Vazoaktív faktorok szerepe nyomás-, és volumenterheléses

Átírás

1 Vazoaktív faktorok szerepe nyomás-, és volumenterheléses hipertrófia modellekben Doktori tézisek Skoumal Réka Semmelweis Egyetem, Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Tóth Miklós PhD, DSc Hivatalos bírálók: Székely László PhD Dr. Vásárhelyi Barna PhD Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Kempler Péter PhD, DSc Dr. Takács István PhD Dr. Székely Andrea PhD Budapest 2006.

2 Bevezetés Tartós hemodinamikai túlterhelés (pl. hipertónia, szívbillentyű betegség) hatására jelentősen növekszik a bal kamra izomtömege. Sejtek szintjén a hipertrófiás folyamatot a kardiomiociták méretének növekedése, a fehérjeszintézis fokozódása és a szarkomer organizáció magasabb szintje jellemzi. Genetikai szinten az embrionális korban domináló gének reexpressziója, az un. fetális gén program aktivációja jellemző, mely magában foglalja az atriális nátriuretikus peptidet (ANP), a B-típusú nátriuretikus peptidet (BNP), a szkeletális α-aktint, és a β-miozin nehézláncot kódoló géneket (Lorell és Carabello, 2000; Frey és Olson, 2003). A megváltozott expressziójú gének közül az ANP mutatja a legnagyobb mérvű változást (Caron és mtsai, 2004), a peptid expresszióját megbízható hipertrófia markernek tartják (Ruskoaho, 1992). Klinikai vizsgálatok tanúsága szerint a hosszan fennálló bal kamrai hipertrófia a szíveredetű halálozás egyértelmű kockázati tényezője (Levy és mtsai, 1990). A kardiomiociták növekedéséért felelős jelátvivő mechanizmusok felderítése ily módon kulcsfontosságú a szívbetegségek kialakulásának visszaszorításában. Számos adat utal arra, hogy a mechanikai terhelés egyes neurohumorális faktorokkal szoros kölcsönhatásban váltja ki a szívhipertrófiát. Az adrenerg és a reninangiotenzin rendszer fontos szerepet játszik a hipertrófiás folyamat inicializálásában és progressziójában (Molkentin és Dorn, 2001; Barki-Harrington és mtsai, 2004; Dostal és Baker, 1999). Azonban tisztázatlan, hogy a norepinefrin (NE) illetve az angiotenzin II (Ang II) hatása direkt vagy további humorális faktorok is szükségeltetnek a teljes hipertrófiás válasz kifejlődéséhez. A legtöbb emlős sejtben a Na + /K + -ATPáz fontos katalizátora a sejtmembránon keresztül zajló Na + és K + aktív transzportjának. Kimutatták, hogy az enzim aktivitása alapvető jelentőséggel bír a vérnyomás (Dostanic- Larson és mtsai, 2005; Dostanic és mtsai, 2005; Dostanic-Larson és mtsai, 2006) illetve a szívizom-kontraktilitás szabályozásában (James és mtsai, 1999; Dostanic és mtsai, 2003). Fontos kiemelni, hogy a szívglikozidok (pl. digoxin), melyeket több mint 200 éve használnak a szívelégtelenség terápiájában, képesek kötődni a Na + /K + -ATPáz egy az evolúció során nagyfokú konzervativizmust mutató kötőhelyéhez (Schwinger és mtsai, 2003). Az elmúlt két évtized során számos endogén glikozid-szerű anyagot 2

3 azonosítottak emlősökben, melyek a Na + /K + -ATPáz ligandjaként szolgálhatnak (Hamlyn és mtsai, 1991; Ludens és mtsai, 1991; Bagrov és mtsai, 1998). A feltételezett Na + /K + -ATPáz inhibitorok közül a mellékvese eredetű endogén ouabain-szerű anyagot (OLC) tanulmányozták legintenzívebben (Hamlyn és mtsai, 1991). Számos patológiás állapotban mutatták ki a plazma OLC szintjének növekedését, többek között hipertóniában (Hamlyn és mtsai, 1982; Abdelrahman és mtsai, 1995; Manunta és mtsai, 1999), tünetmentes bal kamrai diszfunkcióban (Balzan és mtsai, 2001), és krónikus szívelégtelenségben (Gottlieb és mtsai, 1992). A közelmúltban felvetették, hogy a ouabain kardiomiocita hipertrófiát válthat ki in vitro (Huang és mtsai, 1997; Liu és mtsai, 2000), azonban mindezidáig ismeretlen az endogén OLC szerepe a hipertrófiás folyamatban in vivo körülmények között. Az elhízáshoz kapcsolódó bal kamrai diszfunkció patogenezise ismeretlen. Annak felismerése, hogy a szívhipertrófia kialakulása során a miokardiális zsírsav oxidáció csökken és a metabolizmus a glükóz felhasználás irányába tolódik el (Taegtmeyer és mtsai, 1988; Kagaya és mtsai, 1990), felveti a megváltozott zsírsav metabolizmus szerepét a szívhipertrófia progressziójában. Kimutatták, hogy hosszúláncú zsírsavak képesek befolyásolni az Ang II-indukálta hipertrófiás választ in vitro neonatális kardiomiocitákban (Zahabi és mtsai, 2001). Leírták továbbá, hogy a szív zsírsav felhasználását csökkentő szerek bal kamrai hipertrófiát idéznek elő kísérletes modellekben (Rupp et al., 1992). Emellett, a zsírsav anyagcsere számos örökletes betegségéhez kapcsolódik, pl.: szívhipertrófia illetve kardiomiopátia (Kelly és Strauss, 1994). Azonban a hipertrófiát és a hiperlipidémiát egymáshoz kapcsoló jelátvivő folyamatok nem tisztázottak. Célkitűzések A mellékvese eredetű Na + /K + -ATPáz gátló ouabainról kimutatták, hogy kardiomiocita hipertrófiát képes kiváltani in vitro, azonban mindezidáig nem tisztázott az endogén OLC szerepe a hipertrófiás folyamatban in vivo. Mivel az adrenerg receptor stimuláció és az Ang II fokozza az OLC szekréciót marha és patkány adrenokortikális sejtekben, karakterizáltuk a plazma OLC 3

4 szintjének változását bal kamrai hipertrófia kialakulása során, melyet NE illetve Ang II infúzióval hoztunk létre. Továbbá, tanulmányoztuk a mellékveseirtás hatását a plazma OLC szintre, valamint a hipertrófiás folyamatra a bal kamrai tömeg és az ANP génexpresszió változása révén. Végezetül, az ANP akut transzkripcionális aktivációjában vizsgáltuk a ouabain szerepét in vitro. A zsírsav bevitel hosszú távon befolyásolja a bal kamrai hipertrófia kialakulását. Azonban a hipertrófiát és a hiperlipidémiát egymáshoz kapcsoló jelátvivő folyamatok nem tisztázottak. Munkánk célja a táplálékkal nagy mennyiségben bevitt zsírok hatásának illetve az azt közvetítő jelátviteli mechanizmusoknak a vizsgálata volt a hipertrófiás folyamat kezdeti fázisában. Vizsgáltuk egyes hipertrófiás gének bal kamrai expresszióját (ANP, BNP, szkeletális α-aktin, c-fos) Ang II-vel létrehozott nyomás túlterhelésben normál, telített és többszörösen telített zsírokban gazdag étrenden tartott patkányokban. Továbbá, vizsgáltuk a mitogén-aktivált protein kinázok (MAPK) foszforilációjának illetve az aktivátor protein-1 (AP-1) transzkripciós faktor DNS-kötő aktivitásának a szerepét a zsírbevitel által indukált változásokban. Módszerek Kísérleti állatok és protokollok Kísérleteink során hím, 7-8 és hetes Sprague-Dawley patkányokat (n=220) használtunk fel. Étrend A patkányokat standard laboratóriumi tápon tartottuk, egyes alcsoportok tápját 10%-os többszörösen telítetlen n-6 napraforgómag olajjal illetve telített disznózsírral egészítettük ki. 4

5 Ang II- és NE-indukált bal kamrai hipertrófia A patkányokat a következő beavatkozásoknak vetettük alá: vivőanyag infúzió, NE és Ang II infúzió, bilaterális adrenalektómia + vivőanyag infúzió, bilaterális adrenalektómia + Ang II vagy NE infúzió. Az ozmotikus minipumpákat (Alzet 1003D, leadási ráta: 1 μl/h) fiziológiás sóoldattal (0.9% NaCl) (vivőanyag), NE-nel (300 μg/kg/h) illetve Ang II-vel (33 ug/kg/h) töltöttük fel és az állatok lapockája területén ültettük be a bőr alá 12, 24 vagy 72 órára. In vitro kísérletek bal-kamrai szívizom sejttenyészeten 2-4 napos Sprague-Dawley patkányok bal kamrai szívizom szövetéből kollagenáz disszociációs módszerrel sejteket izoláltunk. A sejteket szűrtük, majd Petri-csészékben szélesztettük 45 percig 37 C fokon, 5 % széndioxidot tartalmazó termosztátban. Az izomsejteket a felülúszóból leszívtuk és /cm 2 koncentrációban 35 mm átmérőjű Falkon-gyártmányú edényekben tenyésztettük tovább. A következő napon a tápoldatot szérum-mentes, marha albuminnal (BSA), inzulinnal, transzferrinnel, szeléniummal, nátrium-piruváttal, tiroxinnal, L-glutaminnal és penicillin-sztreptomicinnel kiegészített CSFM médiumra cseréltük. A harmadik naptól 24 órán át inkubáltuk a bal kamrai izomsejteket fenilefrint 1 vagy 10 μm-os koncentrációban tartalmazó tápoldatokban. A megfelelő csoportoknál 30 perccel a fenilefrin adása előtt 1 nm-os, 10 μm-os vagy 100 μm-os ouabain kezelést alkalmaztunk. A kísérlet végén a sejteket kétszer átmostuk jéghideg foszfát pufferrel, majd lefagyasztottuk és -70 C-on tároltuk további analízisig. Biokémiai vizsgálatok Radioimmunoassay mérések Az ouabain-szerű anyag (OLC) immunológiailag aktív formájának mennyiségét extrahált plazma mintákból RIA módszerrel mértük. Lipidek szérum koncentrációjának mérése A szérumban található teljes koleszterin, triglicerid és HDL lipoprotein szintek meghatározása Roche kittel, enzimatikus módszerrel történt. 5

6 mrns izolálás és analízis A bal kamrai szívizom szövet teljes mrns mennyiségének kinyerését guanidiumtiocianátos homogenizálást követően CsCl-grádiens centrifugálással végeztük (Chirgwin et al., 1979). A sejttenyészetekből származó mintákból fenol-kloroform extrakciós módszerrel (Trizol reagens, Invitrogen) vontuk ki a teljes mrns mennyiséget. A mintákból azonos mennyiségű mrns-t melegítéssel denaturáltunk, majd az elektroforézis során formaldehidet is tartalmazó, 1%-os agaróz gélben futtattuk. Egész éjszakán át nylon membránra Northern blottoltuk, majd az így kapott, különböző mintákból származó, méret szerint szétválasztott mrns-t tartalmazó filtereket következő éjszaka radioaktívan jelölt, ANP, - BNP, - c-fos - és szkeletális-α-aktin génekre specifikus próbákkal hibridizáltuk. Az autoradiográfiás jelek denzitását Molecular Imager FX Pro MultiImager rendszerben QuantityOne software-rel (version ) (Bio-Rad Laboratories) mértük. A minták gélre történő felviteléből és esetleg a gélből a membrán filterre történő egyenetlen transzferből keletkező különbségek kiküszöbölésére a kapott értékeket a minták 18s RNS tartalmával normalizáltuk. A real-time RT-PCR géppel történt analízisekhez az összes mrns molekuláról egy szálú cdns-t szintetizáltattunk, majd a Taqman-féle módszer szerint ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems) készülékkel mértük a patkány endotéliális nitrogén-monoxid szintáz (enos), az indukálható nitrogén-monoxid szintáz (inos) enzimek, valamint az 1-es típusú angiotenzin receptor (AT1 receptor) és 18s RNS molekulák génjeiről készült mrns átiratok mennyiségét. Nukleáris fehérje izolálás és EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) Bal kamrai szívizom szövetmintákból a sejtmagokban található fehérjéket kivontuk, tisztítottuk, majd szintetikus, 2 szálú, a patkány BNP gén promoterének AP-1 és NF- κb kötőhelyéhez hasonló szekvenciájú, radioaktívan jelölt oligonukleotidok segítségével analizáltuk ezen transzkripciós faktorok DNS kötő aktivitását. A reakció-elegyet 20 percig inkubáltuk, majd a mintákat natív, 5%-os poliakrilamid gélben futtattuk. Az elektroforézist követően a gélt szárítottuk, majd előhívtuk az autoradiográfiás jeleket, melyekből következtetni tudtunk a transzkripciós faktorok aktivációjára a fehérjék megváltozott elktroforetikus mozgékonysága alapján. 6

7 Western blot Western blot analízis segítségével a szöveti mintákban található foszforilált p38, ERK és JNK szinteket, valamint ezen fehérjék teljes mennyiségét határoztuk meg. A patkányok bal kamrai szívizom szövetéből származó mintákat homogenizáltuk, majd denaturáló SDS-gélelektroforézis során méret szerint szétválasztottuk a molekulákat. Ezt követően a gélből nitrocellulóz filterre vittük át a mintákat. A nem-specifikus kötőhelyeket a membránok szobahőmérsékleten, 1 órán át, 5%-os sovány tejben áztatásával blokkoltuk, majd éjszakán át a megfelelő elsődleges, foszfo-specifikus, majd megfelelő mosás után nem-foszfo-specifikus ellenanyaggal inkubáltuk +4 fokon, rázatva. Az előhívást torma peroxidázzal kapcsolt másodlagos ellenanyaggal, kemilumineszcenciás reakció alapján végeztük. Statisztikai kiértékelés A statisztikai kiértékelést variancia-analízist követő Bonferroni vagy Tukey post hoc teszttel végeztük SPSS program alkalmazásával. A korrelációs együttható értékeinek megállapítása a lineáris regresszió módszere alapján történt. A szignifikancia megállapítása a 95%-os konfidencia szinten történt. Eredmények 72 órás NE infúzió szignifikánsan növelte a bal kamra tömeg/testtömeg arányt és az ANP gén expresszióját patkányokban in vivo. Továbbá, NE kezelés hatására 12 óránál átmenetileg emelkedett a plazma OLC szint, mely 72 óránál visszatért a kontroll szintjére. Az adrenalektómia jelentékenyen csökkentette mind a bazális, mind a NEindukált plazma OLC szinteket. Míg a bilaterális adrenalektómia nem befolyásolta a NE infúzió által kiváltott bal kamra tömeg/testtömeg arány növekedést, addig az ANP génexpresszió fokozódást több, mint 40%-kal csökkentette mind 12 óránál, mind 72 óránál. Ezen eredményekkel összhangban, az Ang II-vel kezelt állatokban az adrenalektómia nem akadályozta meg a bal kamra tömegének növekedését, míg az ANP génexpresszió-fokozódást jelentős mértékben mérsékelte. Továbbá, neonatális patkány kamrai miocitákon vizsgálatából kapott eredményeink szerint az exogén ouabain 24 7

8 órás adását követően a fenilefrin által okozott ANP génexpresszió növekedés tovább emelkedett. Az Ang II által kiváltott bal kamrai ANP és BNP génexpresszió fokozódás és hipertrófiás index (bal kamra tömeg / testtömeg arány) értéke szignifikánsan magasabb volt a többszörörsen telítetlen, n-6 zsírokat nagy mennyiségben tartalmazó tápot fogyasztó patkányokban a normál táplálékkal etetettekhez képest. Western blot analízis szerint a génexpressziós változásokkal párhuzamban fokozott volt a c-jun N-terminális kináz foszforilációja többszörösen telítetlen zsírokban gazdag étrend mellett a bal kamrai mintákban. Továbbá, Ang II infúzió jelentősen fokozta a p38 MAP kináz foszforilációját telített zsírsavakban gazdag táp fogyasztásakor. Az AP-1 transzkripciós faktor DNS-hez történő kötődése megnőtt a bal kamrai mintákban zsíros étrend fogyasztása esetén, a normál étrendhez képest. RT-PCR analízis szerint az Ang II infúzió szignifikánsan csökkentette a többszörösen telítetlen, n-6 zsírsavakban illetve a telített zsírokban gazdag étrend mellett tapasztalható fokozott indukálható nitrogén monoxid szintetáz génexpressziót. Következtetések Eredményeink alapján elmondható, hogy míg a mellékvese-irtás a NE,- és az Ang II-indukálta ANP génexpresszió mértékének csökkenéséhez vezet, addig a hipertrófia foka nem változik. Kísérleteinkkel igazoltuk, hogy az adrenalektómia következtében mind a kiindulási, mind pedig a NE,- és az Ang II infúzió által átmenetileg megnövekedett keringő OLC mennyisége csökken. Megmutattuk, hogy in vitro szívizom sejttenyészetben exogén ouabain-nal történő kezelés hatására tovább fokozódik a fenilefrin-indukálta ANP génexpresszió növekedés. Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy a mellékvese-eredetű OLC-nek a jelenléte szükséges a norepinefrin-, és angiotenzin II-infúzió által indukált bal kamrai hipertrófiás folyamatokban jellemzően emelkedett szintet mutató, pitvari nátriuretikus peptid gén expressziójának indukciójához. 8

9 Kísérleteink igazolták, hogy a zsírokban gazdag étrend befolyásolja a bal kamrai hipetrófia kialakulásának folyamatát, megváltoztatva bizonyos (ANP, BNP) hipetrófiás marker gének szöveti expresszióját, számos jelátviteli út aktiválódásának szabályozásán keresztül. A telített és többszörösen telítetlen (n-6) zsírsavakban gazdag tápok emelik a plazma triglicerid szintjét, mellyel párhuzamosan nő egyes mitogén aktivált kináz molekulák (JNK, p38) foszforiláltsága, valamint az aktivátor protein-1 transzkripciós faktor aktivitása is fokozódik. Utóbbi kötőhelye a BNP gén promóterében is megtalálható, ezért magyarázhatja a natriuretikus peptid gének fokozott expresszióját. Eredményeinkre tekintettel és figyelembe véve, hogy megváltozott étrendünk miatt egyre több (telített és n-6) zsírsavat fogyasztunk, a szívhipetrófia kezelése során, olyan komplex kezelést érdemes előnyben részesíteni, amely kiterjed a táplálékkal bevitt zsírsavak minőségének vizsgálatára ill. befolyásolására. Saját publikációk jegyzéke Disszertációhoz kapcsolódó közlemények Skoumal R, Szokodi I, Aro J, Földes G, Göőz M, Seres L, Sármán B, Lakó-Futó Z, Papp L, Vuolteenaho O, Leppaluoto J, dechâtel R, Ruskoaho H and Tóth M. Involvement of endogenous ouabain-like compound in the cardiac hypertrophic process in vivo. Life Sciences - nyomtatásban. Foldes G, Vajda S, Lako-Futo Z, Sarman B, Skoumal R, Ilves M, dechatel R, Karadi I, Toth M, Ruskoaho H, Lepran I. Distinct modulation of angiotensin II-induced early left ventricular hypertrophic gene programming by dietary fat type. J Lipid Res Jun;47(6): Egyéb publikációk Lengyel C, Virag L, Biro T, Jost N, Magyar J, Biliczki P, Kocsis E, Skoumal R, Nanasi PP, Toth M, Kecskemeti V, Papp JG, Varro A. Diabetes mellitus attenuates the repolarization reserve in mammalian heart. Cardiovasc Res Nov 11. 9

10 Ala-Kopsala M, Ruskoaho H, Leppaluoto J, Seres L, Skoumal R, Toth M, Horkay F, Vuolteenaho O. Single assay for amino-terminal fragments of cardiac A- and B-type natriuretic peptides. Clin Chem Apr;51(4): Skoumal R, Seres L, Soos P, Balogh E, Kovats T, Rysa J, Ruskoaho H, Toth M, Horkay F. Endothelin Levels in Experimental Diabetes Combined with Cardiac Hypertrophy. J Cardiovasc Pharmacol. 2004;44:S195-S197. Posa I, Horkay F, Seres L, Skoumal R, Kovats T, Balogh E, de Chatel R, Toth M, Kocsis E. Effects of Experimental Diabetes on Endothelin-induced Ventricular Arrhythmias in Dogs. J Cardiovasc Pharmacol. 2004;44:S380-S382. Lako-Futo Z, Szokodi I, Sarman B, Foldes G, Tokola H, Ilves M, Vuolteenaho O, Skoumal R, dechatel R, Ruskoaho H, Toth M. Angiotensin II type receptor blockade induces activation of the hypertrophic response in vivo in the rat heart. Circulation 2003 Nov 11;108(19): Foldes G, Horkay F, Szokodi I, Vuolteenaho O, Ilves M, Lindstedt KA, Mayranpaa M, Sarman B, Seres L, Skoumal R, Lako-Futo Z, dechatel R, Ruskoaho H, Toth M. Circulating and cardiac levels of apelin, the novel ligand of the orphan receptor APJ, in patients with heart failure. Biochem Biophys Res Commun Aug 29;308(3):