Szerves Kémiai Tanszék ELTE-MTA Peptidkémiai Kutatócsoport Dr. Benyhe Sándor MTA SzBK Biokémiai Intézet Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2008

2 Köszönetnyílvánítás Köszönetet mondok Dr. Perczel András tanszékvezető egyetemi tanárnak, aki lehetővé tette, hogy az ELTE Szerves Kémiai Tanszéken dolgozhassak. Köszönettel tartozom Dr. Hudecz Ferenc rektor úrnak, az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport vezetőjének, hogy lehetővé tette, hogy a kutatócsoportban dolgozhassak. agyon köszönöm Dr. Magyar Anna tudományos főmunkatársnak és Dr. Benyhe Sándornak, témavezetőimnek, hogy segítségemre voltak a téma kidolgozásában, és a TDK dolgozat elkészítésében. Köszönet Varga Renátának a tömegspektrometriás mérések elvégzéséért, Horváti Katának a szintetizátoron végzett munkában, és Gali Irénnek a HPLC és FPLC kezelésében nyújtott segítségéért. Köszönet Engin Bojniknak a biológiai vizsgálatok elvégzéséért. Köszönöm Dr. Medzihradszky Schweiger Hedvig tudományos főmunkatárs és Dr. Bősze Szilvia tudományos főmunkatárs segítségét az analitikai feladatok megoldásában. 2

3 Tartalomjegyzék Köszönetnyílvánítás...2 Tartalomjegyzék... 3 Rövidítésjegyzék Irodalmi áttekintés Bevezetés pioid receptorok pioid peptidek Tyr-Gly-Gly-Phe peptidek Békabőr peptidek Tyr-Pro peptidek pioid peptidalkoholok Alkalmazott módszerek Szilárd fázisú peptidszintézis (SPPS) Stratégiák ldallánc védőcsoportok A szilárd hordozó Kapcsolási eljárások A kapcsolás végbemenetelének ellenőrzése inhidrin (Kaiser) teszt A tisztítás során alkalmazott módszerek Folyadékkromatográfia Vékonyréteg-kromatográfia Farmakológiai módszerek G-protein aktivációs teszt Kompetitív kötődési kísérletek A szintetikus munka alapját képező elméleti háttér ociceptin neuropeptidek és analógjaik Elongált enkefalin analógok Célkitűzések Tervezett stratégia A peptidalkohol előállítása Fmoc-Arg(Pbf)-ol előállítása Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Ile-Arg-ol előállítása Az enkefalin-származékok előállítása Kísérleti rész Általános megjegyzések Az előhívásnál alkalmazott módszerek Gyantakapacitás meghatározása Tisztaság ellenőrzése Preparatív tisztítás Tömegspektrometriás mérés Fmoc-Arg(Pbf)-ol előállítása Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Ile-Arg-ol előállítása Enkefalin-származékok előállítása Eredmények A szintézisek eredményei A biológiai mérések eredményei ociceptin neuropeptidek és analógjaik Elongált enkefalin analógok Összefoglalás Irodalomjegyzék Függelék 3

4 Rövidítésjegyzék Az aminosavak egy ill. hárombetüs röviditéseit a Journal of Peptide Science, 5: (1999) (A Short Guide to Abbreviations and Their Use in Peptide Science) ajánlása szerint használtam. 2,6-Cl 2 Bzl 2,6-diklór-benzil csoport 2-BrZ 2-bróm-benzil-oxi-karbonil csoport 2-ClZ 2-klór- benzil-oxi-karbonil csoport Boc tercier-butil-oxi-karbonil Bom benzil-oxi-metil csoport BP benztriazol-1-il-oxi-trisz(dimetil-amino)-foszfónium-hexafluoro-foszfát t Bu tercier-butil csoport Bum tercier-butil-oxi-metil csoport Bzl benzil csoport chex ciklohexil csoport DBU 11,8-diazabiciklo[5.4.1]undek-7-én DCC diciklohexil-karbodiimid DIC diizopropil-karbodiimid DIEA diizopropil-etil-amin DMF,-dimetil-formamid EDT etán-ditiol Fmoc 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil FPLC középnyomású folyadékkromatográfia HBTU 2-(1H-benztriazol-1-il)1,1,3,3-tetrametil-urónium-hexafluror-foszfát HF hidrogén-fluorid HAt 1-hidroxi-7-aza-benzotriazol HBt 1-hidroxi-benztriazol HPLC nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia MBHA 4-metil-benzhidril-amin MS Mass Spektrometry, tömegspektrometria MM -metil-morfolin MP -metil-pirrolidon P ormal Phase, normál fázis PyBP benzotriazol-1-il-oxi-trisz-pirrolidono-foszfónium-hexafluoro-foszfát RP Reverese Phase, fordított fázis SPPS Solid Phase Peptise Synthesis, szilárd fázisú peptidszintézis TBTU benzotriazol-1-il-1,1,3,3-tetrametil-urónium-tetrafluoro-borát TFA trifluor-ecetsav TIS triizopropil-szilán Tos 4-toluol-szulfonil,4-metilbenzol-szulfonil csoport Trt tritil csoport VRK vékonyréteg-kromatográfia Z benzil-oxi-karbonil csoport 4

5 1. Irodalmi áttekintés 1.1. Bevezetés Már az ókori görögök is ismerték a mákgubóból kinyerhető ópiumot, és használták annak fájdalomcsillapító, kábító, valamint hasmenésre és vérhasra gyakorolt jótékony hatása miatt. Az ópium egyik legfontosabb hatóanyaga egy fenantrénvázas alkaloid, a morfin (1. ábra). 1. ábra: Morfin és származéka A morfint először 1803-ban Sertümer, német gyógyszerész tisztította ópiumból. A tudomány fejlődése során az 50-es években számos nagyhatékonyságú morfinszármazékot állítottak elő szintetikus úton. További hatáselemzések során a 70-es években megállapították, hogy a morfin és analógjai fájdalomcsillapító hatásukat specifikus receptorokhoz kötődve fejtik ki. E morfint kötő opiát receptorok vizsgálata során kiderült, hogy nemcsak a morfin és származékai ligandumai ezen receptoroknak [1, 2], hanem a szervezetben előforduló fehérjék és peptidek is, például a metionin-enkefalin (H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-H) és leucinenkefalin (H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-H) [3, 4], valamint az endomorfin-1. (H-Tyr-Pro-Trp- Phe-H 2 ) és endomorfin-2. (H-Tyr-Pro-Phe-Phe-H 2 ). Emiatt az opiát receptor kifejezés helyett ma inkább az opioid receptor elnevezés használatos. 5

6 1.2. pioid receptorok Az 1970-es években az opioid receptorokat ligandkötő képességük alapján három fő csoportba sorolták, ezek a μ (MP), a κ (KP)és a δ (DP) receptorok [5]. A három receptor típus farmakológiájában, eloszlásában, és a hozzájuk kötődő opioid peptidek affinitásában és szelektivitásában különbözik egymástól. Közös tulajdonságuk, hogy egy morfinszármazékkal, a naloxonnal (1. ábra) a ligandum opioid receptorhoz való kötődése megszüntethető (antagonizálható). Az opioid receptorok a G-proteinhez kapcsolt receptorok nagycsaládjához tartoznak. A receptorfehérje szerkezete 7 transzmembrán hélixből épül fel, a hélixek között három extra- és három intracelluláris hurok található, az -terminális domént extracellulárisan, a C-terminális domént pedig intracellulárisan tartalmazza (2. ábra). 2. ábra: A G-protein kapcsolt transzmembrán-fehérjék általános szerkezete A legnagyobb homológiát a transzmembrán hélixek és az intracelluláris hurkok mutatják, a legnagyobb különbségek pedig az extracelluláris hurkok, valamint az - és a C-terminálison lévő domének szerkezetében figyelhetőek meg (3. ábra). A receptorok hatása elsősorban a G-fehérjéken keresztül érvényesül: befolyásolják az ATP-szenzitív K + -csatornák és a feszültségfüggő Ca 2+ -csatornák működését, valamint a gátló hatású G i jelátvivő fehérjéken keresztül csökkentik az adenilát-cikláz aktivitását [6]. A K + - csatornák nyitása hiperpolarizációt okoz az idegsejtben, ami lecsökkenti annak neurotranszmitterekkel szembeni érzékenységét. pioid hatásra G-fehérjéken keresztül gátlódik a Ca 2+ felszaporodása a sejtben, a Ca 2+ -szint pedig befolyásolja a neurotranszmitterek felszabadulását és a protein-kináz enzimek működését is. Az opioid receptorok az idegrendszer sejtjeinek felszínén fordulnak elő elsősorban. 6

7 3. ábra: A μ-, σ- és κ-receptorok. A fekete pontok mindhárom, a szürke pontok két receptorban előforduló közös aminosavat jelzik [7] A különbözü típusú opioid receptorok más-más biológiai hatással jellemezhetőek. A μ receptor a fájdalomérzet csökkentésében és a meleg hatására kialakuló fájdalom érzékelésében játszik szerepet. Ingerlése csökkenti a légzés ütemét és mélységét, gyengíti az immunrendszert és fizikai függőséget (kábítószer függőséget) okoz. A δ receptor ugyancsak szerepet játszik a hő hatására kialakuló fájdalomban, ugyanakkor kisebb mértékben hat a légzésre és a kialakuló függőség is alacsonyabb szintű. A κ receptor a kémiai hatásra kialakuló fájdalmat szabályozza, ingerlésével erős nyugtató hatás érhető el. ociceptin receptor Az opioid receptorok tanulmányozása, klónozása vezetett el a P receptor felfedezéséhez, mely receptor ugyancsak a G-fehérje kapcsolt receptorok szupercsaládjába tartozik és 60% feletti homológiát mutat a többi opioid receptorral [8]. A P receptor felfedezése után egy évvel felfedezték a P receptor endogén agonistáját, egy heptadekapeptidet (FGGFTGARKSARKLAQ), amit nociceptinnek neveztek el [9]. A nociceptin szekvenciája a κ típusú opioid receptor endogén ligandjával, a dinorfinnal (YGGFLRRIRPKLKWDQ) mutatja a legnagyobb homológiát. 7

8 1.3. pioid peptidek A természetes opioid peptideket szerkezeti felépítésük alapján három főbb csoportba osztják. Ezek a Tyr-Gly-Gly-Phe -terminális szekvenciát tartalmazó peptidek (enkefalinok, endorfinok, dinorfinok), a Tyr-D-Xxx-Phe -terminális szekvenciát tartalmazó, úgynevezett békabőr peptidek (dermorfinok, deltorfinok), és az -terminálisukon Tyr-Pro motívumot tartalmazó peptidek (casomorfinok, hemorfinok, endomorfinok) (1.táblázat) Tyr-Gly-Gly-Phe peptidek Számos prokarióta és eukarióta élőlényben megtalálhatóak. Emlősöknél az aktív peptidek nagyobb prekurzor molekulákból képződnek. Az enkefalinok prekurzora a proenkefalin, a dinorfinoké a prodinorfin, az endorfinoké pedig a proopiomelanokortin. Enkefalinok Az enkefalinok elsősorban δ receptorhoz kötődnek, tízszer alacsonyabb affinitásúak a μ, és elhanyagolható affinitásúak a κ receptorral szemben. Dinorfinok Prodinorfinból származik a dinorfin A és a dinorfin B mellett az α- és β-neoendorfin. A dinorfinok igen nagy affinitással rendelkeznek a κ receptorral szemben, de a μ és δ receptorokkal szemben sem elhanyagolható az affinitásuk. Endorfinok Ide tartozik a proopiomelanokortinból, proteolitikus hatásra kihasadó, β-enfordin, egy 31 aminosavból álló peptid [10]. A β-enfordin a μ és δ receptorokhoz egyaránt nagy affinitással kötődik, míg a κ receptorhoz lényegesen kisebb az affinitása Békabőr peptidek A békabőr peptidek szekvenciájára általánosan igaz, hogy -terminálisukon egy Tyr-t, második aminosanvként egy D-aminosavat (általában D-Ala vagy D-Met), harmadik helyen pedig egy Phe-t tartalmaznak, a peptidek C-terminálisa pedig amidált. Mivel a természetben a D-aminosavak előfordulása nem jellemző, az ezekben a peptidekben előforduló D-Ala és D- Met jelenléte nagy valószínűséggel a poszttranszlációs fázisban lejátszódó izomerizációs folyamatnak köszönhető. 8

9 Ezeket az opioid agonista hatású peptideket Phyllomedusa sauvagei, illetve Phyllomedusa bicolor békák bőrkivonatából izolálták az 1980-as években. Ilyen izolált opioid peptidek: a deltorfin, a deltorfin I és a deltorfin II, melyek δ receptor szelektív agonisták, és a dermorfin, mely a μ receptorhoz kötődik nagy szelektivitással és affinitással Tyr-Pro peptidek 1997-ben fedezték fel patkányok agyában az endomorfin-1 (Tyr-Pro-Trp-Phe-H 2 ) és az endomorfin-2 (Tyr-Pro-Phe-Phe-H 2 ) peptideket, amelyek szelektív agonistái a μ- receptornak [11]. A folyamatos kutatás ellenére az endomorfinok bioszintézisének útját mai napig homály fedi. Agyba (i.c.v.) beadva a Tyr-Pro dipeptidet, azt tapasztalták, hogy az endomorfin szint a szervezetben megemelkedett, tehát feltételezhető, hogy a Tyr-Pro bioszintetikus prekurzora az endomorfin szintézisének [12, 13] pioid peptidalkoholok A farmakológiában agonistának nevezzük azokat az anyagokat, amelyek valamely receptorhoz kötődnek, és azon biológiai válaszreakciót idéznek elő. Az agonista tulajdonságú vegyületek valamely endogén ligand (hormon vagy neurotranszmitter) hatását utánozzák azzal, hogy ugyanazon receptorhoz kötődnek. Antagonistáknak azokat a vegyületeket nevezzük, amelyek megakadályozzák az agonisták által kiváltott hatásoknak a létrejöttét. A parciális agonisták kötődnek és aktiválják a recceptorokat, de nem képesek azt a biológiai hatást létrehozni, mint a teljes agonisták. Teljes agonista jelenlétében a parciális agonisták kompetítiv antagonistaként viselkednek, mert a teljes agonista hatását csökkentik azáltal, hogy versenyeznek a receptorkötődési helyekért. Az enkefalinok jól ismert δ receptor agonisták, míg a velük analóg DAMG (2-D-alanil- 4--metil-fenilalanil-5-glicinol enkefalin) régóta használt μ receptor agonista. Enkefalin H-Tyr-Gly-Gly-Phe-X X = Leu, Met DAMG H-Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-Gly-ol 9

10 Ezen információk alapján feltételezhető, hogy az opioid peptidek C-terminálisának megváltoztatása nem jár a hatás jelentős visszaesésével, viszont adott esetben jelentős szelektivitás-változást eredményezhet. 1. táblázat Az opioid peptidek elsődleges szerkezete és opioid receptor preferenciája Enkefalinok év Szekvencia Receptor preferencia [Met 5 ]-Enkefalin Tyr-Gly-Gly-Phe-Met δ [Leu 5 ]-Enkefalin Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu δ Endorfinok β-endorfin (human) Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys- Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-Phe- Lys-Asn-Ala-Ile-Ile-Lys-Asn-Ala-Tyr- Lys-Lys-Gly-Glu μ, δ Dinorfinok Dinorfin A Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg- κ Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-Asn-Gln Dinorfin B Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Gln-Phe- κ Lys-Val-Val-Thr α-eoendorfin Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-Tyr κ β-eoendorfin Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-Tyr-Pro κ Dermorfinok Dermorfin Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-H 2 μ Deltorfinok Deltorfin (Dermenkefalin) Tyr-D-Met-Phe-His-Leu-Met-Asp-H 2 δ Deltorfin I (Deltorfin C) Tyr-D-Ala-Phe-Asp-Val-Val-Gly-H 2 δ Deltorfin II (Deltorfin B) Tyr-D-Ala-Phe-Glu-Val-Val-Gly-H 2 δ Tyr-Pro peptidek β-casomorfin (bovine) Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile μ β-casomorfin (human) Tyr-Pro-Phe-Val-Glu-Pro-Ile μ Morficeptin Tyr-Pro-Phe-Pro-H 2 μ Casoxin-A Tyr-Pro-Ser-Tyr-Gly-Leu-Asn μ receptor antagonista Hemorfin-4 Tyr-Pro-Trp-Thr μ, δ Hemorfin-5 Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln μ, δ Tyr-MIF-1 Tyr-Pro-Leu-Gly-H 2 μ receptor antagonista Endomorfin-1 Tyr-Pro-Trp-Phe-H 2 μ Endomorfin-2 Tyr-Pro-Phe-Phe-H 2 μ 10

11 A szintén opioid receptorok családjába tartozó nociceptin receptor egyik antagonistáját Dooley és munkatársai [14] állították elő kombinatorikus kémiai könyvtár létrehozásával, 5000 peptid közül választották ki, szekvenciája nem is hasonlít a nociceptinéhez. A peptid szerkezete: Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Ile-Lys-H volt. Az ELTE-MTA Peptidkémiai Kutatócsoportban hosszú évek óta foglalkoznak az opioid agonista, antagonista peptidek és analógjaik szintézisével, szerkezet-hatás közti összefüggések vizsgálatával. A kutatócsoportban elkészült a Dooley-peptid peptidalkohol analógjának (Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Ile-Lys-ol) és származékainak szintézise [15, 16]. A peptidek szerkezet-hatás közti összefüggések vizsgálatát a MTA Szegedi Biológiai Központ Biokémiai Intézetében végezték [17, 18, 19]. 11

12 2. Alkalmazott módszerek 2.1. Szilárd fázisú peptidszintézis (SPPS) A peptidek felépítése aminosavakból történhet folyadék- és/vagy szilárd-fázisú szintézissel. Főleg kis tagszámú peptidek, illetve nagyobb tagszámú peptidek fragmenskondenzációja esetén a folyadék fázisú peptidszintézis módszerét alkalmazzák. Ezen technikához kidolgozott védőcsoportok, védőcsoport-kombinációk, kapcsolási eljárások szolgáltak alapul a később kifejlődött és nagy karriert befutott szilárd fázisú peptidszintézishez, mely Merrifield nevéhez fűződik [20]. apjainkban automatizált módszerek is rendelkezésre állnak, elősegítve a gyorsabb és pontosabb peptidszintézist. Az általánosan használt módszer szerint a C-terminális aminosav karboxil-csoportját kapcsoljuk a szilárd fázishoz (gyantához). Fontos, hogy ez a kötés a szintézis során állandó maradjon, ellenkező esetben az előállított peptid mennyisége és minősége nem lesz megfelelő. Az aminosavakat lépésenkénti szintézissel, vagy hoszabb tagszámú peptidlánc esetén fragmenskondenzációval kapcsolhatjuk össze. A lépésenkénti szintézis során lényegében két művelet ismétlődik minden hosszabbítási ciklusban. Az első az -terminális védőcsoport eltávolítása a védett, hosszabbítandó peptidről, és a másik az -terminálisan védett és aktivált aminosav hozzákapcsolása az előbbi peptid szabaddá vált aminocsoportjához. A növekvő peptidlánc a szintézis során végig a gyantához, mint szilárd fázishoz kötve marad, így az elreagált kapcsolószerek és a reagens feleslege egyszerű szűréssel eltávolítható a hordozóhoz kapcsolt peptid mellől. A kapcsolásnál a terminális csoportokat és a reaktív oldalláncokat megfelelő védelemmel kell ellátni. Az utolsó aminosav felkapcsolása után, következhet a védett peptid és a gyanta közti kötés hasítása. A gyanta típusától függően, megfelelő hasító reagens megválasztásával, a lehasadó peptid a C-terminálisán végződhet karboxil- vagy amidcsoportra, de akár szubsztituált peptid-amid, peptid-észter vagy peptid-alkohol is előállítható. Az oldalláncvédőcsoportok eltávolítása történhet egyidőben vagy egy további lépésben. A szilárd fázisú peptidszintézis módszereit csoportosíthatjuk az alkalmazott technika szerint (lépésenkénti szintézis vagy fragmenskondenzáció), a kivitelezés módja szerint (szakaszos vagy áramló oldatos), illetve a szintetikus stratégia (Boc/Bzl vagy Fmoc/ t Bu) alapján. 12

13 Stratégiák A lépésenkénti szintézisben a két legelterjedtebb módszer a Boc/Bzl és az Fmoc/ t Bu stratégia. Ilyenkor a peptid -terminális aminosavának H 2 -csoportját terc-butil-oxi-karbonil (Boc) vagy 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil (Fmoc) csoporttal védjük, az oldalláncok védelmére pedig többnyire benzil- vagy terc-butil-származékot alkalmazunk (2. táblázat). A Boc-technikánál az -terminális Boc védőcsoport gyenge savak hatására (pl. sósav/dioxán, trifluor-ecetsav/dcm) lehasad. Az oldalláncokon lévő benzil típusú védelem eltávolítását és a peptid gyantáról történő hasítását egy lépésben is elvégezhetjük erős savak (HF, trifluor-metán-szulfonsav) alkalmazásával. Az Fmoc-technikánál az Fmoc-csoport közepesen gyenge szerves bázissal (pl. piperidin, DBU) lehasítható. Egyes gyantákról (pl. 2-klór-tritil) a peptid már gyenge sav (pl. ecetsav) hatására is hasítható [21], így fragmens kondenzációra alkalmas védett peptid állítható elő ldallánc védőcsoportok A szilárd fázisú szintézis során a funkciós-csoportot tartalmazó aminosavak külön oldallánc-védelmet igényelnek, egyrészt a nagy reagensfelesleg, másrészt az erőteljes karboxil-csoport aktiválás miatt. Ellenkező esetben a reaktív acilező ágensek az aminocsoportok mellett az oldalláncokban található, kevésbé nukleofil csoportokat is acilezni tudják. A védőcsoportokkal szembeni legfőbb követelmény a szelektivitás, azaz a védelemnek sértetlennek kell maradnia, amikor az α-aminocsoportok védőcsoportjait lépésről lépésre lehasítjuk a molekuláról, hogy az, a következő acilezésre alkalmas legyen. Továbbá fontos, hogy a védőcsoportot hatékonyan, azaz gyorsan és könnyen lehessen eltávolítani. Amennyiben szabad peptidet kívánunk előállítani, kedvező, ha az oldalláncvédőcsoportokat a gyanta-peptid kötés hasításával egyidejűleg tudjuk eltávolítani. Ellenben, ha védett peptidet kívánunk előállítani, alapkövetelmény, hogy a funkciós-csoportok védelme a gyanta-peptid kötés hasításakor ne sérüljön (2. táblázat). 13

14 2. táblázat A leggyakrabban alkalmazott védőcsoportok Boc stratégia (oldallánc védőcsoport és peptid-hordozó kötés hasítása erős savval) Fmoc stratégia (oldallánc védőcsoport és peptid-hordozó kötés hasítása gyenge/közepesen erős savval) Átmeneti α-amino védőcsoportok tercier-butil-oxikarbonil (Boc) (hasítás TFA-val) H 3 C C 9-fluorenil-metiloxi-karbonil (Fmoc) (hasítása szekunder bázissal) H 2 C 4-toluol-szulfonil (Tos) H 3C S 2,2,5,7,8- pentametil-kromán- 6-szulfonil (Pmc) H 3 C H 3 C S Arg mezitilén-2- szulfonil (Mts) H 3C S 1,1,4,6,7- pentametil-dihidro- benzofurán-5- szulfonil (Pbf) H 3 C H 3 C S Asp, Glu benzil (Bzl) ciklohexil (chex) C H 2 tercier-butil ( t Bu) C CH3 H tritil (Trt) Asn, Gln 9-xantenil (Xan) 2,4,6-trimetoxibenzil (Tmob) H 3 C CH 2 Ser, Thr benzil (Bzl) C H 2 tercier-butil ( t Bu) C 2-bróm-benzil-oxikarbonil (2-BrZ) CH 2 Tyr Br tercier-butil ( t Bu) C Cl 2,6-diklór-benzil (2,6-Cl 2 Bzl) CH 2 Cl 14

15 Lys benzil-oxi-karbonil (Z) CH 2 tercier-butil-oxikarbonil (Boc) H 3 C C 2-klór-benzil-oxikarbonil (2-ClZ) Cl CH 2 2 Cys 3-nitro-2-piridinszulfenil (pys) S tritil (Trt) metil-benzil (Meb) H 3 C C H 2 Trp ciklohexil-oxikarbonil (Hoc) H tercier-butil-oxikarbonil (Boc) H 3 C C formil (For) tritil (Trt) His 4-toluol-szulfonil (Tos) benzil-oxi-metil (Bom) H 3C S C C H 2 H 2 tercier-butil-oxikarbonil (Boc) H 3 C C tercier-butil-oximetil (Bum) H 3 C C C H 2 15

16 A szilárd hordozó A szilárd hordozó nem más, mint egy térhálós szerkezetű polimer gyanta. A reakciók ennek megfelelően nem szilárd fázisban, hanem egy szerves oldószerrel szolvatált térhálós polimer mátrixban, azaz egy duzzadt gél rendszerben játszódnak le. A szilárd hordozó szemcséinek mérete, alakja, homogenitása, duzzadási tulajdonsága, a funkciós csoportok kiépítésének lehetősége alapvető jelentőségű a szintézis sikerességének szempontjából. A szilárd hordozóval szemben támasztott fontosabb követelmények: - tartalmazzon az aminosav-származék felkapcsolásához alkalmas funkciós csoportot, ugyanakkor ne tartalmazzon a szintézis során zavaró egyéb funkciós csoportokat - szennyezésektől mentes legyen - a kialakított peptid-gyanta kötés könnyen, hatékonyan hasítható legyen a szintézis végeztével, viszont a szintézis során végig állandó maradjon - a növekvő peptidláncok a szintézis során végig jól hozzáférhetőek legyenek mind az oldószerek, mind a reagensek számára, térgátlás miatt ne törjenek le a láncok - jó duzzadóképesség - a gyanta a szintézis körülményei között stabil legyen mind a fizikai, mind a kémiai behatásokkal szemben, azaz ne reagáljon sem a reagensekkel, sem az oldószerekkel, sem az épülő peptidlánccal Manapság a különböző szintetikus igényeknek megfelelően, az alkalmazott technikától függően számos gyanta közül választhatunk. Linkerek és gyanták változatos kombinációja révén a legkülönfélébb módon funkcionalizált és hasítható hordozók állnak rendelkezésünkre. A Boc/Bzl stratégia során leggyakrabban alkalmazott gyanta típusok: a klasszikus Merrifield-gyanta, a stabilabb észterkötést létesítő 4-(hidroxi metil)-fenoxi-acetamido-metil (PAM) gyanta, a peptidamidok előállítására kialakított benzhidril-amin (BHA) és 4-metilbenzhidril-amin (MBHA) gyanta (4. ábra). Az Fmoc/ t Bu stratégia során leggyakrabban alkalmazott gyanta típusok: a 4- benziloxi-benzilalkohol (Wang) gyanta, a 2-klór-tritil-klorid gyanta; a peptidamidok előállítására alkalmas 4-(2,4 -dimetoxi-fenil-fmoc-aminometil)-fenoxi (Rink amid), a nagyobb savstabilitású 4-(2,4 -dimetoxi-fenil-fmoc-aminometil)-fenoxiacetamido-norleucil- MBHA (Rink amid MBHA) gyanta, vagy a 5-(4-aminometil-3,5-dimetoxi-fenoxi)-valeriánsav linkerrel ellátott polietilénglikol-polisztirol alapú (PAL-PEG) gyanta (4. ábra). 16

17 Boc/Bzl stratégia Fmoc/ t Bu stratégia Cl C H 2 H C H 2 C H 2 Wang gyanta Merrifield gyanta Fmoc H H C H 2 C H 2 H C H 2 Cl H 3 C CH C H 2 PAM gyanta Cl Rink amid gyanta 2-klór-tritil-klorid gyanta H 2 CH BHA gyanta Fmoc H 3 C H CH le H CH Rink amid MBHA gyanta H 2 CH Fmoc H MBHA gyanta PAL gyanta H 3 C 4. ábra: A szilárd fázisú peptidszintézisekhez leggyakrabban használt gyantatípusok Kapcsolási eljárások A védőcsoportok helyes megválasztásához hasonlóan komoly probléma a peptidkötés kiépítésére alkalmazott módszer megválasztása. Az ideális kapcsolással szemben támasztott követelmények: gyors, mellékreakciók nem kísérik, kvantitatív kitermelést eredményez. A leggyakrabban alkalmazott aktiválási, kapcsolási módszerek a következők: - azidos kapcsolás - savkloridos kapcsolás - vegyes anhidrides kapcsolás - karbodiimides kapcsolás - szimmetrikus anhidrides kapcsolás - aktívészteres kapcsolás - in situ aktívészteres kapcsolás 17

18 Munkám során jellemzően az aktívészteres és az in situ aktívészteres kapcsolási módszereket alkalmaztam, így itt csak ezekről írok bővebben. Az aktívészteres kapcsolás lényege a következő egyenlet segítségével írható le: R-CR + H 2 -Q = R-C-H-Q + R -H R : pl. Pcp, p Aktívészter előállításakor a cél jó távozócsoport beépítése a molekulába. Ilyenek a szubsztituált fenil-észterek, melyek előállítása történhet SCl 2 -dal vagy DCC-vel. Az előállítás során minimális a racemizáció valószínűsége, és hűtve a kristályos aktívészter hosszan eltartható. Az in situ aktívészteres kapcsolás lényege, hogy az aktivált molekula a reakcióelegyben, az aminosav-származék és a reagens(ek) reakciójában keletkezik. A képződő aktívészter származékot a reakcióelegyből nem izoláljuk. Ennek egyik oka lehet, hogy az aktív formát egyből reakcióba kívánjuk vinni, vagy nincs mód az izolálásra, mert olyan reaktív a termék, hogy izolálás közben elbomlana. Utóbbira jó példa a DCC jelenlétében HBt-vel való kapcsolás, mert ebben a reakcióban képződő aktív forma nem stabil, így nem izolálható. A HBt-t más kapcsolási módszereknél katalizátorként is szokták alkalmazni, és jelenléte csökkenti a racemizációt is enyhe savas jellege miatt. A HBt katalitikus hatását a kapcsolási reakcióra hármas komplex kialakítása által fejti ki: az in situ reakcióban képződött aktív észter révén megfelelő közelségbe hozza a savamid kötést létesítő karbonil- és aminocsoportot (5. ábra). H H Q R 5. ábra: A HBt katalízis mechanizmusa In situ aktívészterek kialakítására alkalmas reagensek a már korábban említett HXt származékok (6. ábra) mellett a HBt és HAt különböző ónium származékainak hexafluorfoszfát és tertafluor-borát sói (7. ábra). Ezek a reagensek tercier bázisok (DIEA, MM, MP) jelenlétében működnek a leghatékonyabban. 18

19 Me 2 PF 6 - H H Me P + 2 Me 2 BP PyBP + P PF 6 - HBt HAt Me 2 Me 2 Me 2 C + PF 6 - Me 2 C + BF 4 - H HDhbt HBTU TBTU 6. ábra: HXt származékok 7. ábra: A HBt és HAt ónium származékai Megkülönböztetünk foszfónium és urónium származékokat. Az előbbi csoportba tartozik a BP és a PyBP. Bár a BP igen hatékony kapcsolószer, nagy hátránya, hogy a mellékterméke karcinogén hatású. A PyBP rendelkezik a BP minden előnyével, ugyanakkor acilezési mellékterméke kevésbé mérgező hatású. A HBt és a HAt urónium típusú származékai a HBTU és a TBTU, melyek nagy népszerűségre tettek szert a szilárdfázisú peptidszintézisben. A HBTU előnye, hogy vízben és szerves oldószerekben is jól oldódó, nem toxikus mellékterméket produkál. Az aktiválás mechanizmusa (8. ábra): Me 2 R - Me 2 C + Me 2 - R Me 2 C + Me 2 R Me 2 8. ábra: Az urónium típusú reagensekkel történő aktiválás mechanizmusa 19

20 A kapcsolás végbemenetelének ellenőrzése inhidrin (Kaiser) teszt E módszer a szabad amino-terminálissal rendelkező (kivétel prolin) peptidszármazékok kimutatására alkalmas [22]. A ninhidrin a szabad aminocsoportot tartalmazó vegyületekkel a következő reakcióba lép (9. ábra): 9. ábra: A ninhidrin-reakció sémája egatív a Kaiser-teszt, azaz a kapcsolás teljesnek tekinthető, ha a gyantaszemek és az oldat kékes elszíneződést nem mutat. Pozitív a próba, azaz a reakcióelegy még tartalmaz szabad -terminálisú aminosavat, peptidet, ha kékes elszíneződést tapasztalunk. Prolin kapcsolása esetén a ninhidrinnel való reakció eredményeként más szerkezetű, sárga színű termék képződik, így ez a teszt nem megfelelő a reakció követésére. Ekkor az izatintesztet szokták alkalmazni. Az -terminális Pro az izatinnal savas csoport jelenlétében kondenzációs folyamat során, kék színű termék keletkezése közben reagál el (10. ábra): H R-CH + H peptid-gyanta peptid-gyanta 10. ábra: Az izatin reakciója prolin -terminálisú peptid-gyantával 20

21 2.2. A tisztítás során alkalmazott módszerek A peptidek és általában a szerves vegyületek izolálása, tisztítása, tisztaságvizsgálata a számos kromatográfiás módszer egyikével, vagy több módszer együttes használatával történik. A kromatográfia lényege, hogy az elegy egyes komponenseit két fázis: egy álló- és egy mozgófázis segítségével választjuk el Folyadékkromatográfia Folyadékkromatográfia esetén az elválasztást az álló- és a mozgófázis között végbemenő folyamatos megoszlás biztosítja. A minta különböző komponensei eltérő megoszlási hányadosaiknak megfelelően, időben eltolódva eluálódnak. Az elválasztást az elválasztandó anyag minősége, az álló- és a mozgófázis összetétele, valamint a hőmérséklet is befolyásolja. Az olyan rendszerekben, ahol poláris állófázist alkalmazunk, a vizsgált komponens retenciója a molekula polaritásának növekedésével nő. Az ilyen tulajdonságú rendszereket hívjuk normál fázisú rendszereknek. Ha a mozgófázis polárisabb, mint az állófázis, a polárisabb moleklulák kevésbé oldódnak az állófázisban, így a vizsgált vegyület polárosságának növekedésével a retenció csökken. Ezeket a rendszereket fordított (reverz) fázisú rendszereknek nevezzük. A normál fázisú kromatográfiával elsősorban hidrofób, apoláris, vagy kevésbé poláris csoportot tartalmazó vegyületeket választhatunk el, míg a fordított fázisú módszerrel poláris funkciós csoportot vagy csoportokat tartalmazó komponenseket. Az oszlopkromatográfia során az elválasztást az állófázissal megtöltött oszlop mentén, a mozgó és az állófázis között végbemenő folyamatos megoszlás biztosítja. A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) esetén az eluens adagolását egy pumparendszer segítségével oldják meg. Két alapvető elúciós renszert használnak: az izokratikus (állandó oldószer-összetételű) és a gradiens (változó összetételű) elúciót. A HPLC-ben jelentős a fordított fázisú töltetek alkalmazása. Az FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) egy preparatív célra alkalmazott, középnyomású oszlopkromatográfiás eljárás. Hátránya a kisebb elméleti tányérszám és a kevésbé jó elválasztás, előnye az oszlopok terhelhetősége. 21

22 Vékonyréteg-kromatográfia A vékonyréteg-kromatográfia a síkelrendezésű kromatográfia egyik típusa, ahol az elválasztást egy lapra felvitt vékony állófázis segítségével valósítjuk meg. Az eluens a vékonyréteg felületén és az állófázis belsejében halad előre Farmakológiai módszerek G-protein aktivációs teszt A parciális agonista hatás bemutatására P-receptor közvetített G-protein aktivációs teszt alkalmas. A módszer elvi alapja a G-fehérje kapcsolt receptorok szekvenciális működése (jelátviteli kaszkád). Az agonista ligand kötődik a receptorhoz és aktiválja (konformációváltozás) azt. Az aktivált receptor a sejtmembránban transzlokálódik, és a heterotrimer G- fehérjék, nyugalmi állapotban szabad α-alegységéhez kapcsolódik (G α ). A ligand-receptor-g α terner komplex kialakulása a G-fehérje aktivációját jelenti, amely során előbb egy GDP GTP csere, majd egy GTP GDP + P i hidrolitikus lépés következik be az α-alegységen. Egy radiojelzett, nem hidrolizáló GTP analóg, a [ 35 S]GTPγS specifikus kötődésének nyomon követésével a G-fehérje aktiváció monitorozható (a hidrolitikus lépés elmaradása miatt a radionukleotid kovalens kötéssel rögzül a G-fehérjén, így stabil jelet ad a membránpreparátumban). Az aktivációs jel, arányos a receptorhoz kötődő agonista koncentrációjával Kompetitív kötődési kísérletek A kompetitív kötődési kísérletek kivitelezése patkány agyszövetből preparált sejtmembrán frakción történik. A patkány agy kielégítő mennyiségben tartalmazza a receptorokat. A membránpreparálás differenciál-centrifugálás módszerével történik. A specifikus kötést az ún. összes kötés és a jelöletlen ligandanalógok jelenlétében mérhető nem-specifikus kötés különbségeként definiálható. A módszer a fehérjéhez kötött és a reakcióelegyben maradt szabad ligand elválasztásán alapul. A vizsgálandó ligandok szelektivitása és relatív hatáserőssége egyensúlyi kompetíciós kísérletekkel határozható meg ismert referenciaanyagok alkalmazásával. A kísérlet első lépésében a megfelelő receptort tartalmazó membrán preparátumot egy ismert, radioaktívan jelölt referencia-liganddal inkubálják. Ezt követően 22

23 juttatják a rendszerbe a vizsgálandó vegyületet. Ha a vizsgált vegyület képes a megfelelő receptorokhoz kötődni, az tapasztalható, hogy annak molekulái kompetitív módon leszorítják a receptorról a referencia-ligandot. Erre utal, hogy a membrán preparátumban mérhető radioaktivitás a szabad ligandok elválasztása után lecsökken. A kötési kísérletek matematikai kiértékelése komplex számítógépes görbeillesztési programok segítségével történik, amelyeket klasszikus enzimkinetikai-, illetve a receptor ligand kölcsönhatások egzaktabb leírását adó modellek alapján fejlesztettek ki. Ezek alapján az egyensúlyi kompetíciós kísérletekből nyerhető adat az 50%-os gátláshoz tartozó koncentráció (IC 50 ) ), illetve az egyensúlyi inhibíciós állandó (K i ). A receptor kötési tesztek előnye, hogy a vizsgálandó anyagokból általában csak kis mennyiségek szükségesek. 23

24 3. A szintetikus munka alapját képező elméleti háttér 3.1. ociceptin neuropeptidek és analógjaik A nociceptin neuropeptidet és receptorát 1995-ben fedezték fel [8]. Az endogén peptid 17 aminosavból épül fel, és szabályos módon keletkezik egy nagy molekulatömegű prekurzor polipeptid enzimatikus hasításának eredményeként. A nociceptin peptid és a nociceptin receptor (P receptor) az opioid peptidekkel, illetve az opioid receptorokkal áll közeli rokonságban. Lényeges különbség azonban, hogy a nociceptin rendszer nem gátolható az opiát antagonista naloxonnal, illetve az opioid peptidektől különbözően, a nociceptin a fájdalomérzetet is növelheti (hiperalgézia, antiopiát hatás). A nociceptin fájdalomcsillapító- vagy fájdalomnövelő hatása függ a peptid dózistól, a beadási módtól és helytől (pl. gerincvelői szinten fájdalom gátlás, szupraspinálisan = magasabb agyi központokban inkább az antianalgetikus hatás fejeződik ki) és egyéb tényezőktől is. Könnyen belátható, hogy egy antiopiát, illetve kevert hatású peptid és receptora a fájdalomcsillapítás új lehetőségeit kínálja: ha a nociceptin fájdalom fokozó hatásaiból indulunk ki (nagyobb peptid-dózisoknál ez következetesen jelentkezik), akkor pl. egy szelektív nociceptin receptor antagonista hatóanyag elvben fájdalomcsillapító hatású kell legyen. Mivel a fájdalom-terápiában alkalmazott (egyébként hatékony) opioid alapú fájdalomcsillapítók (morfin) több mellékhatást is hordoznak (gátolják a légzőközpontot: heroinos aranylövés utáni fulladásos halál ; fékezik a belek perisztaltikus mozgását: kellemetlenül erős székrekedés jelentkezik; és akár hozzászokást is okozhatnak: drogfüggőség, kábítószer-problémák), az opiát-kezelés veszélyeinek kiváltása lehet az opioidreceptorokat elkerülő terápiák, illetve hatóanyagok kifejlesztése. A nociceptin P-receptor rendszer lehet az egyik alternatív támadáspont, egyben perspektivikus kutatási terület. A nociceptin heptadekapeptid számos szintetikus analógját állították elő. Az alanin-scan és a D-aminosav-scan módszereivel feltérképezték a szekvencia fontos elemeit, emellett vizsgálták a különféle egyedi aminosav-szubsztitúciók jelentőségeit is. A P-receptor peptidanalógok másik fontos csoportja a kombinatorikus peptid-kémia módszereivel született meg: Dooley és munkatársai [14] több hatékony opioid és P-receptor hexapeptidet találtak kombinatorikus szintézissel előállított peptid-könyvtár szisztematikus elemzésével ( screening ). 24

25 A hexapeptidek közül P-receptor szelektívnek találták az Ac-RYYRIK-H 2 és az Ac- RYYRWK-H 2 analógokat. Az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport (Budapest) és az MTA-SzBK Biokémiai Intézet pioid Receptor Csoport (Szeged) munkatársainak egyik tudományos együttműködése szelektív P-receptor antagonisták kifejlesztésére irányul. A templátszekvenciaként használt Dooley-féle analógok további kémiai módosításaival (pl. a C- terminális redukálása: -CH -CH 2 H; arginin citrullin szubsztitúciók; az -acetil csoport szisztematikus helyettesítései) előállítottak közel húsz hexapeptid-analógot [15-16]. Ezek közül az Ac-RYYRK-ol szerkezet bizonyult a legígéretesebbnek [17-19]: - nagy affinitású, szelektív P-receptor ligand - in vitro antagonista (biokémiai rendszerekben és izoláltszerv készítményeken) - állatkísérletes modellekben in vivo agonista A kutatómunkában résztvevők mai értékelése alapján az Ac-RYYRIK-ol (és néhány további Dooley-peptid is) az úgynevezett parciális agonista ligandok családjába tartozik. A parciális agonisták önmagukban aktiválják a receptort (bár a tiszta agonistáknál kisebb hatékonysággal), tiszta vagy teljes agonisták (angol terminológia: full ) hatásait viszont antagonizálják. A forgalomban lévő gyógyszerek között egyre több parciális receptor agonista hatóanyag található. Szerin-proteáz szubsztrát- és enzimgátló peptidek esetében bizonyos Lys Arg szubsztitúciók hatékonyabb származékokat eredményeztek (Bajusz S., személyes kommunikáció). A hatékonyság növekedésének valószínűsíthető oka ebben az esetben a guanidinium-csoportnak a hidrogén-híd(ak) kialakítására mutatott nagyobb hajlandósága. Az előbbiek miatt felvetődött az Ac-RYYRIK-ol peptid Lys 6 -ol elemének helyettesítése Arg 6 -ol szerkezettel Elongált enkefalin analógok Emlősökben, így az emberben is kétféle enkefalin található: Met- illetve Leu-enkefalin. A többi opioid peptidhez hasonló módon mindkét pentapeptid nagy molekulatömegű (fehérje méretű) prekurzor polipeptidből képződik endopeptidáz enzimek hatására. Az enkefalinok elsődleges forrása a proenkefalin, a prekurzor (PEK), amiből végső soron 6 kópia Met- és egyetlen kópia Leu-enkefalin keletkezhet. Leu-enkefalin másodlagosan képződhet a 25

26 prodinorfin prekurzorból is (PDY, másképpen proenkefalin-b), mert az abból kivágódó opioid peptidek mind tartalmazzák a Leu-enkefalin motívumot. Az opioid peptidek, így az enkefalinok szerkezete (aminosav szinten) jól konzervált az emlősökön belül, az enkefalinok valamennyi fajban azonosak, míg a β-endorfin valamivel változékonyabb (pl. a teve, az ember és a sertés β-endorfin szekvencia különbözik). Viszonylag kevés ismeret gyűlt össze más fajok esetében, noha úgy tűnik, az opioid peptidek egy szélesebb rendszertani-evolúciós skálán sokkal változékonyabbak. Alacsonyabb rendű gerincesekben, elsősorban hal- és béka-fajokban génszekvenciákon alapuló bioinformatikai adatok alapján több, emlősben ismeretlen, természetes enkefalin szekvencia azonosítható. A variabilitás különösen szembetűnő a PEK negyedik és hetedik pozícióiban található elongált Met-enkefalinok (az oktapeptid illetve a terminális heptapeptid régió, lásd 3. táblázat) esetében. Itt több egyedi szekvencia azonosítható. Azt is mondhatjuk, hogy az evolúció, mint mutációkkal, kereszteződésekkel és kiválasztással zajló biológiai folyamat, maga is egyfajta természetes kombinatorikus peptid könyvtárat eredményez: a teljes mai fajgazdag életközösség még lényegében feldolgozatlan protein- és peptid-mintázatát. [23]. 26

27 Proenkephalin (PEK) ctapeptide Heptapeptide Homo sapiens KRYGGFMRGLKR KRYGGFMRF Xenopus laevis KRYGGFMRGYRR KRYGGFMRGYRR KRYGGFMRF KRYGGFMRF Spea multiplicata KRYGGFMRYRR KRYGGFMRF Danio rerio KRYGGFMRR KRYGGFMGY Protopterus annectens KRYGGFMRSLKR KRYGGFMGY Lepisosteus platyrhynchus KRYGGFMRSVRR KRYGGFMGY Amia calva KRYGGFMRSIKR KRYGGFMGY Heterodontus portusjacksoni KRYGGFMGFKR KRYGGFMRI Storeria dekayi KRYGGFMRSIKR KRYGGFMRF 3. táblázat: Hüllő- és halfajokban fellelhető enkefalin szekvenciák 27

28 4. Célkitűzések Az Ac-RYYRIK-ol (és néhány további Dooley-peptid is [14-19]) az úgynevezett parciális agonista ligandok családjába tartozik. A forgalomban lévő gyógyszerek között egyre több a parciális receptor agonista hatóanyag található. Szerin-proteáz szubsztrát- és enzimgátló peptidek esetében bizonyos Lys Arg szubsztitúciók hatékonyabb származékokat eredményeztek. Feladatom volt az Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Ile-Arg-ol hexapeptid-analóg előállítása, az ehhez szükséges Fmoc-Arg(Pbf)-ol szintézise. További célunk volt, hogy megvizsgáljuk az eddig azonosított néhány természetes, ugyanakkor emlősökben nem található elongált-enkefalin biológiai hatását. Feladatom a kiválasztott okta- és heptapeptidek szintézise volt (4. táblázat). Proenkephalin (PEK) ctapeptide Heptapeptide Xenopus laevis Spea multiplicata Protopterus annectens Lepisosteus platyrhynchus Amia calva YGGFMRGY YGGFMRY YGGFMRSL YGGFMRSV YGGFMRSI Heterodontus portusjacksoni YGGFMGF YGGFMRI 4. táblázat: Szintetizálandó enkefalinok 28

29 5. Tervezett stratégia 5.1. A peptidalkohol előállítása Fmoc-Arg(Pbf)-ol előállítása Az aminoalkoholok előállításának legkézenfekvőbb módja az aminosavak redukciója. Az aminoalkoholok redukciójára két módszer használható. Az egyik eljárás lényege, hogy a kiindulási védett aminosavnak először a metilészterét állítjuk elő, majd az észter redukcióját végezzük el in situ előállított acetoxi-borohidriddel. Egy másik irodalom szerint a redukció in situ előállított vegyes-anhidriden keresztül végezhető nátrium-borohidriddel [24]. A megfelelően védett arginol előállítása (11. ábra) vegyes-anhidriden keresztül nátriumborohidriddel végzett in situ reakcióval történt a laboratóriumban kidolgozott eljárás alapján. H H H H C 5 H 9 Cl 2 MM, THF C, 12 min ahb 4 0 C H H 3 C S H H H 3 C S H H H 3 C S H H H H H H 3 C H 3 C H 3 C 11. ábra: Fmoc-Arg(Pbf)-ol előállítása Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Ile-Arg-ol előállítása A peptidalkoholok szintézisénél problémát jelent a C-terminális aminoalkoholok gyantára való felkapcsolása, hiszen olyan megoldást kell választani, amelynél az éterkötés könnyen kialakítható, és a létrejött kötés kellően stabil marad a lépésenkénti szintézis során. Peptidalkoholok előállításával Wenschuh és munkatársai foglalkoztak [25], munkájuk során Fmoc-stratégiát alkalmaztak 2-klór-tritil gyantán, védett aminosav-fluoridok felhasználásával. Az aminoalkoholok 2-klór-tritil gyantára történő közvetlen felkapcsolásának optimalizálását laborunkban Kocsis László [15] végezte el, Lys-ol esetében. 29

30 A fenti eredményeket felhasználva állítottam elő az Arg-ol tartalmú peptidalkoholt: szilárd fázisú peptidszintézist, azon belül is Fmoc/ t Bu stratégiát (12. ábra) alkalmaztam, szilárd hordozóként 2-klór-tritil gyantát használtam Az enkefalin-származékok előállítása Az enkefalinok szintéziséhez szilárd fázisú peptidszintézist, Fmoc/ t Bu stratégiát alkalmaztam (12. ábra). Szilárd hordozóként 2-klór-tritil gyantát használtam, és a peptideket SYR (MultiSyntech) automata peptidszintetizátor segítségével állítottam elő. A C-terminális aminosavakat előre felkapcsoltam a gyantára. 12. ábra: Fmoc-technika szintézis protokollja 30

31 6. Kísérleti rész 6.1. Általános megjegyzések A aminosav alkohol előállításakor a reakciók nyomon követése MERCK-féle VRK lapokon végzett vékonyréteg-kromatográfiás futtatással történt. Az aminosav-származék retenciós faktorai az alsó indexben feltüntetett eluensre vonatkoznak. Az alkalmazott futtatóelegyek: 1. etil-acetát : piridin: jégecet : víz = 240 : 20 : 6 : etil-acetát : piridin: jégecet : víz = 120 : 20 : 6 : Az előhívásnál alkalmazott módszerek inhidrin módszer: 3%-os acetonos ninhidrin oldatba mártjuk, majd pár percre 100 C-os szárítószekrénybe helyezzük az előhívandó VRK-lemezt. E módszer a szabad aminoterminálissal rendelkező (kivéve prolin) peptidszármazékok kimutatására alkalmas. Klór-tolidin módszer: 8,3 g kálium-jodidot tartalmazó 100 cm 3 2,5 %-os ecetsav-oldathoz hozzáadunk 100 cm 3 2%-os etanolos tolidin-oldatot. A kromatogramot pár percre klórfürdőbe helyezzük, majd szellőztetés után tolidin-reagenssel lefújva előhívjuk. A szilárd fázisú peptidszintézis során a kapcsolás teljes végbemenetelét Kaiser-teszttel vizsgáltam. A Kaiser-teszthez szükséges oldatok készítése: A oldat: 3,3 mg KC-ot oldunk 5 ml vízben, ennek 0,2 ml-es részletét piridinnel 10 ml-re egészítjük ki B oldat: 500 mg ninhidrint 10 ml n-butanolban (vagy EtH) oldunk C oldat: 40 g fenolt 10 ml n-butanolban (vagy EtH) oldunk A Kaiser-teszt kivitelezése: A gyanta kis részletét kis üvegszűrőn többször mossuk absz. DCM-el és absz. metanollal, végül dietil-éterrel. A mosott gyantát kis kémcsőbe tesszük, és az A, B, C oldatokból két-két cseppet adunk hozzá, ekkor sárga színű oldatot kapunk. Fmoc 31

32 védőcsoport esetén 5, Boc esetén 7 percre 100 C-on melegítjük. Kék szín pozitív eredményt jelez, szabad amino-csoportok vannak még jelen, a kapcsolást meg kell ismételni; a sárga szín negatív eredményt jelez, a kapcsolás teljes mértékben lejátszódott Gyantakapacitás meghatározása A gyantakapacitás mérése nitrogéntartalom meghatározásával VARI EL III automata elemanalizátoron történt Tisztaság ellenőrzése A peptidek tisztaságának ellenőrzésére analitikai RP-HPLC-t alkalmaztam (KAUER készülék, Synergi MAX-RP, C12, 250 x 4mm, 5mm szilika, 100 Å oszlop). Az elválasztáshoz lineáris gradiens elúciót alkalmaztam (5%B 95 % B, 50 perc). Az oszlop ekvilibrálásához és az elúcióhoz alkalmazott elegyek a következőek voltak: A eluens: 0,1% TFA /víz (V/V) B eluens: 0,1% TFA /acetonitril-víz (80:20 V/V). Az A eluensben oldott 0,5-1,0 mg/ml töménységű mintákból az oszlopra 20 μl mennyiségeket injektáltam. Az elválasztásokat szobahőmérsékleten végeztem, a folyási sebesség 1 ml/perc volt. A detektálás abszorbancia mérésével (λ=220nm) történt Preparatív tisztítás A nyers peptideket preparatív FPLC készülék (Pharmacia, Uppsala, Svédország) alkalmazásával tisztítottam. Az oszlopon (Vydac, C18, 300 Å, 25μm, 480x25mm, Vydac, Hesperia, C.A., USA) lineáris gradiens elúciót alkalmaztam (25%B 45 % B, 30 perc). Az A eluensben oldott ~5 mg/ml töménységű mintákból az oszlopra 10 ml mennyiségeket injektáltam. Az elválasztásokat szobahőmérsékleten végeztem, a folyási sebesség 8 ml/perc volt. A detektálás abszorbancia mérésével (λ=220nm) történt Tömegspektrometriás mérés A mérések Bruker Esquire típusú ioncsapdás tömegspektrométer készüléken történtek. A mintákat 0,1 % AcH-t tartalmazó AC/víz 1:1 (V/V) oldószerelegyben 32

33 oldottuk. A mintákat 10 μl/perc áramlási sebességgel injektáltuk. A minták ionizációja elektrospray forrással történt. A spektrumokat 4,0 kv túlfeszültséggel és 40,0 V orifice feszültséggel vettük fel. A készüléket pozitív módban használtuk m/z tartományban, 13,000 m/z/sec mintavételi sebességgel Fmoc-Arg(Pbf)-ol előállítása H 3 C H 3 C H H H S H H C 34 H S Exact Mass: 634,28 Mol. Wt.: 634,79 C, 64.33; H, 6.67;, 8.83;, 15.12; S, ,4 g (10 mmol) Fmoc-Arg(Pbf)-H-t feloldottam minimális absz. THF-ben (kb ml), majd az elegyet C-ra hűtöttem, és hozzáadtam 2340 μl (20 mmol; 2 ekvivalens) MM-t és 2620 μl (20 mmol; 2 ekvivalens) klórhangyasav-izobutilésztert. Az elegyet 15 percig kevertettem (erős csapadékkiválás MM-hidroklorid). A reakcióidő elteltével a csapadékos elegyet üvegszűrőn 1200 mg (31,74 mmol) abh 4 - ot tartalmazó gömblombikba szűrtem (külső hűtés: 0 C!!), a csapadékot további ml absz. THF-vel mostam. Ezután állandó kevertetés mellett az elegyet szobahőmérsékletre hagytam melegedni, majd egy éjszakán át reagáltattam. Másnap a reakcióelegyhez 4 ml jég + 4 ml desztillált víz + 1,4 ml AcH elegyét öntöttem, ekkor erősen exoterm reakcióban (külső jeges hűtés), hidrogénfejlődés mellett elreagált a abh 4 feleslege és csapadékkiválás volt tapasztalható. A csapadékról a THF-t vákuumban 33

34 bepároltam, majd a csapadékot etil-acetátban oldottam és a keletkező két fázist elválasztottam. A reakcióelegyben maradt kiindulási aminosav eltávolítására a szerves fázist desztillált vízzel, 10 %-os ahc 3 oldattal (VRK ellenőrzés, ha szükséges: 10 %-os a 2 C 3 oldattal) és 30 %-os acl oldattal mostam. A szerves fázist MgS 4 felett szárítottam, és az etil-acetátos oldatot vákuumban bepároltam. A nyersterméket szilikagélen oszlopkromatográfiás módszerrel tisztítottam etil-acetát : piridin: jégecet : víz = 120 : 20 : 6 : 11 elegy alkalmazásával. A termék tisztaságát vékonyréteg-kromatográfiával és elemanalízissel ellenőriztem. A nyerstermék tömege: 3,09 g Kitermelés: 1,47 g (23 %) Elemanalízis: várt: C: 64,33; H: 6,67; : 8,83; : 15,12; S: 5,05 kapott: C: 64,14; H: 6,82; : 8,35 R f1 = 0,61 R f2 = 0, Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Ile-Arg-ol előállítása C 44 H Exact Mass: 953,56 Mol. Wt.: 954,13 H H 2 H H H H 2 H H H C H H H H H H H H 2 H 34

35 Fmoc-Arg(Pbf)-ol 2-klór-tritil gyantára való kapcsolása A kapcsoláshoz tiszta absz. THF és piridin szükséges. THF tisztítása: 120 ml, MgS 4 felett szárított THF-hez pár spatula LiAlH 4 -et adtam, és Ar-gáz buborékoltatása mellett 30 percig refluxoltattam, majd az elegyet ledesztilláltam, a főpárlatot (64 C) előre kiizzított molekulaszűrőn tároltam. Piridin tisztítása: a piridinhez 3 spatula P 2 5 -t adtam, hagytam állni, majd ledesztilláltam (főpárlat: 112 C). Az aminosav-alkohol gyantára történő kapcsolásakor a gyanta: aminosav: piridin = 1:4:32 arányt alkalmaztam. Az Arg-ol-t (0,444 g, 0,7 mmol) 5 ml absz.thf-ban oldottam, hozzáadtam 0,25 g (gyári kapacitás: 1.4 mmol/g) klór-tritil gyantát, majd 453 μl absz. piridint, az egészet 50 C-on tartva egy éjszakán át kevertettem. Másnap a gyantát szűrtem, THF-nal, metanollal, majd éterrel mostam. Jól leszívattam, és exszikkátorban szárítottam. A kapcsolás után a gyanta kapacitása: 0,26 mmol/g A reakcióedény szililezése Az üveg reakcióedényt feltöltöttem 5% dimetil-klór-xilán + 2-5% trimetil-klór-xilán / toluol oldattal, és 1 órát állni hagytam. Utána absz. metanollal töltöttem fel, és 10 percig hagytam benne, majd a reakcióedényt kiszárítottam. A gyanta előkészítése A gyantát Pasteur-pipettával a rakcióedénybe vittem át, mostam 2x THF-nal, majd 0,8 cm 3 /g gyanta absz. MeH-lal 10 percig reagáltatva a gyantát, letörtem a gyanta szabadon maradt aktív kötőhelyeit. A gyantát mostam 3x DCM-nal, 2x DMF-dal, 4x iprh-lal és végül 2x MeH-lal. Az Fmoc-védőcsoport hasítása előtt a gyantát 30 percig DMF-ban duzzasztottam, majd DCM-ban állni hagytam 5 percre. Az első aminosav Fmoc-csoportjának hasítása A gyantához kapcsolt első aminosav Fmoc-védőcsoportjának hasítását három lépésben végeztem. Először 10 percig 5% (V/V) piperidint tartalmazó DCM-nal, majd 15 percig 30% (V/V) piperidin/dmf eleggyel, végül 30 percig 50% (V/V) piperidin/dmf eleggyel reagáltattam a reakcióelegyet. A hasítást követően a gyantát 7x mostam DMF-dal (ha kellett, többször, amíg a piperidin szagát már nem lehetett érezni). 35