Lehetőségek a tumorspecifikus irányító peptidek hatékonyságának növelésére

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Lehetőségek a tumorspecifikus irányító peptidek hatékonyságának növelésére"

Karola Budai
5 évvel ezelőtt
Látták:

1 Lehetőségek a tumorspecifikus irányító peptidek hatékonyságának növelésére Kiss Krisztina 1, Szabó Rita 1, Kovács-Biri Beáta 1, Orosz Ádám 2, Mező Gábor 1 1 MT-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport 1 SE-ÁOK Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet Chemotaxis Workshop Budapest

2 Miért foglalkozunk a daganatos megbetegedésekkel? Halálokok: 1. Szív és érrendszeri megbetegedések 2. Daganatos megbetegedések 65 év alattiak között vezető halálok; az összes beteg 40%-a

gyógyítható: tüdőrák (~16%-os túlélés) Nagy esetszám viszonylag jól gyógyítható:

3 tíz leggyakoribb daganatos megbetegedés és leggyakoribb halált okozó rák típus Nagy esetszám elég jól gyógyítható: emlőrák (~66%-os túlélés) Nagy esetszám rosszul gyógyítható: tüdőrák (~16%-os túlélés) Nagy esetszám viszonylag jól gyógyítható: vastagbélrák (~47%-os túlélés) Kis esetszám rosszul gyógyítható: hasnyálmirigyrák (~5%-os túlélés)

4 Kemoterápia cisplatin taxol doxorubicin 5-fluoruracil vinblasztin metotrexát kamptotecin

kemoterápia mellékhatásai Kemoterápiás szerek: a gyorsan osztódó sejtekre hatnak (tumorsejtek) de hatnak a normális körülmények között gyorsan osztódó sejtekre is és károsítják azokat pl.

5 kemoterápia mellékhatásai Kemoterápiás szerek: a gyorsan osztódó sejtekre hatnak (tumorsejtek) de hatnak a normális körülmények között gyorsan osztódó sejtekre is és károsítják azokat pl. csontvelő (vérképző szerv) sejtjei, emésztőszervek hajhagymákat tartalmazó tüsző kemoterápia legáltalánosabb mellékhatásai: - mieloszuppresszió (vérsejtek képződésének csökkenése) - immunszuppresszió (érzékenység fertőző betegségekre) - mukozitisz (bél és emésztő rendszer gyulladása, hányás) - alopecia (foltos hajhullás) Egyedi toxikus hatások: kardiotoxicitás, veseelégtelenség, ödémásodás, májfunkció zavarai, terratogén (magzatkárosító) hatás

terápia fokozott szelektivitásának lehetősége az egészséges sejtek és a

tumorsejtek, szövetek között: Sejtfelszíni (pl.

6 terápia fokozott szelektivitásának lehetősége az egészséges sejtek és a tumorsejtek különbségén alapul Néhány különbség az egészséges és tumorsejtek, szövetek között: Sejtfelszíni (pl. tumorspecifikus vagy túltermelődött receptor) egészséges sejt tumorsejt Sejtbeni (pl. enzimek, egyéb fehérjék eltérő mennyiségben, minőségben) katepszin B mátrix metallopeptidáz 9 (MMP9) Lokalizálható szilárd tumorok (pl. újonnan kialakult vérerek)

7 Célzott tumorterápia: szelektív hatóanyag célba juttatás irányító molekulákkal konjugált hatóanyag összekötő irányító molekula receptor-közvetített endocitózis szabad hatóanyag konjugált hatóanyag összekötő irányító molekula receptor hatás helye vezikula szabad hatóanyag lizoszóma endoszóma hatás helye tumorsejt egészséges sejt Mező G, Manea M. (2010) Expert Opinion on Drug Delivery 7, 79-96

Vastagbél tumorsejthez (HT-29) kötődő peptidek kiválasztása fág-bemutatás technikával Szekvencia 2-3 szelekciós lépés után Fág könyvtár VHLGYT kiválasztott peptid Ismétlés 2-3-szor Vastagbél

8 Vastagbél tumorsejthez (HT-29) kötődő peptidek kiválasztása fág-bemutatás technikával Szekvencia 2-3 szelekciós lépés után Fág könyvtár VHLGYT kiválasztott peptid Ismétlés 2-3-szor Vastagbél tumorsejt Dau=oa-VHLGYT-NH 2 Mosás Kötődés E. coli-ban való kifejeztetés Dau=oa-LRRY-VHLGYT-NH 2 Dau=oa-GFLG-VHLGYT-NH 2 Dau: daunomicin Nem kötődött fágok Kötődött fágok Eluálás oa: aminooxiacetil GFLG, LRRY: Katepszin B enzim által hasítható szekvenciák fág klón felhasználásával, 50 kiválasztott, amelyek kevés és csak dipeptid szakasz homológiát mutattak Zhang Y., et al. (2007) J. Biomol. Screen. 12,

9 Tüdőrák terápiájára alkalmas irányító peptidek keresése Fág-bemutatásos eljárással kiválasztott peptidszekvenciák (12 aminosav tagszámú), amelyek felismerik a NSCLC (nem kissejtes tüdő tumor) CL1-5 sejteket: 5-2 TDSILRSYDWTY 27/ DMPKQLLPWYY 3/ TDSILRSYDWTY 20/ DMPKQLLPWYY 2/ TDSILRSYDWTY 1/5 TDSILRSYDWTY szekvencia gyakorisága a klónokban 20%-ról 90%-ra emelkedett 3. illetve az 5. szelekciós ciklusból vett random mintavétel esetén. peptid kötődik a tüdő tumorszövethez, de csak minimálisan az egészséges tüdő szövethez. Chang D-K., et al. (2009) PLOS ONE 4: e4171

10 Hatékonyabb konjugátum kiválasztása la-szken segítségével Dau=oa-LRRY- V V V V V V H H H H H H L L L L L L G G G G G G Y Y Y Y Y Y T T T T T T -NH 2 Kód Konjugátum Citosztázis (IC 50 (mm)) (24 órás kezelés + 48 óra) KK06/2 Dau=oa-LRRY-VHLGYT-NH 2 50,5 ± 5,5 KK11 Dau=oa-LRRY-VHLGY-NH 2 60,9 ± 3,1 KK12 Dau=oa-LRRY-VHLGT-NH 2 > 100 KK13 Dau=oa-LRRY-VHLYT-NH 2 14,0 ± 1,5 KK14 Dau=oa-LRRY-VHGYT-NH 2 > 100 KK15 Dau=oa-LRRY-VLGYT-NH 2 26,8 ± 0,4 KK16 Dau=oa-LRRY-HLGYT-NH 2 > 100

11 z oxim-kötést tartalmazó Dau-GnRH-III konjugátumok lebomlása Katepszin B enzim hatására Glp-His-Trp-Ser-His-sp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH 2 H-Lys-OH N-O-CH O OH 2 -CO- N-O-CH O OH 2 -CO- OH OH CH 3 O O OH O NH 2 CH 3 O O OH O NH 2 O OH O CH 3 OH CH 3 Glp-His-Trp-Ser-His-sp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH 2 O OH N-O-CH 2 -CO-Gly-Phe-Leu-Gly- O OH N-O-CH 2 -CO-Gly-OH OH OH CH 3 O O OH O NH 2 CH 3 O O OH O NH 2 O OH O OH CH 3 CH 3 Citosztatikus hatás (IC 50 mm) MCF-7 (humán emlő): 7,8 ± 2,1 HT-29 (humán vastagbél): 17,9 ± 4,0 MCF-7 (humán emlő): 3,9 ± 1,2 HT-29 (humán vastagbél): 22,5 ± 1,7 Szabó, I., et al. (2009) Bioconjug. Chem., 20,

12 Daunorubicin és daunorubicint tartalmazó metabolitok kötődése csirke eritrocita DNS-hez nyag K (x 10 5 ) (M -1 ) n Dau 11,70 2,5 Dau=oa-OH 2,21 3,8 H-Lys(Dau=oa)-OH 6,80 3,0 Dau=oa-Gly-OH 6,74 3,5 Dau=oa-rg-OH 6,78 3,2 Dau=oa-Tyr-OH 4,40 3,5 Dau=oa-Leu-OH 3,23 3,6 GnRH-III(Dau=oa) 0,83 4,2 K: kötődési állandó; n: kizárási paraméter Dau COOH közelsége gátolja a kötődést Bázisos aminosav (esetleg ikerionos szerkezet miatt) segíti a kötődést Nagy térkitöltésű oldalláncot tartalmazó aminosav gátolja a kötődést Orbán E., et al. mino cids 41(2): (2011) Orbán E., et al. Bioconjugate Chemistry 22(10): (2011)

13 fluoreszcencia int. Konjugátumok sejtfelvételének tanulmányozása áramlási citométerrel fluoreszcencia int. fluoreszcencia int. 3 órás kezelés HT mm 100 mm G T/ Y/ G/ L/ H/ V/ Élő sejtek 20 mm Halott sejtek 20 mm mm mm KK06/2 KK11 KK12 KK13 KK14 KK15 KK16 0 KK06/2 KK11 KK12 KK13 KK14 KK15 KK16 G T/ Y/ G/ L/ H/ V/ G T/ Y/ G/ L/ H/ V/

14 dau+ sejtek [%] Konjugátumok sejtfelvételének tanulmányozása áramlási citométerrel Dau+ sejtek [%] dau+ sejtek [%] órás kezelés HT mm 100 mm G T/ Y/ G/ L/ H/ V/ KK06/2 KK11 KK12 KK13 KK14 KK15 KK16 Élő sejtek 20 mm Halott sejtek 20 mm mm G T/ Y/ G/ L/ H/ V/ KK06/2 KK11 KK12 KK13 KK14 KK15 KK mm G T/ Y/ G/ L/ H/ V/ KK06/2 KK11 KK12 KK13 KK14 KK15 KK16

15 Konjugátumok sejtfelvételének vizsgálata fluoreszcens mikroszkóppal Dau=oa-LRRY-VHLGYT-NH 2 Dau=oa-LRRY-VHLYT-NH 2 c=20 mm; 15 perc c=20 mm; 15 perc c=20 mm; 30 perc c=20 mm; 30 perc

16 Hatékonyabb konjugátum kiválasztása la-szken majd pozíciós szkennelés segítségével V H L G Y T H L G Y T V L G Y T V H G Y T Dau=oa-LRRY- V H L Y T -NH 2 V H L G T V H L G Y V H L Y T V H L K Y T V H L E Y T V H L L Y T Dau=oa-LRRY- V H L F Y T -NH 2 V H L S Y T V H L T Y T V H L N Y T V H L P Y T 50,5 ± 5,5 >100 26,8 ± 0,4 >100 14,0 ± 1,5 >100 60,9 ± 3,1 27,9 6,4 50,3 3,0 29,5 6,2 7,5 3,5 6,6 2,9 24,8 7,4 21,7 6,5 28,0 19,4 >50 IC 50 értékek óra kezelés MTT teszt

17 Dau+ sejtek [%] Fluoreszcencia int. In vitro sejtbejutási vizsgálatok áramlási citométerrel Dau=oa-LRRY-VHLYT-NH 2 Dau=oa-LRRY-VHLFYT-NH 2 Dau=oa-LRRY-VHLSYT-NH 2 Dau=oa-LRRY-VHLPYT-NH ,25 12, c / mm 6,25 12, c / mm

18 daunomicin (Dau) sejtfelvételének vizsgálata konfokális mikroszkóppal (0,5 órás kezelés) Dau LysoTracker Dau + LysoTracker Dau MitoTracker Dau + MitoTracker

19 Dau=oa-Leu-OH metabolit sejtfelvételének vizsgálata konfokális mikroszkóppal (0,5 órás kezelés) Dau LysoTracker Dau + LysoTracker Dau MitoTracker Dau + MitoTracker

20 Dau=oa-LRRY-VHLYT-NH 2 konjugátum sejtfelvételének vizsgálata konfokális mikroszkóppal (1,5 órás kezelés) G/ LysoTracker G/ + LysoTracker G/ MitoTracker G/ + MitoTracker

21 Dau=oa-LRRY-VHLFYT-NH 2 konjugátum sejtfelvételének vizsgálata konfokális mikroszkóppal (1,5 órás kezelés) G/F LysoTracker G/F + LysoTracker G/F MitoTracker G/F + MitoTracker

22 Dau=oa-LRRY-VHLPYT-NH 2 konjugátum sejtfelvételének vizsgálata konfokális mikroszkóppal (1,5 órás kezelés) G/P LysoTracker G/P + LysoTracker G/P MitoTracker G/P + MitoTracker

23 Összefoglalás fág-bemutatás technika alkalmas módszer hatékony tumorspecifikus irányító peptidek kiválasztására; szelekciós lépések számának növelésével a kiválasztás hatékonysága javul; zonban még így is lehetnek olyan komponensek, amelyek a populációból a vizsgálatra történő kiválasztáskor elvesznek, ezért a kapott szekvenciák módosításával az irányító peptidek receptor-felismerő képessége és kötődési erőssége növelhető; változtatható helyek kiválasztására alkalmas módszer az la-szken, majd az alkalmas pozíciókban további aminosavak beépítésével a hatás fokozható; Lineáris peptidek esetén további módosítások szükségesek az szérum/enzimstabilitás fokozása érdekében (ciklizálás, D- és/vagy nem természetes aminosavak beépítésével, retro-inverz szekvenciák (csupa D-aminosavból felépített fordított szekvenciájú peptid)) z oxim kötés kicserélése más linkerre, amelyből a szabad hatóanyag felszabadulhat

24 Támogatók NK K K MSC-ITN-2014-ETN: Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Networks (ITN-ETN) NVKP_ Szinergia program Műszer pályázat

25 Köszönöm a figyelmet!

Hasonló dokumentumok

Célzott tumorterápiára alkalmas hatóanyag peptid konjugátumok fejlesztése

Célzott tumorterápiára alkalmas hatóanyag peptid konjugátumok fejlesztése Mező Gábor MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport Remedicon Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság Gyógyszerinnovációs