PROBLÉMAMEGOLDÁS A KLÓNOZÁSBAN. Dr. Frank Schestag / Fermentas GmbH. Dr. Dorgai László. Biocenter Kft

Átírás

1 PROBLÉMAMEGOLDÁS A KLÓNOZÁSBAN Dr. Frank Schestag Fermentas GmbH PhD in molecular biology/biochemistry product menager at Fermentas Life Sciences head of technical service and customer support Dr. Dorgai László Biocenter Kft Ph.D. molekuláris biológia Molekuláris biológia termékfelelős

2 PROBLÉMAMEGOLDÁS A KLÓNOZÁSBAN A KLÓNOZÁS 3 NAP ALATT KIVITELEZHETŐ! 1. NAP VEKTOR ÉS INZERT PREPARÁLÁS LIGÁLÁS, TRANSZFORMÁLÁS 2. NAP A TRANSZFORMÁNSOK ANALÍZISE (KOLÓNIA PCR, A POZITÍVOK KIKERESÉSE) 3. NAP MINIPREP, RESTRIKCIÓS ANALÍZIS

3 AZ ELŐADÁS TÉMÁJA: - GYAKRAN FELMERÜLŐ PROBLÉMÁK - EZEK OKAI - LEHETSÉGES MEGOLDÁSOK CÉL: - A KLÓNOZÁSI ELJÁRÁS OPTIMALIZÁLÁSA - 80% POZITÍV ARÁNY!

4 NEM EMÉSZTŐDIK! NEM LIGÁLÓDIK! NINCS TRANSZFORMÁNS! NEM A KÍVÁNT INZERT VAN A TRANSZFORMÁNSBAN!

5 VEKTOR ÉS INZERT DNS PREPARÁLÁS - PCR - RESTRIKCIÓS EMÉSZTÉS - DNS MODIFIKÁCIÓ - FRAGMENT IZOLÁLÁS, GÉLEXTRAKCIÓ - KONCENTRÁCIÓ MÉRÉS LIGÁLÁS - A REAKCIÓ ÖSSZEÁLLÍTÁSA - KONTROL!!!! TRANSZFORMÁLÁS - KONTROL!!!!

6 1. probléma: a PCR termék nem vagy gyatrán emészthető Restrikciós hasító hely bevezetése az amplifikáló primerekbe Az enzimek eltérő mértékben hatékonyak a DNS végéhez közel! Megoldás: megfelelő számú extra nukleotid az oligó 5 végén Fermentas 2010/11 katalógus, 171/74(FD) oldal Alternatíva: 4-6 extra nukleotid (70%AT) az oligó 5 végén *16h

7 PCR termékek emésztése közvetlenül a PCR reakcióelegyben PCR reaction mixture 10 µl (0,1-0,5 µg) max 10X buffer (recommended) 2 µl!!! Restriction enzyme 1-2 µl (10-20 units) Water, nuclease free to 30 µl final volume Fermentas 2010/11 katalógus, 160 oldal

8 Az emésztett PCR termék nem vagy kis hatásfokkal klónozható Troubleshooting: Molecular Cloning A hőstabil DNS polimerázoknak nem nulla az aktivitása 37 C-on!! Az 5' túlnyúló végek részben vagy egészben feltöltődhetnek! EcoRI G^AATTC 5 túlnyúló: + Taq polimeráz: 5 - G 3 - CTTAA GAATT- 3' 3 - CTTAA- 5 A PCR termék emésztése után minden esetben tisztítsuk meg a terméket (gél-izolálás, ultraszűrés), hogy eltávolítsuk az emésztés után keletkező rövid DNS darabokat, ezek interferálnak a következő ligálási lépéssel!!

9 2. probléma: a polilinker (MCS) nem emésztődik hatékonyan Közeli hasítóhelyek esetén jelentkezik NEM MINDEGY AZ EMÉSZTÉSI SORREND!! NEM MINDEN PÁROSÍTÁS MŰKÖDIK!! Fermentas 2010/11 katalógus, 172 oldal Troubleshooting: Molecular Cloning

10 Kettős/többes emésztés: puffer kompatibilitás FastDigest TM enzimek használata Egy puffer, két hőmérséklet, 5-10 perc!!! Troubleshooting: Molecular Cloning Fermentas 2008/09 katalógus, 44 oldal

11 probléma: a plazmid vektor nem, vagy csak részlegesen emésztődik OK: Az enzim részben, vagy teljesen gátolt a metiláció miatt dam és dcm metiláció, továbbiak: EcoKI, EcoBI, CpG G(m6A)TC C(m5C)AGG Dam Methylase Dcm Methylase BclI: TGATCA teljes gátlás BamHI: GGATCC nincs hatás Bsp143I(Sau3AI): GATC nincs hatás MboI: GATC teljes gátlás DpnI: G(m6)ATC nem vágja a nem metilált DNS-t! Megoldás: E.coli GM2163 használata (dam - dcm - )

12 probléma: a plazmid vektor nem, vagy csak részlegesen emésztődik Fermentas 2011/12 katalógus, oldal + minden egyes enzim leírása

13 probléma: a DNS szubsztrát nem emésztődik OK: az enzim nem aktív a felhasználó DNS-én MEGOLDÁS: tesztelje az enzimet Lambda DNS-en (Cat No: SD0029)

14 probléma: Star aktivitás (a specifitás relaxációja) 1µg Lambda DNA + EcoRI A star aktivitás nem teljesen aspecifikus! BamHI: GGATCC star activity: NGATCC GGNTCC GPuATCC

15 probléma: Star aktivitás (a specifitás relaxációja) Troubleshooting: Molecular Cloning OK: - A szükségesnél hosszabb inkubáció - A szükségesnél nagyobb enzimkoncentráció -Magas glicerin koncentráció -Szerves oldószerek (EtOH, DMSO) -Alacsony ionerősség -Szuboptimális ph MEGOLDÁS: - Csak a szükséges mennyiségű enzim, rövidebb inkubációs idő - 5%-nál nem több glicerin - Kellően tiszta DNS szubsztrát - Az enzimhez ajánlott puffer - A leggyakoribb ok: hosszú, overnight inkubálás!!! - Mg helyett Mn/Co

16 A vektor és az inzert is emésztődik, mégsem kapjuk meg a kívánt klónt. (a restrikciós enzim minősége!)

17 probléma: UV hatás A DNS károsodik UV hatására (fotózás, gélből történő kivágás során Megelőzés: - Hosszú hullámhosszt használni a megvilágításhoz (360 nm) - Rövid hullámhossz használata lehetőleg csak néhány másodpercig - DarkReader és EtBr-alternatív DNS festék használta

18 DarkReader: látható fényű transzilluminátor

19 probléma: UV hatás A klónozás hatékonysága az UV kitettség függvényében Kék fény idő

20 EtBr-alternatív DNS festékek 1% agarose, 1xTAE, GRGreen in-gel staining, gel thickness: ~5 mm, comb: 3 mm wide Loading: Fermentas 1kb Plus (SM1331), 10 μl/slot, a serial 2-fold dillution Exposition: DarkReader, FlashGel camera (LONZA) 500 bp ng total/10 μl ~ng of the 500 bp band

21 8. probléma: DNS mérés/gél-extrakciós kitek Két változat létezik: Spin-column vagy szilika gyöngyös Probléma: a szilika törmelék és a binding puffer maradvány zavarja az OD 260 mérést Megoldás: határozza meg a DNS koncentrációt gélen

22 DNS meghatározás gélen Mindig azonos loading dye-t használjon a markerhez és mintához Mindig a legközelebbi méretű fragmenteket hasonlítsa össze Lehetőleg használjon hígítási sorokat a mintából és markerből

23 DNS meghatározás gélen Pl. Mass Ruler Express

24 probléma: DNS végek nem hatékony blunt-olása Használja a megfelelő blunt-olási stratégiát: 5'- NNN 5'- NNNNNNN -3' 3'- NNNNNNN -5' 3'- NNN X 5' overhang 3' overhang Ajánlott enzimek: T4 DNA Polymerase, Klenow, (S1 nuclease) ne használjon Klenow exo minus-t Kevésbé hatékony: Pfu vagy egyéb exonukleáz aktivitással rendelkező enzimek Mindig tegyen dntp-t reakcióelegybe! Fast End-repair kit (5 perc bluntolás és foszforilálás!

25 probléma: T4 ligáz inhibítor jelenléte magas sókoncentráció (150 mm NaCl, 200mM KCl), Cs +, Li +, NH 4 + (NH 4+ pl. a Pfu/Taq pufferben!) 1mM Spermidine EDTA, fehérjék, phenol, ethanol silica matrix (spin columns!!) 5%-nál nagyobb glicerin koncentráció datp

26 probléma: a T4 ligáz nem működik A ligáz aktív volt mikor megkaptuk, de néhány használat után már nem működik Lehetséges ok: a mélyhűtő túlhűt (-30 O C alá)! A T4 ligáz érzékeny a fagyasztási/kiolvasztási ciklusokra!! A kiszerelésben lévő glicerin -30 O C alatt már nem véd fagyás ellen. 3 fagyasztási/kiolvasztási ciklus drámai aktivitáscsökkenéshez vezet!!

27 probléma: a T4 ligáz nem működik Lehetséges ok: túl sok ligáz használta, autoinhibíció! - Ne használjon az ajánlottnál több ligázt!! ng vektor Weiss Units T4 DNS ligáz (sticky ends) Weiss Units T4 DNA Ligáz (blunt ends) végtérfogat 20µl

28 T4 DNS Ligáz reakció Példa egy ligálási reakcióra: 1. Nuclease free water final volume 20 µl ng Plasmid 3. Molar Ratio of Vector: Insert = 1:3/1: µl 10x ligation buffer for T4 DNA Ligase 5. 2 µl PEG % for blunt end ligations Weiss Units T4 DNA Ligase (sticky ends) Weiss Units T4 DNA Ligase (blunt ends) Incubate 10 min-2h at 22 C. Very seldom overnight incubation gives better results

29 T4 DNS Ligáz reakció Hogyan számoljuk ki a moláris arányát a ligálható végeknek (pmol) Példa: Vektor: 6kb (20ng); Inzert : 1kb; Vektor: Inzert arány 1:3 20ng Vektor x 1kb inzert x 3 6kb vektor 1 = 10ng Inzert

30 Ligálási hatékonyság vizsgálata Használjon SDS tartalmú loading dye-t Melegítse a mintát 65 O C-on 10 percig Analysis of ligation reaction products on agarose gel. M - GeneRuler DNA Ladder Mix. 1 mixture of DNA insert and vector. 2 after the ligation, sample prepared with 6X Loading Dye Solution M 3 mixture of DNA insert and vector after the ligation, sample prepared with 6X Loading Dye & SDS Solution. (R1151) 1%SDS in a 6x loading dye

31 A ligáz aktivitásának ellenőrzése Lambda Hind III Marker digested 0.5 µg 2. Lambda Hind III Marker ligated 0.5 µg 20 µl from ligation reaction 500ng Lambda Hind III digested DNA 1 Unit T4 DNA Ligase 2 µl 10x T4 DNA Ligase buffer 20 µl reaction volume 30 min 22 C (RT)

32 probléma: kevés a transzformáns Tesztelje a kompetens sejtek hatékonyságát: 0.1 ng supercoiled vektor (pl. puc19) 100 kolóniát kell eredményezzen! A hatékonyság legalább 1x10 6 /µg kell legyen

33 probléma: kevés a transzformáns A ligáz DNS kötő fehérje!! Olyan nagy DNS/fehérje komplexek jöhetnek létre, amik nem transzformálhatók! Transzformálás előtt inaktiválja a ligázt hővel (10 perc, 65 O C) Ne hőinaktiváljon, ha PEG van a pufferben (pl. gyorsligáló kitek)

34 14. probléma: kevés a transzformáns Lehetséges ok: túl sok ligálási elegyet használt Ne használjon a kompetens sejtek térfogata 10%-ánál több ligálási elegyet kémiai kompetens sejtek esetében Ne használjon µl ligálási elegynál többet 50 µl elektrokompetens sejthez

35 Direkt-szelekciós vektorok használata

36 Megfelelő kontrolok használta Nincs vektor, de minden más van Nincs transzformáns Működik az antibiotikum, nincs fertőzés

37 Megfelelő kontrolok használta Emésztett vektor transzformálása Nincs vagy kevés a transzformáns A vektor megfelelően volt emésztve

38 Megfelelő kontrolok használta Az emésztett és ligált vektor transzformálása Kompatibilis végek esetében van transzformáns: a végek intaktak, működik a ligáz Nem komptibilis végek esetén nincs vagy kevés a transzformáns

39 Megfelelő kontrolok használta P P A foszfatáz htékonyságának tesztelése Nincs vagy kevés trnszformáns 1. pl. FastAP kezelés 2. ligálás

40 Általános probláma Jelenség: kevés transzformáns, nincs vagy sérült az inzert OK: az inzertet nem tolerálja az E. coli pl. túl erős promóter, toxikus géntermék, invert repeat Nincs áltlános megoldás, de segíthet: Jól szabályozható promóter hsználta Alacsony kópiaszámú vektor használta Alacsony inkubációs hőmérséklet

41 Köszönöm a figyelmet

42 Focus Restriction Digest LO tested enzymes and exclude any possibility of endo-, exonuclease and phosphatase contamination in enzyme preparations