Poli-ADP-riboziláció a bőrben különös tekintettel a sebgyógyulásra. Dr Szabó Éva DEOEC Bőrklinika

Átírás

1 Poli-ADP-riboziláció a bőrben különös tekintettel a sebgyógyulásra Dr Szabó Éva DEOEC Bőrklinika

2 Poli-ADP-riboziláció Bőrben Melanomában Sebgyógyulás folyamatában

3 A DNS törés PARP aktivációt okoz DNS törés Citoplazma PARP (aktív) NAD + PARP (inaktív) PARG Sejtmag

4 DNS hibajavítás A genomintegritás fenntartása Kromatin szerkezet, DNS replikáció, génexpresszió, transzkripció Sejtproliferáció és differenciálódás Sejthalál

5 Bélischemia-reperfúzió Miokardiális I/R Stroke Diabétesz Diabétesz szövődményei Colitis Arthritis Uveitis Asthma Endotoxin sokk Vérzéses sokk Agytrauma Gerincvelő sérülés Parkinson kór (MPTP) Alzheimer demencia* Napégés Kontakt hiperszenzitivitás Melanoma Krónikus sebek-sebgyógyulás

6 1. PAR kimutatása normál bőrben 2. Ha igen, hova lokalizálódik Immunhisztokémiai módszer

7 Keratinocitákban Szőrtüsző sejtjeiben Ér endothel sejtekben

8 Sebocytákban Subcutan adipocytákban Melanocytás naevus sejtekben

9 Poli-ADP-ribóz szintetizálódik a normál bőrben, az epidermisben (Ross, 1998, Szabo E.,Virag és mtsai 2001) legkifejezettebben a basalis sejtekben (Bakondi és mtsai 2002), szőrtüszőkben: PAR szerepe a replikáció, proliferáció szabályozásában PAR jelenléte adypocytákban (Hsu, Yen 2006, Janssen 1989), sebocytákban : PARP-1 interakciója a retinoid X receptor-pparγ heterodimerrel (Miyamoto és mtsai 1999, Rosenfield 1999)

10 Poli-ADP-riboziláció melanoma malignumban

11 Legagresszivebb bőrdaganat A 6. leggyakoribb daganat Incidenciája napjainkban is emelkedik Rizikó tényezők: magas naevus összsejtszám anamnézisben korábbi bőrdaganat intermittáló erős napsugárzás gyerekkori napégés

12 Melanoma malignum kezelési lehetőségei Korai diagnosztizálás Megfelelő sebészi kezelés Terápiás lehetőségek: kemoterápia biokemoterápia immuno adjuváns kezelés tumor-specifikus vaccináció citokinek monoklonális antitestek specifikus immunstimulálás PARP- gátlás?

13 PAR kimutatása különböző típusú és stádiumú melanoma malignumban Retrospektiv vizsgálat: 40 beteg (10 SSM, 10 lentigo maligna melanoma, 10 noduláris melanoma, 10 bőr metastasis ) Kontroll: normál bőr, melanocytás naevus Immunhisztokémiai módszer

14 SSM Lentigo maligna melanoma Nodularis melanoma

15 PAR expesszió a vizsgált melanoma malignumban szenvedő betegek mintáiban

16 Korreláció a PAR festés és a Breslow Index Között Number of XY Pairs Spearman r 95% confidence interval P value (two-tailed) P value summary Exact or approximate P value? Is the correlation significant? (alpha=0.05) to ** Gaussian Approximation Yes 15 correlation Breslow PAR

17 Korreláció a PAR festés és a Clark Stádium Között Number of XY Pairs Spearman r 95% confidence interval P value (two-tailed) P value summary Exact or approximate P value? Is the correlation significant? (alpha=0.05) to * Gaussian Approximation Yes 6 correlation 4 Clark PAR

18 A mitotikus sejtekben nagyobb a PARP aktivitás (Bakondi, Virág és mtsai, 2002) A tumorsejtekben kimutatható fokozott oxidativ stressz is okozhat PARP aktiváció (Sander és mtsai, 2003) Tumorsejtek fokozott oxigenizációja is okozhat PARP aktivitást, amire a tumor körüli erek intenziv PAR festése utal Fokozott de novo angiogenesis: VEGF és HIF-1 transzkripciójához PARP-1 aktiváció szükséges (Obrosova, 2004, Pacher 2003) PARP szükséges MMP-ok (Bai és mtsai, 2009, Pacher 2003), adhéziós molekulák, inflammatorikus faktorok (Szabo E, Virág 2001) transzkripciós faktorok termelődéséhez (Hassa2008), melyek szintén fontosak a tumorogenesis folyamatában

19 A PAR metabolizmus fontos target lehet a melanoma malignum adjuváns kezelése során (Tentori 2003, Plummer 2008) Klinikai kipróbálások folynak különböző tumorokban PARP gátlókkal (Fong 2009) A PAR tartalom meghatározása segítséget nyújthat a PARP gátlókkal végzendő daganatellenes kezelés hatékonyságának előrejelzésében

20 Eredményeink ismertetése Poszter ESDR konferencián 2011 szep. Barcelona: 1. Poly(ADP-ribosyl)ation in the skin: physiological roles and contribution to skin pathology László Virág, Péter Bai, Petra Lakatos, Edina Bodnár, Éva Remenyik, Éva Szabó Departments of Medical Chemistry and Dermatology, Medical and Health Science Center, University of Debrecen, Hungary 2. Correlation of the biopolymer poly(adp-ribose) with clinical parameters of malignant melanomas Zsuzsanna Géhl 3, Péter Bai 1, Edina Bodnár 2, Gabriella Emri 2, Éva Remenyik 2, János Németh 3, Pál Gergely 1, László Virág 1, Éva Szabó 2 Departments of 1 Medical Chemistry and 2 Dermatology, Medical and Health Science Center, University of Debrecen, Hungary 3 Semmelweis University, Department of Ophthalmology, Budapest, Hungary

21 Eredményeink ismertetése II. Közleményként elfogadva: Histology Histopathology Poly(ADP-ribose) in the skin and in malignant melanomas Zsuzsanna Géhl 1,2, Péter Bai 1,3, Edina Bodnár 4, Gabriella Emri 4, Éva Remenyik 4, János Németh 2, Pál Gergely 1,3, László Virág 1,3, Éva Szabó 4 1 Department of Medical Chemistry, Medical and Health Science Center, University of Debrecen, Debrecen, Hungary 2 Semmelweis University, Department of Ophthalmology, Budapest, Hungary, 3 Cell Biology and Signaling Research Group of the Hungarian Academy of Sciences, Debrecen, Hungary 4 Department of Dermatology, Medical and Health Science Center, University of Debrecen, Debrecen, Hungary

22 Poli-ADP-riboziláció sebgyógyulásban

23 A krónikus sebek közös jellemzői perzisztáló gyulladás hipoxia bakteriális kolonizáció

24 Krónikus sebek Krónikus vénás keringési elégtelenség talaján kialakult ulcus Diabeteses ulcus Decubitus

25 KVE patomechanizmusa Hosszan fennálló hidrosztatikai nyomás, stasis, hypoxia endothel sejt, leukocita, makrofág, mastocita aktiváció citokinek, növekedési faktorok, adhéziós molekulák expressziója, reaktiv oxigén, nitrogén intermedierek gyulladás

26 Reaktiv intermedierek Szuperoxid anion Hidrogén peroxid Hidroxil gyök Nitrogén monoxid Nitroxil anion Peroxinitrit

27 L-arginin citrullin NOS mitokondriális e - transzport NADPH oxidáz, xantin oxidáz katechol auto-oxidáció NO. + O 2.- ONOO - lipid peroxidáció fehérje oxidáció fehérje nitrálás Metalloenzimek inaktivációja Ψ m Citoplazma apoptózis cyt c AIF DNS fragmentáció DNS törés kaszpáz aktiváció PARP (aktív) NAD + PARP (inaktív) NAD + és ATP depléció nekrózis PARG Sejtmag

28 Célkitűzések 1. Termelődik-e peroxinitrit (az NO és szuperoxid reakcióterméke) a sebgyógyulás során, és befolyásolja-e az elhúzódó sebgyógyulást 2. Kimutatható-e PARP aktiváció a sebgyógyulás során, és van-e szerepe a krónikus seb kialakulásában

29 Állatkísérletek Egér incíziós seben inos (az NO fő termelője) expresszó kimutatása immunhisztokémiai módszerrel. Az inos expresszió a sebszéleken volt a legintenzívebb.

30 Kísérletek tenyésztett HaCaT keratinocitákon HaCaT keratinocitákon peroxinitrit expozíció hatására módosult a gyulladásos citokinek, kemokinek expressziós mintázata, amit low density array (mrns szint) módszerrel detektáltunk. Peroxinitrit hatására egyes gének csökkent (sárga), mások fokozott (piros) működését mutatnak

31 ONOO DNS törés PARP útvonal vizsgálata human mintákon 10 beteg (KVE talaján kialakult ulcus): Szérum Sebfolyadék vizsgálata Biopsia az ulcusok széli részéből

32 Immunhisztokémiai vizsgálatok Sebfolyadék és szérum vizsgálata: Dot-blot: tirozin nitrálás (ONOO indikátor) Szövettani metszeteken - Tirozin nitrálás - PARP expresszió és aktiváció vizsgálata

33 Nitrált Fehérjék Kimutatása Ulcus Crurisban Fekélyes betegek széruma (3x) Nitrotirozin immunfestés MS 1A HF 3A VS 2A HI 5A HA 4A Neg ktl Normál szérum Poz. KTL. (nitrált BSA)

34 PARP-1 expresszió a sebszélen Sebszél Sebtől távolabb

35 Poli(ADP-ribóz) akkumuláció ulcus crurisban I. Ulcus Kontroll PAR immunfestés

36 Poli(ADP-ribóz) akkumuláció ulcus crurisban II. PAR immunfestés

37 Összefoglalás Eredményeink azt mutatják, hogy a nitrogenmonoxid- peroxinitrit- PARP útvonal a krónikus sebekben aktívan jelen van.

38 Tervek A peroxinitrit és PARP aktiváció hogyan befolyásolja a hipoxia-vegfangiogenezis útvonalat, továbbá, hogyan hat a poli-adp-riboziláció (PARP és PARG) a gyulladásos mediátorok termelődésére krónikus sebekben állatmodel: PARP KO egér Katalítikus antioxidánsok, PARP gátlók hatásának vizsgálata sebgyógyulásban humán vizsgálatok kiterjesztése nagyobb esetszámra és más típusú krónikus sebekre (lábszárfekélyes, diabeteses ulcusban szenvedő betegek) összehasonlító vizsgálatok akut és krónikus sebek között

39 Köszönet! DEOEC Bőrklinika munkatársainak: Dr Remenyik Éva Dr Emri Gabriella Dr Bodnár Edina DEOEC Orvosi Vegytani Intézet munkatársainsak: Dr Virág László Dr Bai Péter Dr Hegedűs Csaba Lakatos Petra Semmelweis Egyetem, Szemklinika: Dr Géhl Zsuzsanna Kutatási támogatás OTKA- K75864, témavezető IKUT-Derminova