BIOTECHNOLÓGIA SVM II. Mikroorganizmusok azonosítása környezeti mintákból molekuláris ökológiai technikák segítségével

Átírás

1 BIOTECHNOLÓGIA SVM II. Mikroorganizmusok azonosítása környezeti mintákból molekuláris ökológiai technikák segítségével BEVEZETÉS Az 1970-es évek elejéig a mikrobiológusok túlnyomó többsége reménytelen, ha nem lehetetlen vállalkozásnak tartotta egy evolúciós alapokon nyugvó prokarióta rendszertan kidolgozását. Mindezek következtében a mikrobiológia nem szervezıdhetett egy természetes, származástanilag helyes rendszertan köré. Ennek a rendkívül fontos evolúciós alapnak a hiánya komoly gátat jelentett a mikrobiológia fejlıdésében. Az 1950-es évektıl már kihasználták azt, hogy egyes molekulák szekvenciái a hordozó fajok evolúciós kapcsolatait tükrözik. A prokarióta mikrobiológia tudománya azonban további évtizedeket várt, mielıtt a molekuláris szekvencia analízisben rejlı lehetıséget felismerte volna. A mai, modern prokarióta rendszertan (és egyre fokozódó mértékben az eukarióta rendszertan is) nagyrészt a 16S rrns szekvenciák összehasonlításán, analízisén alapul. A hagyományos mikrobiológiai technikákkal (izolálás, tiszta tenyészet fenntartása laboratóriumban) tanulmányozható prokarióták aránya a vizsgált környezeti mintáktól függıen 0.01 és 15 % között mozog, a teljes prokarióta élıvilágra kivetítve ez az érték % lehet. A környezeti mikrobiológia, a prokarióták ökológiája gyakorlatilag kizárólag a 16S rrns szekvenciákon alapuló technikákkal tanulmányozható a teljesség igényének feladása nélkül. Az élı szervezetekben felhalmozott szén mennyiségét 1000 x g -ra becsülik. Ennek mintegy felét, x g szenet a prokarióták és archeák tartalmazzák. A teljes biomassza közel felét teszik ki azok a prokarióták, melyeket ma kizárólag a molekuláris ökológia módszereivel lehet vizsgálni. A talajban található prokarióták átlagos generációs idejét 900 napra becsülik, melynek fı oka valószínőleg a megszerezhetı tápanyag korlátozott mennyisége. Az ilyen körülményekhez adaptálódott mikroorganizmusok túlnyomó többsége képtelen a laboratóriumi körülmények között nagy bıségben elé dobott tápanyag hasznosítására, azaz a számottevıen gyorsabb növekedésre. Az ilyen prokarióták hagyományos módszerekkel történı vizsgálata eleve lehetetlen. 1. A 16S rrns technikák alkalmazási területei - Molekuláris rendszertan. - Új izolátumok gyors meghatározása, rendszertani besorolása.* - Nem tenyészthetı baktériumok azonosítása, rendszertani helyének meghatározása. - Molekuláris ökológia*: Ismert baktériumcsoportok kimutatása a környezeti mintákban. In situ PCR és in situ hibridizációs technikákkal jól tanulmányozható a környezeti mintákban az egyes (köztük a laborban nem tenyészthetı) baktériumcsoportok aránya, elhelyezkedése, környezeti stresszekre adott válaszreakciója, a populációk arányának változása, stb. A 16S rrns technikákkal megszerzett információt gyakran kiegészítik egyéb génekre specifikus PCR-el. A legtöbb esetben valamely baktériumcsoportra jellemzı, erısen konzervált kulcsenzim génjét használják. Ez a technika a rendszertani információ mellett arra is választ ad, hogy egy adott életmódot folytató baktériumcsoport jelen van-e a vizsgált mintában, s ha igen, milyen mennyiségben. A PCR termékek szekvencia analízise sokszor a 16S rrns szekvenciákhoz hasonlóan alkalmazható fejlıdéstani kapcsolatok meghatározására is. * a csillaggal jelölt alkalmazásokat fogjuk bemutatni a gyakorlaton

2 2. ALKALMAZOTT ELJÁRÁSOK 1. Templát preparálás A 16S rrns technikák során a legtöbb esetben a kódoló DNS szakaszról készítenek PCR terméket, és ennek a terméknek a szekvenciáját határozzák meg. A másik lehetıség reverz PCR segítségével közvetlenül a 16S rrns-rıl készíteni PCR terméket. Az elıbbi, általánosan alkalmazott esetben prokarióta genomi DNS-t (gdns-t) kell izolálni, míg az utóbbi esetben teljes prokarióta RNS izolálására van szükség (amit a mindenütt jelenlévı, rendkívül stabil RNáz enzimek megnehezítenek). A templát preparálása során még nincs szükség a következı lépésnél leírt különlegesen tiszta munkára. Ennek az oka, hogy a végeredményként elıálló gdns preparátumot több nagyságrenddel hígítjuk mielıtt PCR templátként alkalmazzuk és így az esetlegesen belekerülı szennyezı DNS annyira kihígul, hogy nem okoz problémát S rrns specifikus PCR Kivitelezése során rendkívül nagy figyelmet kell fordítani a tiszta munkára. A PCR ciklus során alkalmazott denaturációs lépés (94-96 C) a legtöbb baktériumsejtet megöli, és az így felszabaduló baktérium gdns-rıl képzıdı PCR termék hamis eredményekhez vezethet. A legtöbb PCR során olyan primereket alkalmaznak, melyek rendkívül specifikusak a vizsgált baktériumra, vagy baktériumok egy kisebb csoportjára. A 16S rrns specifikus primerek a megvizsgált összes baktériumra nézve univerzálisak, tehát bármilyen baktérium bekerülése a reakcióelegybe hamis eredményhez vezet(het). Az alkalmazott PCR primerek (f27 [5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'] és r1492 [5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3']) tehát az ismert bakteriális világra nézve univerzálisak. Ez nem jelenti azt azonban, hogy különbözı baktériumok DNS-ének keverékébıl álló templát esetén ne kedveznének bizonyos fokig egyik vagy másik

3 templátnak. Ez egyben azt is jelenti, hogy nem minden esetben igaz az a feltételezés, hogy a különbözı PCR termékek aránya egy az egyben tükrözi a különbözı baktériumfajok/törzsek arányát a vizsgált mintában. A PCR termékek mérete bp. Escherichia coli esetén ez pontosan 1496 bp, míg a teljes 16S rrns gén 1542 bp hosszú. Egy tipikus PCR során néhány minta mellett egy pozitív és egy negatív kontroll elvégzésére is szükség van. A pozitív kontrollhoz valamilyen korábban készített és már igazoltan tiszta gdns preparátumot, míg a negatív kontrollhoz steril desztillált vizet használunk templátként. A GYAKORLAT CÉLJA ÉS MENETE A 16S rrns az élıvilágban univerzálisan elıfordul, melynek génjében megnyilvánuló fajok közötti különbségek kimutatásával lehetıvé válik ismeretlen baktériumokat tartalmazó mintákból különbözı baktériumok kimutatása. A gyakorlat során a gyakorlat elsı részében izolált baktériumtelepekbıl tervezünk meghatározni két baktériumfajt - a Thiocapsa roseopersicinát és a Methylococcus capsulatust - 16S rrns-technika felhasználásával. A két baktériumfaj 16S rrns génjeiben DNS-szinten megnyilvánuló különbségeket PCR-amplifikációt követı restrikciós emésztéssel (RFLP) (TaqI) mutatjuk ki. A gyakorlat menete I. Genomi DNS tisztítás baktériumkultúrákból Ellenırzés 1% agarózgélen futtatással. 1. Kb. 1ml baktériumkultúrát koncentráljunk össze egy 1.5 ml-es Eppendorf csıben. 2. A baktériumokat szuszpendáljuk fel 500 µl SET pufferben (20% szacharóz, 50 mm EDTA, 50 mm Tris-Cl ph 8.0). 3. Adjunk hozzá 50 µl 10 % SDS-t és 6 µl 20 mg/ml-es proteináz K-t. 60 perc inkubáció C-on. 4. A feltárt baktériumszuszpenziót extraháljuk 500 µl Fenol:Kloroform:Izoamilalkohol (25:24:1) keverékkel (adjunk az elegyhez 250 µl fenolt és 250 µl Kloroform-izoamil alkohol 24:1 keveréket). Rázzuk alaposan össze, centrifugáljuk minimum x g erıvel 5 percig. 5. A tiszta felülúszó tartalmazza a DNS-t. 6. A tiszta felülúszót 500 µl Kloroform:Izoamilalkohol (24:1) keverékével keverjük össze, centrifugáljuk 2 percig. Ez a lépés a vizes fázisban nyomokban jelen maradt fenol eltávolítására szolgál. 7. A DNS kicsapása: a tiszta felülúszót keverjük össze 50 µl 3M nátrium-acetáttal és 500 µl izopropanollal. Keverés: A csı fel-le fordításával. Centrifugáljuk minimum x g erıvel 20 percig. 8. Óvatosan, hogy a csapadékot ne veszítsük el, öntsük le az alkoholt a DNS-rıl, töltsünk rá 1 ml jéghideg 70 %-os etanolt (vigyázzunk, hogy a centrifugacsı falára tapadt csapadékot ne lazítsuk fel) és centrifugáljuk az elıbbi sebességen újabb 5 percig. 9. Öntsük le az alkoholt a csapadékról és szárítsuk: nyitott tetıvel centrifugálva, 5 percig. A DNS-t ha túlszárítjuk, rendkívül nehéz feloldani! 10. Oldjuk fel a DNS csapadékot 20 µl TE pufferben. A DNS oldódását a csı aljának pöcögtetésével lehet segíteni. Az RNS eltávolítására adjunk hozzá 2 µl 100 µg/ml koncentrációjú DNáz mentes RNázA-t, inkubáljuk 37 C-on 10 percig.

4 11. Agaróz gélen, ismert mennyiségő marker mellett futtassunk meg 10 µl-t és határozzuk meg a DNS koncentrációját. Ellenırzés: 1% agarózgélen futtatással. Reakcióelegy: a mintából 5 ul-t kipipettázunk, 15 ul desztvizet és 4 ul DNSfestéket adunk hozzá, majd gélre visszük II. A 16S rrns-t kódoló DNS-szakasz PCR-amplifikációja génspecifikus primerek használatával. PCR-amplifikációhoz: 5 ul 10x higított templát DNS 5-5 ul primer (f27, r1492) 2 ul 10x puffer 3 ul dntp mix (2.5 mm) 0.5 ul Taq polimeráz enzim 30 ciklus kb. 3 óra 95 C 5 perc C 1 perc C 1 perc C 1 perc 30x Ellenırzés 1% agarózgélen futtatással. reakcióelegy: 5 ul amplifikátum + 15 ul desztvíz + 4 ul DNS-festék III. Az amplifikált DNS-szakaszok TaqI enzimmel történı restrikciós emésztése. 14 ul PCR-termék 0.5 ul TaqI enzim (2.5 U/ul) 1 ul 10x puffer 5 ul H2O 65C 1 óra Ellenırzés 2% agarózgélen futtatással. reakcióelegy: a 20 ul reakcióelegyhez 4 ul DNS-festéket adunk és gélre visszük Megjegyzés: A PCR terméket tisztítás nélkül használjuk. A PCR reakcióhoz használt puffer így 75%-os koncentrációban (14 µl PCR termék 20 µl-ben) jelen lesz az emésztési elegyben. A TaqI enzim által igényelt puffer összetétele minimális, elhanyagolható különbséget mutat a PCR pufferétıl, így azt is a normális végkoncentráció 50%-án alkalmazva (1 µl 10x tömény puffer 20 µl végtérfogatban) a TaqI enzim számára megfelelı pufferhez jutunk. Más enzimek alkalmazásakor szükség lehet a PCR termék tisztítására (a PCR puffer összetevıitıl megszabadulandó).

5 IV. Az eredmények kiértékelése. A PCR-reakció és a DNS-izoláció termékeit az elızetesen már elkészített 1% agarózgélen ellenırizzük. (A PCR-termékek várható mérete 1.5 kb, az ıssz-dns kb 50 kb). A fragmentek méreteit molekulasúly marker melletti futtatással állapítjuk meg. Ezt követıen meghatározzuk a különbözı DNS-fragmentek méretét "manuálisan" illetve számítógépprogram segítségével. A kapott méreteket összevetjük a számítógépes DNSszekvencia adatbankból letöltött, és egy speciális program segítségével - szintén TaqI enzimmel - "virtuálisan megemésztett" fragmentméretekkel. E lépés során a számítógépes program megkeresi az adott szekvenciákban a TaqI enzim hasítóhelyeit, melynek eredményeképp megkapjuk az adott szekvencia TaqI-fragment méreteit. Amennyiben ez a fragmentmintázat megegyezik valamely, a kísérletek során általunk kapott mintázattal, kijelenthetjük, hogy a baktériumkultúrát azonosítottuk. Megjegyzésként fontos elmondani, hogy a legbiztosabb eredményt természetesen a PCRfragmentek szekvencia analízise, illetve e szekvenciák alapján történı homológiakeresés adná, de egyrészt erre a gyakorlat keretei között nincsen lehetıségünk, másrészt a baktériumtörzsek RFLP-módszeres azonosítása gyorsabb és sokszor elegendı információt szolgáltat.

6 Jegyzıkönyv SVM, Biotechnológiai Tanszék I félév 1. Dátum: 2. Név: 3. Csoportszám (párok): 16S rrns vizsgálat céljának tömör összefoglalása (mi a gyakorlat célja?): Azonosítandó baktériumtörzsek, alkalmazott módszerek felsorolása: Eredmények összefoglalása, következtetések: (i.: a gélképek alapján: hogyan sikerültek az egyes lépések: genomi DNS izolálás, PCR, emésztés? ii.: mennyire volt összevethetı a kapott mintázat az adatbázissal a 2 baktérium esetén?, iii.: sikerült-e azonosítanunk a 2 baktériumot? miért?, iv.: egyéni meglátások a gyakorlat eredményét illetıen)

7 Ábrák helye: 1. DNS-tisztítás kevert kultúrából 2. 16S rrns-specifikus PCR 3. RFLP analízis (TaqI emésztés)