Tumorprogresszió és előrejelzése Dr. Győrffy Balázs MAGAS DÓZISÚ C-VITAMIN KEMOTERÁPIA HELYETT. Sejtproliferációt gátolják

Átírás

1 . Gyógyszerek és hatásmechanizmusuk Tumorprogresszió és előrejelzése Dr. Győrffy Balázs 2. Kemorezisztencia mechanizmusai 3. Rezisztencia vizsgálata MAGAS DÓZISÚ C-VITAMIN KEMOTERÁPIA HELYETT Sejtproliferációt gátolják Szelektivitás: tumor jobban osztódik Toxikusak: gyomor-bél epithelium, haj folliculusok, csontvelő Alkilezőszerek kovalens keresztkötések Antibiotikumok interkaláció DNS inaktiválás Antimetabolitok purin v. pirimidinszintézis gátlása nukelotid anyagcsere Vinca-alkaloidok mitotikusorsó kialakulásának gátlása Topoizomeráz-gátlók DNS szerkezet átrendezése replikációs fehérjék Harci gázból Kovalens keresztkötések Mustárnitrogén Platinavegyületek Cyclophosphamid Nitrozouerák Estramustin Chlorambucil Alkilszulfonátok Diazometánok Melphalan

2 Interkaláció gátolja RNS-képződést Actinomycin-D Antraciklinek: Doxorubicin Mitoxantron Bleomycin Mitomycin Folsav-antagonisták Methotrexat Antipirimidinek 5-Fluorouracil Cytarabin Antipurinok Mercaptopurin Azathioprin Thioguanin Pentostatin Camptothecin-származékok: Irinotecan, TOP Antraciklinek Etopozid: TOP2 Mitotikus orsó gátlása S-fázis-specifikus Vinca-alkaloidok Vincristin Vinblastin Taxánok Paclitaxel Docetaxel folsav methotrexat tetrahidrofolsav purinok pirimidinek hydroxyurea guanin adenin timin citozin 5-FU mercaptopurin nukleotidok thioguanin alkilálószerek DNS RNS mitotikus gátlók antibiotikumok,5-/ terhesség Hatások a gyereken: db 8 hónapnál idősebb gyerek Kardiológia és neurológiai vizsgálat Pszichológia Eredmény: Eredmények 5-95 percentilis között IQ: 34. hétnél később születettek: normális Koraszülött: alacsonyabb IQ Anthracyklinek: - De: kevés adat, csak 22 hónap utánkövetés, 75% koraszülött mitózis 2

3 lg(tumorsejtek) progresszió (PD) cm 3 nincs változás részleges remisszió (PR) (5%-os tumor csökkenés) sejt évek hónapok hetek teljes remisszió (CR) (tumor nem kimutatható) lg(idő) TÍPUSOK: I. Farmakológiai tényezők - adagolás - farmakokinetika plazmában - tumor elhelyezkedése - hozzáférhetőség II. Celluláris tényezők Rezisztens sejtek más gyógyszerekkel szemben is rezisztensek: multidrug resistance: MDR -> egy tényező leküzdése eredménytelen Mechanizmusok átkapcsolnak / függenek egymástól Tumor progresszióval arányos átmérő (cm) sejtszám. IC gyógyszer CC csökkentés 2 9, 6 diagnózis halál 2. Gyógyszer célmolekula interakció változása 3. Celluláris válasz változása, 3, idő é v e k hónapok hetek 3

4 . 2. transzportrendszerek metabolizmus Célmolekula.. Transzport rendszerek.2. Glutathion.3. Metabolizmus és subcelluláris disztribúció 3. sejtciklus DNS hibajavítás apoptózis Csökkent influx Kevés adat Passzív diffúzió Import fehérje Fokozott efflux -PGP -MRP -LRP -BCRP MDR gén -> P-glycoprotein (P-gp) ATP-kötő domén Rezisztencia mi ellen: antracyklin antibiotikumok, alkaloidák, taxánok MDR szintje: p53, EGR, ras, raf, RARα/β, c- fos, c-jun, PKC, PKA, NF-kB MDR sirna: sejtvonalakban szenzitizál EPP85-8 PGP IHC EPP85-8RDB PGP modulátorok I. generáció verapamil, cyclosporin A II. generáció elsőgenerációs modulátorokból dexverapamil, valspodar, biricodar III. generáció pumpa direkt gátlása tariquidar(antraciklin), laniquidar, ONT-93 4

5 Multidrug-Resistance-associated Proteins Glutathion-konjugált molekulák 8 tag: MRP: vincristin, vinblastin, doxorubicin, etoposid, mitoxantron, arzén MRP2: MRP + cisplatin MRP4: anti-hiv gyógyszerekkel szembeni rez. MRP8: 5-FU Lung resistance-related protein Szubsztrátok: MRP+P-gp+melphalan, platinavegyületek LRP mérése prediktív: Heretumor Emlőrák Szarkómák Breast Cancer Resistance-related Protein =MXR, ABCP, ABCG2 Dimerizálnia kell Felülexpresszió Őssejtdifferenciáció Hatások Inaktiváció konjugációval Transzporter rendszerek aktiválása Szignáltranszdukció és repair útvonalak aktiválása Rezisztencia: alkilálószerek, cisplatin Rezisztencia: mitoxantron, topotecan, anthracyklinek, methotrexat, etoposid GSTP (GST izoenzim): platinum detoxifikáció Ile5Val és Ala4Val missensemutációk -> csökkent GSTP aktivitás -> neuropáthia oxaliplatin kezelés hatására (Lecomte, CCR, 26) 5-FU: DPD Irinotecan -> SN38 -> detoxifikálja: UDP-glucuronosyltransferase (UGTA) UGTATATA-banTA ismétlések száma csökkent expresszió és aktivitás UGTA*28allélrehomozigóták -> nincs lebontás -> dózisfüggő életveszélyes neutropenia (Hoskins, JNCI, 27) 25: FDA 5

6 IC5 MEGHATÁROZÁSA SEJTVONALAKBAN EPP85-8P kemoszenzitív IC 5 =.58 ng/ml EPP85-8RNOV MDR IC 5 = 3.26 ng/ml Mitoxantron [ng/ml] REZISZTENCIA VIZSGÁLATA INVITRO cell survival, % of control mitoxantrone, ng/ml EPP85-8P EPP85-8RNOV SI meghatározása (MDA-23) REZISZTENCIA-MINTÁZAT MDA-23 6 % 66% 33% % R M S SI Cyclophosphamid MTX 5-FU Cisplatine Topotecan Etoposid Paclitaxe Vinblastine Doxorubicine Mitoxantrone Mitomycin C C C2 C3 drug concentration rezisztencia 3 sejtvonalból. 3 sejtvonal / 2 gyógyszer MDR gének (4+ gyógyszer) Affy ID Gén szimbólum Gén neve # gyógyszerek Vinblastin Topotecan Paclitaxel MTX Mitoxantron Mitomycin C Etoposide Doxorubicin Cyclophosphamid Cisplatin 5-FU 22342_s_at TRIM2 tripartite motif-containing 2 8 X X X X X X X X 26632_s_at APOBEC3B apolipoprotein B mrna editing enzyme 7 X X X X X X X 2. Transzkriptomikus adatok: HGU33 chips 2276_at BIRC2 baculoviral IAP repeat-containing 2 6 X X X X X X 29277_at TFPI2 tissue factor pathway inhibitor 2 6 X X X X X X 2277_at Corf38 chromosome open reading frame 38 6 X X X X X X 234_at ADD3 adducin 3 (gamma) 5 X X X X X 263_s_at IGFBP7 insulin-like growth factor binding protein 7 5 X X X X X 3. Bioinformatika: Rezisztens vs. szenzitív sejtvonalak Gyógyszerek egymástól függetlenül 2858_s_at PRG proteoglycan, secretory granule 5 X X X X X 22628_s_at SERPINE serine proteinase inhibitor, clade E, member 5 X X X X X 22887_s_at DDIT4 DNA-damage-inducible transcript 4 5 X X X X X 2388_at COX7 COX7 homolog 5 X X X X X 2464_at SERPINB2 serine proteinase inhibitor, clade B, member 2 5 X X X X X 24682_at LTBP2 latent transforming growth factor beta binding 5 X X X X X protein _at AOX aldehyde oxidase 5 X X X X X 253_at RAGE renal tumor antigen 5 X X X X X 28647_at FDFT farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 5 X X X X X 294_at MAGED melanoma antigen, family D, 5 X X X X X 29278_s_at TFPI2 tissue factor pathway inhibitor 2 5 X X X X X 2538_s_at X X X X X 23258_at TFPI tissue factor pathway inhibitor 5 X X X X X 24247_s_at DKK3 dickkopf homolog 3 (Xenopus laevis) 5 X X X X X 22922_at GPSM2 G-protein signalling modulator 2 5 X X X X X 6

7 LOOCV eredmény ALKALMAZHATÓSÁG BETEGEKEN Helyes előrejelzés Előrejelzés helytelen rezisztens -ben Előrejelzés helytelen szenzitív -ben Osztályozás nem elérhető Fel lehet-e sejtvonalakból nyert génexpressziós adatokat valódi betegekben terápiás válasz és prognózis előrejelzésére használni? 87.4 % : maximális rezisztencia : maximális szenzitivitás EPG257 DOXORUBICINNÖVEKVŐ DÓZISÁVAL KEZELVE Eredeti sejtvonal Rezisztens sejtvonal FELHASZNÁLT SEJTVONALAK Tumor Cell line Origin mrna expression Relative fold resistance to Selecting agent agent PGP MRP BCRP Reference fold MCF7 MCF7-RADR Breast 92 Doxorubicin ++ Fairchild et al. MDA-MB-23 MDA-MB- 23RNOV Breast 93 Mitoxantron +++ Ross et al. HT29 HT29RDB Colon Daunorubicin + + Serra unpub. HT29RNOV 45 Mitoxantron + Serra unpub. EPP85-8 EPP-8RDB Pancreatic 29 Daunorubicin ++ +/- Serra unpub. EPP-8RNOV 4 Mitoxantron +/- + Serra unpub. EPG-257 EPG-257RDB Gastric 857 Daunorubicin ++ Ross et al. EPG-257RNOV 457 Mitoxantron + Ross et al. érzékeny: IC5 =.3 µg /ml MDR: IC5 =.72 µg/ml REZISZTENCIA GÉNLISTÁK A: doxorubicin rezisztencia B: novantron rezisztencia A B cell viability HT29PAR HT29RDB cell viability concentration daunorubicin (µg/ml).2 HT29PAR HT29RNOV.... concentration novantron (µg/ml) 7

8 TÚLÉLÉS 44 emlőtumor ismert túlélés adatok doxorubicin monotherápia betegek osztályozása mint rezisztens vagy szenzitív Probability Log-rank test (Cox-Mantel) p=.33.2 Censored Resistant.8 Sensitive Survival m onths TOP Antimetabolitok: 5-FU Capecitabine(po prodrug) Metothrexat +Leukovorin Capecitabine FBAL CES 5 DFCR CDD 5 DFUR DPD mutáció = toxicitás DHP FUH 2 TS expresszió túlélés DPD TP FdUMP TK FUdR 5-FU UP 5-FUR OPRT dtmp TS dump UK dtdp dttp FH 2 MTHFR metilén FH 4 FdUDP RNR DHFR FH 4 FUMP FUDP FUTP DNS szintézis MTX Leukovorin MTHFR aktivitás 5-FU szenzitivitás FdUTP DNS szakadás RNS szakadás 5 DFCR = 5 deoxy-5-fluorocytidine, 5 DFUR = 3 deoxy-5-fluorouridine, 5-FUR = 5-fluorouridine, CDD = cytosine deaminase, CES = carboxylesterase, DHP = dihydropyrimidinase, DPD = dihydropyrimidine dehydrogenase, FBAL = fluoro-b-alanine, FDUTP = fluorodeoxyuracil triphosphate, FUH 2 = dihydro-5- fluorouracil, MTHFR = methylenetetrahydrofolatereductase, OPRT = uridine monophosphatesynthetase, RNR = ribonucleotidereductase, TK = thymidinekinase, TP = thymidine phosphorylase, TS = thymidylate synthetase, UK = uridine-cytidine kinase 2, UP = uridinephosphorylase TS (thymidilate synthetase) expresszió túlélés tandem repeat polimorfizmusok TS promoteren 6 bp deléció: mrns stabilitás DPD (dihydropyrimidine dehydrogenase) populáció 3-5%-a részben,.2% teljesen DPD hiányos toxicitás mérése nem standardizált prediktív érték bizonytalan MTHFR (methylenetetrahydrofolate reductase) C677T és A298C polimorfizmusok csökkentik az expressziót ha DNS károsodás -> DNS hibajavító képesség -> apoptózis 3.. DNS hibajavítás 3.2. Sejtciklus 3.3. Apoptotikus utak DNS hibajavító mechanizmusok fokozott expressziója: alkilálószerek, platinaszármazékok, topoizomeráz inhibitorok 3... Nucleotide excision repair: NER Base excision repair: BER Mismatch repair: MMR 8

9 Részlépések (NEM/BER/MMR):. Hiba felismerése 2. Splicing 3. Új bázisok beillesztése 4. A javított szálak ligációja Proteinkomplex: nucleotide excision repairosome NER gének: XPA, XPB, XPD, ERCC Cisplatin citotoxicitás fokozása NER blokkolásával XPD protein mennyisége alkilálószerekkel szembeni rezisztencia Bázisok kivágása után: AP-endonukleáz javít (AP: apurinic/ apyrimidinic) APE/Ref: gliomákrezisztenciája alkiklálószerekkel szemben MMR: posztreplikatívdns hibajavítás a genomikus stabilitás fenntartásában MMR kiesése cisplatin rezisztencia DNS replikáció teljes Metafázis: kromoszómák kapcsolódása spindle mikrotubulusokhoz Fázis-specifikus gyógyszerek pld: camptothecin: S-fázis specifikus Replikációs ~: nukleotid depléció DNS hiba Okazaki fragmensek összekapcsolása DNS szintetizáló rendszer Növekedési szignálok jelenléte DNS hibátlan Kombinációs kemoterápia: sejtcikuls-mediált gyógyszerrezisztencia pld: taxánok: M-fázis sepcifikus cisplatin-> paclitaxel: antagonizmus paclitaxel-> cisplatin: szinergizmus 9

10 KI-67 G-ban nincs, G, S, G2, M-ben van -> proliferációs marker Prognosztikus érték: NHL, multiple myeloma szarkómák KI67 IHC EPP85-8 EPP85-8RDb EPP85-8RDB Kromoszómális instabilitás =CIN, =aneuploidity CIN CRC: rossz prognózis (Walther, Gut, 28) Shannondiverzitás-index: H = p i ln( p i ) i Sejtciklus szinkronizálása Szer Blokk hol? Lovastatin korai G Mimosine késői G Aphidocolin G/S határ Hydroxyurea korai S Nocodazole G2/M fázis Éhezés: normál sejt anyagcsere alkalmazkodik Egér + xenograft+ éhezés: tumor csökken de: visszanő Lee és mtsai (22) Éhezés + kemo: kevesebb MH (n=) Safdieet al (29) Kalória-korlátozás: olcsó és azonnali (NCT3425, NCT936364, NCT75837) Kazi és Dou, MethodsMol Med, 25 összefoglalás ANTRACIKLINEKKEL SZEMBENI REZISZTENCIA Külső hatás: extrinsic Celluláris stressz: intrinsic Proapoptotikus/ antiapoptotikus utak egyensúlya Apoptózis kiesése: MDR, pld: p53 tumor-szuppresszor bcl-2 Transzport fehérjék PGP, MRP, LRP, BCRP Antioxidáns védelem Szuperoxid-dizmutáz (SOD) fokozott expressziója -> DOX által okozott oxidatív stresszre rez. GSTP transzfekció = 3.5x rezisztencia Apoptotikus jelátvitel p53 mutáció hiány = rez. Topoizomeráz modulálás

11 összefoglalás TAXÁNOKKAL SZEMBENI REZISZTENCIA Áttétes tüdő és colon tumor (hetek v hónapok nem kuratív) Betegek: n=93, IV. stádium, kuratív? Eredmény: Nem érti: tüdőtumor: 69% colon: 8% Fehér vs nem fehér (HR: 2.93) Jó kapcsolat a dokival (HR:.9) Nem szignifikáns: képzettség, általános állapot Orvos a 22-es csapdájában összefoglalás összefoglalás Hosszú távú klinikai probléma: tumorsejtek genomikus instabilitása + alkalmazkodóképessége Legtöbb marker klinikailag nem igazolható Multigénes markerek? -> Célzott terápia? ->. IC gyógyszer CC a) Transzport rendszerek Csökkent influx Fokozott efflux b) Glutathion c) Metabolizmus 2. Gyógyszer-célmolekula interakció 3. Celluláris válasz a) DNS hibajavítás NER BER MMR b) Sejtciklus c) Apoptotikus utak