Fág könyvtárból kiválasztott irányító peptid szerkezetének optimálása célzott tumorterápiához

Átírás

1 Tudományos Diákköri Dolgozat KISS KRISZTINA Fág könyvtárból kiválasztott irányító peptid szerkezetének optimálása célzott tumorterápiához Témavezető: Dr. Mező Gábor MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport Kémiai Intézet Szerves Kémia Tanszék Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2016

2 Köszönetnyilvánítás Köszönöm Dr. Hudecz Ferenc és Dr. Perczel András tanszékvezető egyetemi tanároknak, hogy munkámat az ELTE Szerves Kémiai tanszékén, valamint az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoportban lehetővé tették. Köszönöm témavezetőmnek, Dr. Mező Gábor tudományos tanácsadónak irányítását, tengernyi türelmét és a vidám perceket. Köszönöm, hogy tanácsaival és észrevételeivel segítette munkámat és dolgozatom elkészültét. Külön köszönettel tartozom Enyedi Kata Nórának és Pethő Lillának a tömegspektrometriás mérések elvégzéséért, valamint a remek hangulatért a laborban. Továbbá köszönettel tartozom Dr. Oláhné-Szabó Ritának és Biri-Kovács Beátának a biológiai vizsgálatok elvégzéséért, valamint Dr. Bősze Szilviának hogy a biológiai vizsgálatokat lehetővé tette. Enyedi Kata Nórának és Hegedüs Kristófnak külön meg szeretném köszönni, a közös hajnalozásokat és a kávézásokat. Végül szeretném köszönetemet kifejezni családomnak és barátaimnak, támogatásuk nélkül ez a dolgozat nem jöhetett volna létre.

3 Tartalomjegyzék Köszönetnyilvánítás Tartalomjegyzék 1 Bevezetés 1 2 Irodalmi áttekintés Daganatterápia Sebészeti beavatkozás Sugárterápia Kemoterápia Daunomicin Irányított tumorterápia Kombinált irányított tumorterápia Peptidszintézis A gyanta A szilárdfázisú peptidszintézis stratégiái Fmoc/tBu stratégia Kapcsolási reakciók ellenőrzése Fágkönyvtáras peptidek Korábbi eredmények 15 3 Célkitűzések 16 4 Eredmények Az alanin-scan során szintetizált konjugátumok Az aminooxiecetsavat tartalmazó peptidek szintézise Az aminooxiacetilezett peptidek konjugálása daunomicinnel In vitro citosztázis meghatározása In vitro sejtbejutási vizsgálatok áramlási citometriával és fluoreszcencia mikroszkópiával A további szerkezet optimálás során előállított konjugátumok szintézise Az aminooxiecetsavat tartalmazó szekvenciák szintézise Az aminooxiacetilezett peptidek konjugálása daunomicinnel In vitro citosztázis meghatározása 26 5 Kísérleti rész 30

4 5.1 Az alanin-szkennelés során szintetizált konjugátumok szintézise Az aminooxiecetsavat tartalmazó peptidek (1-12) szintézise Az előállított peptidek konjugálása daunomicinhez A további, pozíciós-szkenneléssel történő szerkezet optimálás során előállított konjugátumok szintézise Az aminooxiacetilezett szekvenciák (19-34) szintézise Az előállított peptidek konjugálása daunomicinhez In vitro biológiai vizsgálatok In vitro vitosztázis meghatározása MTT-teszttel In vitro sejtbejutási vizsgálatok áramlási citometriával Fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatok 44 6 Összefoglalás 45 7 Irodalomjegyzék 46 8 Rövitítésjegyzék 49 9 Függelék

5 1 Bevezetés A WHO (Egészségügyi Világszervezet) adatai alapján 2012-ben több mint 8,2 millióan haltak meg rosszindulatú daganatos megbetegedésekben. A világon a negyedik legtöbb halált okozó rákos megbetegedés a kolorektális (vastagbél-, végbél-) tumor. Az Európai Unióban a szív és érrendszeri megbetegedések után a rákos megbetegedések okozzák a második legtöbb halálozást, azonban a kolorektális rák az EU-ban már a második helyen áll a daganatos halálozások okozójaként. 1 Hazánkban a halálozások 25%-át rákos megbetegedések okozzák. A tüdőrák után, az Európai Unióhoz hasonlóan nálunk is a második helyen áll a vastagbélrák, mint halálesetet okozó ráktípus. 2 A daganatok kialakulása minden esetben genetikai meghibásodásra vezethető vissza. Az ezt kiváltó tényezőket három csoportra oszthatjuk: kémiai (karcinogén vegyületek révén), fizikai (ionizáló vagy nem ionizáló sugárzás révén), valamint biológiai (onkogén vírusok által). A daganatos sejtekre jellemző, hogy sejtnövekedésüket serkentő és gátló szabályozás felborul, és a sejtek kontrollálatlan osztódásba kezdenek. A rákos megbetegedések sokfélesége miatt nincs általános gyógymód ellenük. A terápia megválasztása a tumor elhelyezkedésétől, méretétől, előrehaladottságától, valamint a beteg állapotától függ. A lehetséges főbb kezelési módszerek: sebészeti beavatkozás, sugár-, kemo-, immun-, hormon-, illetve irányított terápia vagy ezek valamilyen kombinációja. 3,4 Bár nem olcsó, de nagy valószínűséggel a személyre szabott, célzott tumorterápia hozhat jelentős áttörést a rák gyógyításában. 1

6 2 Irodalmi áttekintés 2.1 Daganatterápia A daganat a szervezetben valamennyi szervből, szövetből kiindulhat. Növekedését tekintve patológiás, progresszív növekedési tendenciát mutat, esetenként nyugalmi fázisokkal. A kontrollálatlan növekedés génhibákból adódik, amelynek következtében a sejtek elvesztik a normális növekedési és osztódási kontrollra való válaszkészségüket. A daganat kialakulásának a feltétele az onkogenezis, első lépésként a génhibák halmozódása, valamint az osztódási képesség megőrzése. Fejlődésük és növekedésük a szervezet anyagcseréjétől függ. A daganatok lehetnek jóindulatúak (benignus) vagy rosszindulatúak (malignus). A benignus tumoroknak lokalizált és lassú a növekedésük, ebből következik, hogy ezekben az esetekben a sebészeti beavatkozás igen hatékony. A benignus típusú daganatok idővel malignussá alakulhatnak. A malignus tumorokat invazív, destruktív növekedés jellemzi, az esetek többségében a szervi anatómiai határokon is túlburjánzanak, és áttéteket képezhetnek. A daganatterápia célja a megfelelő kezelés kiválasztása és alkalmazása, amely lehet: sebészeti beavatkozás, sugárterápia, immunterápia, hormonterápia, kemoterápia, valamint ezek kombinációja. 3,4 A kolorektális rák kezelésében elsősorban a sebészeti beavatkozást alkalmazzák, mellette a sugár- és kemoterápiának jut fontos szerep, valamint az utóbbi időben egyre jelentősebb a célzott biológiai terápiák (biológikumok) alkalmazása Sebészeti beavatkozás A daganatos betegek gyógyításában az első számú módszer a műtéti beavatkozás. Hatékonysága függ a tumor méretétől, illetve annak alakjától/lokalizáltságától, azaz, hogy a környező szövetekre milyen mértékben terjedt át. Vastagbélrák esetében eddig ez az első számú és legjobb megoldás. A műtét során az érintett bélszakaszt kimetszik, illetve ezzel együtt a környező nyirokcsomókat is eltávolítják. A műtét típusa a már feljebb említett tényezőktől függ, továbbá attól, hogy a végbél záróizmait el kell-e távolítani. Az egyszerűbb esetekben gyakori az a megoldás, hogy a kimetszés után az ép vastagbélszakaszokat egyesítik. 4 2

7 A műtét gyakran kombinált (multimodális) terápia része, megelőzheti, vagy követheti sugárkezelés, illetve kemoterápia, attól függően, hogy a tumor méretének a csökkentése-e a cél a beavatkozás előtt vagy az újabb kialakulást szeretnénk megelőzni Sugárterápia A sebészeti beavatkozások után a második leggyakrabban használt terápiás eljárás a sugárterápia, ez a kolorektális rák esetében is érvényes. 4 A kezelés során ionizáló sugárzást alkalmaznak, ez a nagy energiájú ionizáló sugárzás károsítja a sejtek DNS-ét, ezzel gátolva a sejtosztódást. A károsodott DNS a sejtek pusztulását okozhatja. A leggyakrabban alkalmazott sugárforrások: 60 Co, 125 I. A sugárforrást vagy a beteg testén kívül helyezik el, vagy a testüregben, amikor is a szövetek közé szúrt tűben helyezik el a sugárforrást. Radioizotópos kezelés során injekció formájában juttatják be a sugárzó izotópot. Azonban ezek az eljárások nem csak a tumorsejtek DNS-ét károsítják, hanem az ép sejtekét is. Ezt az eljárást főleg a vastagbélrák esetében alkalmazzák, általában a sebészeti beavatkozás után, kombinálva kemoterápiával Kemoterápia A kemoterápiát főként a vérképző szervek rosszindulatú daganatai (leukémia, limfóma) esetén használják. Ennek ellenére a kolorektális rák utókezelésében is jelentős szerepe van. 6 A kezelés során, a beteget citosztatikumokkal kezelik, ennek bejuttatása történhet szájon át vagy vénás infúzióként. Ezek a citosztatikumok vagy elpusztítják a rákos sejteket, vagy osztódásukat gátolják. A kemoterápiás szerek az osztódó vagy proliferáló sejtekben fejtik ki hatásukat. A tumorokban a normál szövetekhez képest nagyobb az osztodó sejtek száma, így a citosztatikumok hatása elsősorban ezekre hat. Az emberi szervezetben azonban a csontvelő, a száj- és bélnyálkahártya és a szőrtüszők sejtjei folyamatosan és gyorsan szaporodnak, így ezekre is hatással vannak, ezzel mellékhatásokat okozva. 5 Mellékhatásként jelentkezhet hajhullás, fáradékonyság, hányinger, valamint a csontvelő károsítása miatt a fehérvérsejtszám is csökken, ezzel előidézve az immunrendszer legyengülését. 3

8 A citosztatikumok hatásmechanizmusa alapján a következő típusokat különböztetjük meg: Alkilezőszerek (DNS replikációt gátolják, hibás replikációt eredményeznek), pl. ciszplatin, melfalán Antimetabolitok (DNS szintézishez szükséges enzimek működését vagy köztes anyagcsere folyamatokat gátló anyagok), pl. metotrexát Antibiotikumok (interkalációs komplexet képeznek a DNS-sel), pl. daunomicin, adriamicin (doxorubicin) Antimitotikumok (a mitotikus orsó kialakulását gátolják), pl. vinblasztin, vinkrisztin Gyakran alkalmazzák kombináltan ezeket a citosztatikumokat eltérő hatásmechanizmusuk miatt, amely szinergista módon növelheti hatékonyságukat. 6 Azonban a kezelés eredményességét korlátozhatja a beteg szerzett vagy öröklött multidrog rezisztenciája (MDR), amikor a rákos sejtek rezisztenssé válnak az alkalmazott gyógyszerekkel szemben. A véráramból történő gyors kiürülés miatt a hatóanyagokat nagy dózisban kell alkalmazni, ezzel fokozódnak a toxikus mellékhatások, ami részben összefügg azzal, hogy kis molekulatömegük miatt szabadon diffundálnak, ezáltal az egészséges szövetekhez is eljuthatnak Daunomicin A daunomicin (1. ábra) az antibiotikumok családjába tartozó antraciklinek közé tartozik, a Streptomyces peucetius baktérium termeli. 7 Vörös színű, kristályos anyag. Kemoterápiás kezelések során gyakran alkalmazzák, főleg leukémia kezelésére. Az aglikon részhez egy L-daunózamin kapcsolódik ábra A daunomicin szerkezete 4

9 Megállapították, hogy a daunomicin gátolja a DNS szintézisét, így a sejtek osztódását is. Később kimutatták, hogy a kezelések során alkalmazott dózis befolyásolja a hatásmechanizmust is. Hatása kifejeződhet lipidperoxidációban, alkilezheti a DNS-t, befolyásolhatja a helikáz enzim aktivitását, valamint gátolhatja a DNS-szálak szétválását interkaláció folytán, illetve a topoizomeráz II enzimet, amelynek fontos szerepe van a DNS transzkripció során. 9 A daunomicin mint kemoterápiás szer nem csak a daganatos sejtekre, hanem az egészséges sejtekre is hatással van, így toxikus mellékhatásokkal is rendelkezik (többek között: hajhullás, hányás, hasmenés, étvágytalanság, immunszupresszió, kardiotoxicitás). A kardiotoxicitás szervspecifikus mellékhatás, amit a szabadgyök képző tulajdonságára vezetnek vissza. Bőrrel érintkezve hólyaghúzó hatású és allergiás reakciót is kiválthat. Kísérletek során a káros mellékhatások elkerülése és a tumorspecifitás növelése érdekében oligopeptidekhez (pl.: GnRH) 10,11,12 és polimerekhez (pl.: HPMA 13, EAK 14 ) konjugálták a daunomicint. A daunomicin alapszerkezetének változtatása nélkül két konjugálásra alkalmas funkciós csoportja van; oxim- vagy hidrazon-kötés kialakítására az aglikon részen található 13-as C-atomján található oxocsoport és amid-kötés kialakítására a daunózamin aminocsoportja (2. ábra). 2. ábra A daunomicin konjugálására alkalmas funkciós csoportok A cukorrész aminocsoportján kialakított konjugáció hacsak a szabad hatóanyag fel nem szabadul a konjugátumból (pl. self imolative spacer alkalmazásakor) nem kedvező, mivel ekkor a konjugátum biológiai hasznosíthatósága jelentősen csökken. A self imolative spacer kialakítása drága eljárás, ezért csak a már ismert hatású konjugátumok aktivitásának fokozására célszerű használni. A savérzékeny hidrazon-kötés (ph<5 esetén bomlik) arra ad lehetőséget, hogy a szabad hatóanyag a tumorsejtekbe jutva a lizoszómákban lévő enyhén 5

10 savas körülmények között felszabaduljon. Azonban a hidrazon-kötést tartalmazó konjugátumok kialakítása és tisztítása nehézkes, amely jelentősen csökkentheti a szintézis kitermelését. A harmadik lehetőség az oxim-kötés kialakítása a hordozó peptid és a daunomicin között. A kötés kialakítása során a peptidlánchoz egy aminooxiecetsavat kell kapcsolni, mely alkalmas arra, hogy a daunomicinnel kemoszelektív ligációs eljárásban oximkötést alakítson ki. Az oxim-kötés viszonylag stabil mind kémiai, mind biológiai körülmények között, így a szabad hatóanyag nem szabadul fel a konjugátumból. Azonban a kötés kialakítása és a konjugátum tisztítása könnyen kivitelezhető és jó kitermeléssel kapható a termék. A konjugátumból felszabaduló metabolit in vitro biológiai vizsgálatokban kevésbé hatékony, mint a szabad hatóanyag, de alkalmas arra, hogy a megfelelő irányító peptideket kiválasszuk ezen konjugátumok segítségével, amelyeknek szerkezete tovább módosítható hatékonyabb származékok előállítása érdekében. 15 Így a munkám során a daunomicint oximkötéssel konjugáltam a kiválasztott peptidekhez Irányított tumorterápia Az irányított vagy célzott kemoterápia a kemoterápiának egy olyan módosított változata, amely arra törekszik, hogy a szelektivitás növelésével kiküszöbölje, de legalábbis csökkentse a kemoterápia mellékhatásait, ezáltal is javítva a kezelés alatt álló paciensek életminőségét. A 90-es évek elején került előtérbe ez a módszer, lényege hogy a citosztatikus hatóanyagok szelektíven a rákos sejtekbe juttathatóak legyenek, ezzel elkerülve az egészséges szöveteken mutatkozó toxicitást. Ennek a terápiának az egyik csoportjába olyan anyagok tartoznak, amelyek a rákos sejtek felszínén található receptorokhoz kötődnek, meggátolva azt, hogy ezek a receptorok saját szubsztrátjukhoz kötődve olyan ingert közvetítsenek a sejtmagba, ami a sejt osztódását serkenti. Tehát a cél a receptor gátlása. Az egyik első ilyen molekula egy immunfehérje (monoklonális antitest) volt. A monoklonális antitestek, specifikusan a rákos sejt membránján található antigénekhez (receptorokhoz) kötődnek, így a megfelelő inger hiányában a rákos sejt elpusztul. A hatás fokozása érdekében ezekhez az antitestekhez különböző hatóanyagokat lehet kapcsolni. 5 Azonban ezek az ellenanyag hatóanyag konjugátumok (Antibody-drug conjugates (ADCs)) eddig nem váltották be a hozzájuk fűzött reményeket. Ezért a kutatások egyre inkább a kisebb peptidalapú konjugátumok felé fordultak. 6

11 A kutatások során számos olyan peptidligandumot felismerő receptort találtak, melyek a rákos sejtek membránján nagyobb számban vannak jelen (túlexpresszálódnak). Ilyen receptorok pl. a GnRH-R, szomatostatin receptorok, EGF-R, VEGF-R, neuropilin receptorok. Ha a hatóanyagot olyan molekulához kapcsoljuk, amely specifikusan a rákos sejtek receptoraihoz kötődik, akkor szelektíven juttathatjuk be azokat, ezzel a hatóanyag csak a rákos sejtekre fejti ki a hatását. 5 Ilyen rendszert alkotnak a hatóanyag szállító rendszerek (drug delivery systems), amelyek egy hordozóból, egy irányítóból és hatóanyagból épülnek föl. Hordozóként használhatunk oligoés polipeptideket, valamint polietilénglikolt, irányítómolekulaként pedig antitesteket, cukrokat, lektineket, vagy más receptor-ligandumokat, például peptideket. 16 Sokszor a hordozó és az irányító molekula megegyezik. Az ilyen konjugátumok használatával elérhetjük, hogy azok specifikusak legyenek a daganatsejtre, továbbá ezek a konstrukciók javíthatják a citosztatikus hatóanyagok oldékonyságát. A konjugátumok a rákos sejt membránján található receptorokhoz kötődve receptor-mediált endocitózissal jutnak be a sejtbe, ahol lebomlanak és így a felszabaduló szabad hatóanyag vagy annak aktív metabolitja kifejti a hatását. 17 Kolorektális rák esetén a módszer a daganatsejtek felszínén található növekedési faktor receptor (EGF-R) ellenanyaggal (Herceptin (trastuzumab)) történő gátlásán alapul. Azonban ez a módszer akkor eredményes, ha a KRAS-teszt szerint a beteg a KRAS fehérje vad típusát hordozza, különben a hibás KRAS fehérje a sejtfelszíni növekedési faktor receptorfehérjéjének gátlása esetén is osztódási jelet fog továbbítani a sejtmag felé. 18 Másik lehetséges módszer mellyel kutatócsoportunk is foglalkozik a már fentebb említett peptid-hatóanyag konjugátumok hormon receptorokon (GnRH és szomatosztatin receptorok) keresztül történő tumorsejtbe juttatása. 19, Kombinált irányított tumorterápia A receptorok száma a tumorsejteken annak ellenére korlátozott, hogy túlexpresszálódnak, ezért a konjugátum koncentrációjának a növelése egy határon túl nem teszi sikeresebbé a kezelést. Ezért több megoldást alkalmazhatunk. Az egyik lehetőség, ha egy irányító molekulához több hatóanyagot kapcsolunk, ekkor a térgátlásra figyelni kell, hogy az irányító molekula ne veszítse el a receptorhoz kötődés képességét. 11 Egy másik megoldás különböző 7

12 konjugátumok együttes alkalmazása. Ilyenkor eltérő receptorokhoz kötődő irányító molekulákat alkalmazunk, ezekhez kapcsolhatunk azonos vagy különböző hatóanyagokat. Mindkét esetben fokozott citosztatikus hatást érhetünk el additív vagy szinergista módon. 2.2 Peptidszintézis Két legelterjedtebb módja a peptidek szintézisének az oldatfázisú, illetve a szilárdfázisú peptidszintézis. Az oldatfázisú peptidszintézis homogén oldatban zajlik. Minden kapcsolás után izolálni kell a terméket, ezt kicsapatással teszik meg. Egyes kapcsolások során a kitermelés 60-90%-os, így egy hosszú szintézis során, amikor sok aminosavat kell egymás után kapcsolni, előfordulhat, hogy a szintézis végére már nem marad peptid. Ezért Merrifield kidolgozta a szilárdfázisú peptidszintézis (SPPS) elvét, ezzel egyszerűbbé, gyorsabbá és hatékonyabbá téve a peptidszintézist. 21 Az oldatban történő szintézishez hasonlóan, a peptid felépítése történhet aminosavak lépésenkénti beépítésével (stepwise), illetve fragmenskondenzációval, amikor hosszabb, védett vagy részlegesen védett peptidláncokat kapcsolnak össze a gyantán (konvergens szilárdfázisú peptidszintézis; CSPPS). 22 Az SPPS során a peptid egy szilárd, oldhatatlan hordozóhoz van kapcsolva, amíg be nem fejeződik a szintézis. A hordozó/gyanta egy oldhatatlan, funkciós csoportokat tartalmazó polimer, amelyeken keresztül a peptid C-terminális felőli első aminosava kapcsolódik (3. ábra). A szintézis során a C-terminális védelmét maga a gyanta látja el. Majd az átmeneti α-amino- 3. ábra A szilárdfázisú peptidszintézis elve 8

13 védőcsoport hasítását követően, a következő aminosav-származék peptidkötéssel kapcsolható. A felkapcsolandó aminosav-származékokat megfelelő módon aktiválni, illetve mivel az eljárás során nagy reagens felesleget alkalmazunk az α-aminocsoportok mellett az érzékeny oldallánc funkciós csoportokat is védeni kell. Ezeket nevezzük állandó védőcsoportoknak, mivel csak a szintézis végén kerülnek eltávolításra. A lépések ismétlésével előállítható a kívánt hosszúságú peptidlánc. A kész peptidláncról le kell hasítani a gyantát, illetve a védőcsoportokat, ezt általában egy lépésben végezzük el. A megfelelő tisztítási eljárások után megkapjuk a kívánt peptidet. 23 A módszer előnye, hogy a reakcióelegy minden lépés után szűréssel eltávolítható és a gyanta mosható, így a melléktermékek és az elreagálatlan anyagok eltávolíthatóak, eközben a szilárd gyanta és a hozzá kapcsolt peptidlánc a szűrőn marad. Így a szintézis egyetlen reakcióedényben végezhető és a veszteségek jelentősen csökkennek. A szilárdfázisú peptidszintézis lényegesen gyorsabb (~2 óra/aminosav), mint az oldatban végzett szintézis (1-2 aminosav/nap), illetve automatizálásra is lehetőséget ad. Hátránya ugyanakkor, hogy a peptid izolálása és vizsgálata csak a gyantáról való lehasítás után lehetséges. A hibás szekvenciák elkerülése érdekében a kapcsolásoknak, hasításoknak majdnem 100%-os konverziójúnak kell lenniük. Ezt a már említett nagy reagensfelesleggel lehet elérni, 3-5 ekvivalens mennyiségű aminosav-származékot és az aktiváláshoz szükséges reagenseket jelent a gyantakapacításra nézve. A védett aminosavak kapcsolásához aktiválják az aminosav-származék karboxilcsoportját, ezzel elősegítve a peptidkötés kialakulását. Ehhez aktiváló reagenseket alkalmaznak, legáltalánosabban 1-hidroxibenztriazolt és valamilyen karbodiimid származékot (1. táblázat). A reakcióelegyben aktív észterek keletkeznek, amik in situ elreagálnak a növekvő peptidlánc szabad aminocsoportjával (in situ aktív észteres kapcsolás). 9

14 1. táblázat A peptidszintézis során használt aktiváló reagensek aktiváló reagensek rövidítés képlet 1-hidroxibenztriazol HOBt N, N -diizopropil-karbodiimid DIC A gyanta A gyanta felületén funkciós csoportok találhatók, melyekhez hozzákapcsolható a peptidlánc első aminosavának a karboxilcsoportja. A jó hordozó mechanikailag stabil, kémiailag pedig inert, valamint az alkalmazott oldószerekben jól duzzad, ezzel elősegítve a reagensek hozzáférhetőségét az épülő peptidlánchoz. A gyanta és a peptid közti kovalens kötésnek stabilnak kell lennie a szintézis során, ugyanakkor a kész peptidláncnak könnyen lehasíthatónak kell lennie a gyantáról. Többféle polimer hordozó (cellulóz, polivinil-alkohol, ioncserélő gyanták) közül, legjobbnak a klór-metilezett sztirol/1,4-divinilbenzol (1-2%) kopolimerje bizonyult. Ez a térhálós polimer gyanta kellőképpen porózus szerkezetű, ezzel elősegítve a reagensek számára az átjárhatóságot. 23 Manapság már többféle gyantát is forgalmaznak, melyek különböző funkciós csoportokat vagy funkcionalizált linkereket tartalmaznak. Ezek lehetővé teszik a szilárdfázisú szintézisek sokoldalú alkalmazását. 10

15 2.2.2 A szilárdfázisú peptidszintézis stratégiái A szilárdfázisú peptidszintézisnek két általánosan használt típusa van: Boc/Bzl stratégia, ahol az aminosav-származékok α-aminocsoportját terc-butiloxikarbonil-csoporttal látják el, míg az oldallánc védőcsoportok többsége benzil-csoporton alapuló védőcsoport 24 Fmoc/ t Bu stratégia, ahol az aminosav-származékok α-aminocsoportját 9-fluorenil-metiloxikarbonil-csoporttal védik, az oldalláncokat pedig terc-butil (ill. tritil) típusú védőcsoportokkal 25 Az alkalmazott stratégiát a szintetizálandó peptid szekvenciája és/vagy a rendelkezésre álló eszközök határozzák meg. A munkám során Fmoc/ t Bu stratégiát alkalmaztam, így a következő fejezetben ezt fogom részletezni Fmoc/ t Bu stratégia Az Fmoc/ t Bu módszer esetén a savas körülmények között érzékeny aminosavak (Cys, Met, Trp, Tyr) oxidációja és alkileződése elkerülhető a szintézis során, így az ilyen aminosavakat tartalmazó szekvenciák szintézisére ez a módszer az előnyösebb. Az aminosav-származékok α-aminocsoportját 9-fluorenil-metiloxikarbonil-csoporttal (Fmoc) védik, míg az oldalláncok funkciós csoportjainak védésére főleg terc-butil-típusú védőcsoportokat alkalmaznak. Az Fmoc-csoport savakkal szemben stabil, de bázisokkal szemben nem, így hasítása 20-55%-os piperidin/dmf oldattal történhet (4. ábra). A hasítás során dibenzofulvén keletkezik, ami igen reaktív és bizonyos aminosavakat képes alkilezni, de a piperidinnel stabil adduktot képez, ezzel elkerülve a mellékreakciókat. 11

16 4. ábra Fmoc-Asp(O t Bu)-Tyr( t Bu) Rink Amid MBHA gyanta Kísérletek során igazolták, hogy a leghatékonyabb hasítóelegyként 2% piperidin és 2% 1,8-diazabiciklo[5,4,0]-undek-7-ént (DBU) tartalmazó DMF oldat alkalmazható. Ez az elegy gyorsan és hatékonyan hasítja le az átmeneti védőcsoportot, még térbeli gátlás esetén is, valamint csökkenti az enantiomerizációt is. 26 Az aminosav-származékok kapcsolásához DIC és HOBt aktiváló reagenseket használnak, a gyantakapacitáshoz viszonyítva 3-5 ekvivalensnyi mennyiségben. A gyantáról való lehasítással egy időben az állandó védőcsoportokat is lehasítják, ehhez 80-95%-os TFA oldatot használnak (4. ábra). A felszabadult karbokationok miatt gyökfogókat (kation befogó) kell alkalmazni. Gyökfogóként alkalmazható többek között víz, triizopropil-szilán (TIS). Ennél a stratégiánál is többféle gyanta áll rendelkezésre a szintetizálandó peptidtől függően. A gyanták polisztirol-1,4-divilbenzol kopolimer alapúak, a savérzékenységük fokozására pedig megfelelő linkereket alkalmaznak. A Wang-, a SASRIN- és a 2-klórtritil gyanta a hasítás után a C-terminálison karboxil véget, míg a Rink Amid típusú gyanták (pl. Rink Amid MBHA) amid végű peptidláncot eredményeznek. 12

17 2.2.4 Kapcsolási reakciók ellenőrzése A szintézis során a hiányos szekvenciák elkerülése érdekében a reakciók sikerességét ellenőrizni kell. Kaiser-teszt során a szabad, elreagálatlan aminocsoportokat tartalmazó peptidek ninhidrinnel jellegzetes kék színű reakciót adnak (5. ábra). A teszt során a gyantaszemekhez pár csepp ninhidrin-, KCN- és fenol-oldatot adnak, majd 4-5 percen keresztül 104 C-on melegítik. Ha az oldat színe nem változik (sárga marad), akkor az a szabad aminocsoportok hiányát jelenti, tehát a kapcsolás sikeres volt. Abban az esetben, ha az oldat, illetve a gyantaszemek kékek lesznek, újrakapcsolásra van szükség. A teszt már 1% szabad aminocsoport jelenlétében is pozitív tesztet ad (intenzív kék színű lesz). 27 Fmoc/ t Bu stratégia esetén, a gyantaszemeken előfordulhat, hogy csak barnás színeződés figyelhető meg. 5. ábra Kaiser-teszt Prolinhoz történő kapcsolás után, a Kaiser-teszt során izatint is adnak a gyantához, mivel a prolin egy iminosav, ami szintén reagál ninhidrinnel, de a keletkező termék színe sárga, így az oldat színe nem változik meg az elreagálatlan prolin jelenlétében sem. Izatin hozzáadásával, sikertelen kapcsolás esetén a gyantaszemek vöröses-barnás színűek lesznek (6. ábra) ábra Prolin reakciója izatinnal 13

18 2.3 Fág könyvtáras peptidek A fágbemutatás (phage display) eljárást (7. ábra) George P. Smith alkotta meg, ezzel kísérleti körülmények között a fehérjék irányított in vitro evolúcióját megteremtve. 29 Az eljárás során a vizsgálni kívánt fehérje génjét egy bakteriofág burokfehérjegénhez kapcsolják, így fúziós fehérjék keletkeznek, amelyek beépülnek a fág burkába. Az idegen fehérje és a génje a fágon keresztül fizikailag kapcsolt, az idegen fehérje génje a fágrészecske belsejében található, ezzel párhuzamosan a fágrészecske külsején megjelenik az idegen fehérje. Az irányított evolúció során a gén pontosan megszabott kodonját változtatják meg. Egyidejűleg számos kodon is megváltoztatható, valamint megszabható a mutációk helye és pozíciónkénti variabilitása. A módszer során több milliárd variánst tartalmazó DNS-könyvtárakat hoznak létre, ezeket baktériumokba juttatják, ezzel létrehozva a fág-fehérje könyvtárakat. Minden fág csak egyfajta fehérjevariáns génjét hordozza. A módszer során több milliárd kísérletet végeznek párhuzamosan. A biológiai hatás szempontjából megfelelő fág-fehérje variánsokat, a megfelelő gén szekvenálásával azonosítják. A módszer előnye, hogy nem függ a bonyolult sejtfüggő mechanizmusoktól, bármilyen baktériumban termeltethető fehérjével lehet dolgozni, valamint a szelekció is kontrollált. A módszer segítségével fehérje- vagy peptidvariánsok szelekciójára is lehetőség nyílik ábra A fágbemutatás sémája A kutatómunkánkhoz olyan fág könyvtárból kiválasztott peptideket kerestünk, amelyek nagy szelektivitással ismerik fel a HT-29 humán vastagbéltumor sejtjeit. Zhang és munkatársai egy elemből álló heptapeptideket tartalmazó fág könyvtárat vizsgáltak. Ez a mennyiség lefedi az összes heptapeptid variációs lehetőséget és minden variáció kb. 100 fág klónt tartalmaz. Három szelekciós ciklus végére 5, HT-29 sejtre specifikus klónjuk volt, melyekből véletlenszerűen választottak ki 50 fág-klónt, amelyek között viszonylag kevés átfedés volt. A HT-29 sejtekhez legnagyobb szelektivitással kötődő CP15 variáns a VHLGYAT heptapeptid szekvenciát tartalmazta. Kutatások során ez a peptid a vastagbélrák tumorsejtjeihez kötődött, de normál bélhámsejtekhez nem. Kiderült többek között az is, hogy irányító tulajdonsága, akkor is megmarad, ha a szekvenciát továbbépítik

19 Bár azt még nem tudják, hogy milyen receptorhoz kötődik, és milyen módon jut be a sejtekbe, de nagyfokú specifikussága miatt irányító molekulaként használható a HT-29 vastagbél tumort célzó irányított tumorterápiában. 2.4 Korábbi eredmények Korábbi munkám során, amelyet a XXXII. OTDK-n mutattam be, az alap szekvencia (Dau=Aoa-VHLGYAT-NH 2 ), illetve annak enzimlabilis távtartóval hosszabbított (Dau=Aoa- GFLG-VHLGYAT-NH 2, Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAT-NH 2 ) szekvenciáinak daunomicinnel készült konjugátumait szintetizáltam és vizsgáltam. Megállapítottam, hogy a kiválasztott peptid alkalmas a hatóanyag HT-29 sejtekbe juttatására, valamint azt is igazoltuk, hogy irányító tulajdonsága továbbépítése esetén is megmarad. A három konjugátum közül a Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAT-NH 2 konjugátum bizonyult a leghatékonyabbnak. Ugyanakkor lehetőséget láttunk további szerkezet optimálásra, mivel a Zhang és munkatársai által alkalmazott fágbemutatásos módszer három szelekciós ciklusa során nagy veszteségek léptek fel, valamint a véletlenszerűen kiválasztott klónok miatt nem biztos, hogy a leghatékonyabban kötődő szekvenciákat sikerült kiválasztaniuk a kutatóknak. Továbbá a katepszin B enzimre a legfontosabb lizoszómális enzim, ami részt vesz a receptor-mediált sejtbejutás után a konjugátumok lebontásában hasadó spacer beépítése és a hatóanyag kapcsolása is befolyásolhatja az irányító molekula receptorkötődését, így esetleg más szekvenciájú peptidek hatékonyabbak lehetnek a célzott tumorterápiában. 15

20 3 Célkitűzések A munkám célja a már korábban említett Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAT-NH 2 konjugátumban az irányító peptid szekvenciájának optimálása volt, illetve az előállított új konjugátumok biológiai vizsgálata. A szerkezet optimálását két lépésben terveztem megvalósítani. Első lépésben a klasszikus alanin-szkennelést kívántam végrehajtani, mely során az eredeti szekvenciából egy-egy aminosavat alaninra cserélve, hat új szekvenciát tartalmazó peptidet terveztem előállítani. Majd az így nyert leghatékonyabb peptid szekvenciáját pozícionális-szkenneléssel terveztem tovább optimalizálni. Ennek során abban a pozícióban, ahol az aminosav variálható, az alanint további, különböző karakterű aminosavakra szándékoztam cserélni. Így végül további nyolc új peptid előállítását terveztem. Célom volt: Az eredeti peptid konjugátum (Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAT-NH 2 ) alaninszkenneléssel előállított variánsainak szintézise: Az így előállítandó hat új szekvencia: Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAA-NH 2, Dau=Aoa-LRRY-VHLGAAT-NH 2, Dau=Aoa-LRRY-VHLAYAT-NH 2, Dau=Aoa-LRRY-VHAGYAT-NH 2, Dau=Aoa-LRRY-VALGYAT-NH 2, Dau=Aoa-LRRY-AHLGYAT-NH 2 Az előállított konjugátumok in vitro citosztázisának és sejtfelvételének vizsgálata. Az alanin-szkennelés eredményei alapján további nyolc módosított szekvenciájú peptid szintézise, ahol a korábbi alanint kicserélem más, eltérő karakterű aminosavakra (Lys, Glu, Leu, Phe, Ser, Thr, Asn, Pro). Az újabb nyolc peptid-hatóanyag konjugátum in vitro biológiai vizsgálata, illetve a különböző módosítások hatásainak tanulmányozása, összehasonlítása. 16

21 4 Eredmények A munkám során előzetes célkitűzéseimnek megfelelően, HT-29 humán vastagbél tumorspecifikus peptid-hatóanyag konjugátumok szintézisével és az irányító peptid egység szerkezetének optimálásával foglalkoztam. A klasszikus alanin-szkennelés során előállítottam hat új peptidet, illetve ezeknek az aminooxiacetilezett származékait, amelyekhez később oxim-kötéssel daunomicint konjugáltam. Továbbá az így előállított konjugátumok in vitro biológiai vizsgálata során nyert eredmények alapján további szerkezet optimálás céljából pozícionális-szkenneléssel előállítottam még nyolc peptid-hatóanyag konjugátumot. Az így kapott tizennégy konjugátum in vitro citosztatikus hatását MTT-teszttel vizsgáltuk HT-29 sejteken. Több konjugátum sejtbejutási képességét is vizsgáltuk áramlási citométer (FACS) és fluoreszcens mikroszkóp segítségével. A kapott eredményeket összehasonlítottuk egymással és következtetéseket vontunk le az eredményekből. 4.1 Az alanin-scan során szintetizált konjugátumok Az aminooxiecetsavat tartalmazó peptidek szintézise A peptidek szintézisét Fmoc/ t Bu stratégiával Fmoc-Rink Amid MBHA gyantán manuálisan végeztem. Az Fmoc-védőcsoportot 2% piperidin-2% DBU/DMF eleggyel hasítottam, az aminosavakat lépésenként DIC/HOBt kapcsoló reagensekkel DMF-ben építettem be a peptidláncba. A kapcsolási reakciókban a gyantakapacitásra számolt három ekvivalens mennyiségű aminosav-származékot és aktiváló reagenst használtam. Az eredeti VHLGYAT szekvenciához képest minden esetben külön-külön adott aminosav-származékot alaninra cseréltem. Minden szekvencia végére LRRY tetrapeptid spacert építettem, a megfelelő védett aminosavakból, végül izopropilidén védett aminooxiecetsavat kapcsoltam a peptidek N- terminálisára. A kész peptideket 95% trifluorecetsav (TFA), 2,5% desztillált víz és 2,5% TIS (triizopropil-szilán) elegyével hasítottam a gyantáról. A hasítóelegy hatására a védőcsoportok (az izopropilidén kivételével) is lehasadnak (8. ábra). A kapott nyerstermékeket folyékony nitrogénben fagyasztottam le a liofilizáláshoz. 17

22 8. ábra Az alanin-szkennelés során előállított izopropilidén védett aminooxiecetsavat tartalmazó szekvenciák (1-6) A nyersterméket fordított fázisú nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiával (RP-HPLC) tisztítottam, majd liofilizáltam. Az izopropilidén-csoportot liofilizálás után, 0,2 M NaOAc pufferben (ph= 5,08) oldva etoxiaminnal reagáltattam, hogy az aminooxiecetsavról az izopropilidén-csoportot eltávolítsam. A nyers aminooxiacetilezett peptideket (9. ábra) ismét RP-HPLC-vel tisztítottam. A kapott közti terméket nitrogénben fagyasztottam, majd liofilizáltam. 9. ábra Az alanin-szkennelés során előállított aminooxiecetsavat tartalmazó szekvenciák (7-12) Az aminooxiacetilezett peptidek konjugálása daunomicinnel A tisztított peptideket 0,2M NaOAc pufferben (ph= 5,08) feloldottam (10 mg/ml - peptid koncentráció) és két ekvivalensnyi daunomicint adtam hozzájuk. A konjugálás szobahőmérsékleten, állandó kevertetés mellett egy éjszaka alatt végbement. A reakció során oxim-kötés alakult ki az aminooxiecetsav és a daunomicin 13-as C-atomja között (10. ábra). 18

23 10. ábra Az előállított konjugátumok (13-18) A reakció előrehaladtát analitikai HPLC-vel követtem, majd a teljes átalakulás után a termékeket preparatív RP-HPLC-vel tisztítottam. A tisztított termékeket tömegspektrometriával azonosítottuk (2. táblázat). 2. táblázat A konjugátumok (13-18) analitikai adatainak összefoglalása vegyület R t (perc) M számolt (g/mol) M mért (g/mol) Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAA-NH 2 (13) 28,0 1899,8 1899,9 Dau=Aoa-LRRY-VHLGAAT-NH 2 (14) 27,4 1837,5 1837,8 Dau=Aoa-LRRY-VHLAYAT-NH 2 (15) 28,6 1943,6 1943,9 Dau=Aoa-LRRY-VHAGYAT-NH 2 (16) 27,2 1887,5 1887,8 Dau=Aoa-LRRY-VALGYAT-NH 2 (17) 29,0 1863,5 1864,0 Dau=Aoa-LRRY-AHLGYAT-NH 2 (18) 27,7 1901,5 1901,8 A táblázat a Függelék ábrái alapján készült. 19

24 In vitro citosztázis meghatározása A citosztatikus hatás meghatározásához a tumorsejteket 24 órán át kezeltük a konjugátumokkal, majd a sejteket mostuk a sejtek által fel nem vett konjugátum eltávolítására, ezután további 48 órárán át inkubáltuk a sejteket 37 C-on. Ezt követően a vegyületek in vitro citosztatikus hatását MTT-teszttel határoztuk meg. Az MTT-t (3-(4,5-dimetilazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid) az élő sejtek mitokodriumában található dehidrogenáz enzim képes átalakítani formazán származékká (11. ábra). Ez a formazán származék lila színű kristályos anyag, DMSO-ban oldódik, és kolorimetriásan vizsgálható. 11. ábra Az MTT átalakulása a dehidrogenáz enzim hatására A citosztázis mértékét százalékosan, az alábbi képletből kapjuk meg: Az abszorbancia értékeit λ=540 nm-en mérjük, a λ=620 nm referencia hullámhossz értékeit kivontuk a λ=540 nm-en mért értékekből. A képletben az A kezelt sejtek a kezelt sejtek, az A kontroll sejtek a kontroll sejtek esetében mért abszorbancia. Ha a citosztázis mértékét a koncentráció függvényében ábrázoljuk, a kapott görbe segítségével meghatározható az a koncentrációérték (IC 50 ), amely a sejtek 50%-át gátolja az osztódásban. 20

25 3. táblázat Az előállított konjugátumok in vitro citosztatikus hatása HT-29 sejteken vegyület citosztázis (IC 50 ; μmol) Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAT-NH 2 46,9 9,4 Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAA-NH 2 (13) 70,9 3,8 Dau=Aoa-LRRY-VHLGAAT-NH 2 (14) >100 Dau=Aoa-LRRY-VHLAYAT-NH 2 (15) 24,1 1,6 Dau=Aoa-LRRY-VHAGYAT-NH 2 (16) >100 Dau=Aoa-LRRY-VALGYAT-NH 2 (17) 36,8 0,4 Dau=Aoa-LRRY-AHLGYAT-NH 2 (18) >100 Az in vitro citosztázis vizsgálatok alapján megállapítható, hogy (3. táblázat) a Tyr (14), Leu (16), Val (18) cseréje a szekvenciában nem megengedett. A, Thr (13), Gly (15) és His (17) aminosavakat ki lehet cserélni anélkül, hogy a citosztatikus hatás jelentősen csökkenjen, sőt bizonyos esetekben a hatás növekedését tapasztaltuk. Az alanin-szkennelés eredményeként azt tapasztaltuk, hogy a Gly/Ala cserével (15) lehetett előállítani a legjobb citosztatikus hatású Dau-peptid konjugátumot In vitro sejtbejutási vizsgálatok áramlási citometriával és fluoreszcencia mikroszkópiával Az előállított konjugátumok sejtbejutását áramlási citométerrel vizsgáltuk. A HT-29 sejteket 3 órán keresztül inkubáltuk a konjugátumokkal (13-18). Az inkubációs idő lejárta után a sejteket tripszineztük, annak érdekében, hogy a sejteket a lemezről eltávolítsuk és így a sejtfelszínen aspecifikus kötődést lehetővé tévő sejtfelszíni struktúrákat is eltávolítottuk, ezáltal csak a sejtekbe bejutott konjugátumok fluoreszcenciáját detektáljuk. A kapott fluorszcencia intenzitás eltolódásának nagyságából tudunk következtetni az in vitro sejtbejutás mértékére. A fluoreszcencia intenzitás mértéke közelítőleg arányos a konjugátum formában felvett daunomicin mennyiségével (12. ábra, bal oldala). A 12. ábra jobb oldalán az látható, hogy az élő sejtek hány százaléka tartalmazza a Dau-tartalmú konjugátumot, azonban ez az érték kevésbé releváns a felvett összes konjugátum mennyiségére. 21

26 Fluoreszcencia intenzitás Dau+ sejtek [%] M KK06/2 KK11 KK12 KK13 KK14 KK15 KK16 eredeti T/A Y/A G/A L/A H/A V/A 100 M KK06/2 KK11 KK12 KK13 KK14 KK15 KK16 eredeti T/A Y/A G/A L/A H/A V/A 12. ábra Az in vitro sejtbejutás A kapott értékek (12. ábra) a His/Ala csere (17) kivételével korrelálnak a citosztázis mérési eredményekkel. A sejtbejutási vizsgálatok során a Gly/Ala cserével (15) jelentős javulást értünk el a fluoreszcencia intenzitást illetően kb. kétszeresére nőtt a mért intenzitás, az eredeti konjugátumhoz képest. A Thr/Ala csere (13) szintén követi az MTT tesztek által tapasztaltakat, vagyis közel azonos fluoreszcencia intenzitással rendelkezik ez a konjugátum, mint az alapmolekula. A daunomicin pozitív sejtek arányának vizsgalátánál is megállapíthatjuk, hogy a Gly/Ala cseréje (15) bizonyult a legeredményesebbnek. A His/Ala csere (17) esetén bár az IC 50 érték csökkenését mértük, azonban nem ismert okok miatt a referencia konjugátumhoz képest csökkent mind a fluoreszcencia intenzitás, mind a daunomicin pozitív sejtek aránya. Tehát az áramlási citometriás mérések alpján is megállapíthatjuk, hogy a Gly/Ala cseréjével (15) érhetjük el a legeredményesebb változtatást az alapszekvencia szerkezetében. Ennek az aminosavcserének hatékonyságát fluoreszcens mikroszkóp segítségével is igazoltuk. Az első kísérletben a sejteket 3 órán át kezettük a konjugátumok 100 M koncentrációjú oldatával. 22

27 Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAT-NH 2 Dau=Aoa-LRRY-VHLAYAT-NH 2 (15) ; 3 óra ; 3 óra 13. ábra Az in vitro sejtbejutás vizsgálata fluoreszcens mikroszkóp segítségével (bal oldalon: az eredeti konjugátum; jobb oldalon: az alanin-szkennelés során leghatékonyabbnak bizonyuló konjugátum) A fluoreszcens mikroszkóp felvételek (13. ábra) alapján azt tapasztaltuk, hogy a Gly helyett Ala-t tartalmazó konjugátum esetén már pusztoló sejtek is látszanak ezen koncentráció mellett az adott inkubációs idő végén. Ez az utóbbi konjugátum nagyobb citosztatikus hatásával magyarázható. Annak érdekében, hogy a két anyag sejtfelvételében mutatkozó különbséget jobban demonstráljuk, a sejtfelvételt alacsonyabb konjugátum koncentráció mellett és rövidebb ideig tartó inkubációs idővel is tanulmányoztuk (14. ábra). Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAT-NH 2 Dau=Aoa-LRRY-VHLAYAT-NH 2 (15) ; 30 perc ; 30 perc 14. ábra Fluoreszcens mikroszkóp felvételek bal oldalon: az eredeti konjugátum; jobb oldalon: az alanin-szkennelés során leghatékonyabbnak bizonyuló konjugátum 23

28 Ebben a kísérletben egyértelműen látszik, hogy a HT-29 sejteket 20 M koncentrációjú konjugátum oldattal kezelve 30 percig, jelentősebb sejtbejutást tapasztaltunk a Gly helyett Ala-t tartalmazó konjugátum esetében, mint az eredeti szekvenciát tartalmazó konjugátumnál. Így a további szerkezetmódosítási kísérletekhez ezt a szekvenciát vettük alapul. 4.2 A további szerkezet optimálás során előállított konjugátumok szintézise Az aminooxiecetsavat tartalmazó szekvenciák szintézise Az alanin-szkenneléssel előállított konjugátumok in vitro biológiai vizsgálata alapján, azt a következtetést vontuk le, hogy a Gly/Ala csere eredményezte a leghatékonyabb konjugátumot, így ebben a pozícióban az aminosav cseréje megengedett. Ezért úgy döntöttünk, hogy ebbe a pozícióba további, különböző karakterű (bázikus, savas, poláros, apoláros) aminosavakat építünk be, hogy vizsgáljuk ezek hatását a biológiai aktivitásra. Ennek megfelelően nyolc további származékot szintetizáltam, amelyekben az eredeti szekvenciában lévő glicin helyére Lys, Glu, Ser, Thr, Asn, Leu, Phe, Pro aminosavakat építettünk be egyenként. A szintézist ebben az esetben is Fmoc/ t Bu stratégiával Fmoc-Rink Amid MBHA gyantán végeztem. Az Fmoc-védőcsoportot 2% piperidin-2% DBU/DMF eleggyel hasítottam, a megfelelő aminosav-származékokat DIC/HOBt keverékével kapcsoltam, itt is a gyantakapacitás alapján kiszámolt háromszoros mennyiségeket használtam. A védett peptidgyantát, amely már tartalmazta a peptid C-terminálisát (Fmoc-Tyr-Ala-Thr-gyanta) nyolcfelé osztottam, a nyolcadokat pedig az adott szekvenciáknak megfelelően folytattam. Ez esetben is minden peptid N-terminálisára LRRY enzimlabilis spacert építettem a megfelelő védett aminosavakból végül izopropilidén védett aminooxi-ecetsavat kapcsoltam a szekvenciákhoz. Az így kapott peptideket (15. ábra) a gyantáról hasonlóan a korábbiakhoz trifluorecetsavval hasítottam, desztillált víz és TIS jelenlétében. Az izopropilidén-csoport kivételével ekkor az összes többi védőcsoport is hasadt a peptidről. Az így kapott anyagot liofilizáltam. 24

29 15. ábra A szerkezet pozíciós-szkenneléssel történő optimálása során előállított védett aminooxiecetsavat tartalmazó szekvenciák (19-26) A nyersterméket ebben az esetben is RP-HPLC-vel tisztítottam, majd folyékony nitrogénben lefagyasztottam és liofilizáltam. Az izopropilidén-csoportot liofilizálás után, 0,2 M NaOAc pufferben (ph= 5,08) oldva etoxiaminnal távolítottam el. A szabad aminooxiacetil-csoporttal rendelkező peptideket (16. ábra) ismét RP-HPLC-vel tisztítottam, majd liofilizáltam. 16. ábra A szerkezet pozíciós-szkenneléssel történő optimálása során előállított szabad aminooxiecetsavat tartalmazó szekvenciák (27-34) Az aminooxiacetilezett peptidek konjugálása daunomicinnel Az aminooxiecetsavat tartalmazó peptideket minden esetben 0,2 M NaOAc pufferben (ph= 5,08) konjugáltam a daunomicinhez 10 mg/ml - peptid koncentráció alkalmazásával. A liofilizált peptideket két ekvivalensnyi daunomicinnel együtt oldottam fel, majd egy éjszakán át, állandó keverés mellett, szobahőmérsékleten kapcsoltam. Oxim-kötés kialakításával a daunomicin 13-as C-atomja és az aminooxiecetsav aminocsoportja kapcsolódott össze (17. ábra). 25

30 17. ábra Az előállított konjugátumok (35-42) A reakció előrehaladtát analitikai HPLC-vel követtem, majd a teljes átalakulás után a termékeket preparatív RP-HPLC-vel tisztítottam. A tiszta peptidet tömegspektrometriával és analitikai HPLC-vel analizáltam (4. táblázat). 4. táblázat A konjugátumok (35-42) analitikai adatainak összefoglalása vegyület R t (perc) M számolt (g/mol) M mért (g/mol) Dau=Aoa-LRRY-VHLKYAT-NH 2 (35) 28,2 2000,7 2000,8 Dau=Aoa-LRRY-VHLEYAT-NH 2 (36) 29,3 2001,6 2001,8 Dau=Aoa-LRRY-VHLLYAT-NH 2 (37) 31,1 1985,7 1986,0 Dau=Aoa-LRRY-VHLFYAT-NH 2 (38) 31,2 2019,7 2019,8 Dau=Aoa-LRRY-VHLSYAT-NH 2 (39) 28,9 1959,6 1959,8 Dau=Aoa-LRRY-VHLTYAT-NH 2 (40) 29,0 1973,6 1974,0 Dau=Aoa-LRRY-VHLNYAT-NH 2 (41) 29,0 1986,6 1986,9 Dau=Aoa-LRRY-VHLPYAT-NH 2 (42) 31,2 1969,7 1970,1 A táblázat a Függelék ábrái alapján készült In vitro citosztázis meghatározása A citosztatikus hatás meghatározásához 24 órán át kezeltük a vizsgálandó konjugátummal a tumorsejteket. A kezelés után a sejteket mostuk annak érdekében, hogy a sejtek által fel nem 26

31 vett konjugátumot eltávolítsuk, majd 48 órán át 37 C-on inkubáltuk a sejteket. A vegyületek in vitro citosztatikus hatását a fejezethez hasonlóan MTT-teszttel határoztuk meg. 5. táblázat Az előállított konjugátumok in vitro citosztatikus hatása HT-29 sejteken vegyület citosztázis (IC 50 ; μmol) Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAT-NH 2 39,4 5,9 Dau=Aoa-LRRY-VHLAYAT-NH 2 (15) 27,9 6,4 Dau=Aoa-LRRY-VHLKYAT-NH 2 (35) 50,3 3,0 Dau=Aoa-LRRY-VHLEYAT-NH 2 (36) 29,5 6,2 Dau=Aoa-LRRY-VHLLYAT-NH 2 (37) 7,5 3,5 Dau=Aoa-LRRY-VHLFYAT-NH 2 (38) 6,6 2,9 Dau=Aoa-LRRY-VHLSYAT-NH 2 (39) 24,8 7,4 Dau=Aoa-LRRY-VHLTYAT-NH 2 (40) 21,7 6,5 Dau=Aoa-LRRY-VHLNYAT-NH 2 (41) 28,0 19,4 Dau=Aoa-LRRY-VHLPYAT-NH 2 (42) >50 Az eredmények három független kísérlet értékei (egy kísérlet során négy párhuzamos mérést végeztünk). Az in vitro citosztázis vizsgálatok (5. táblázat) során jól megállapítható sorrend alakult ki az egyes módosítások között, ami az alábbiak szerint alakult: Látható, hogy Pro (42) esetén jelentős volt a citosztatikus hatás csökkenése, feltehetően szerkezeti változás okozta a hatáscsökkenést ezen konjugátum esetén. Bázikus tulajdonsággal rendelkező aminosav esetén (Lys (35)) ugyancsak a citosztatikus hatás csökkenését figyeltük meg, mind az eredeti (Gly), mind az alanin-szkennelés során kiválasztott (15) konjugátumhoz képest. A Glu-t (36), Asn-t (41), Ala-t (15) tartalmazó konjugátumok esetén figyelembe véve a szórásokat közel azonos hatást értünk el, mely hatás csak kis mértékben volt jobb, mint az eredeti (Gly) Dau-peptid konjugátumé. Az előzőeknél minimálisan, de nem szignifikánsan jobb eredményt mutatott a Thr-t (40) és a Ser-t (39) tartalmazó konjugátum. A két leghatásosabb a Leu-t (37), valamint Phe-t (38) tartalmazó peptid-hatóanyag konjugátumok háromszor-négyszer voltak hatékonyabbak, mint az előző csoportba tartozó vegyületek. 27

32 Az eredmények alapján megállapíthatjuk, hogy nagyobb apoláros oldalláncot tartalmazó aminosav beépítésével nő a citosztatikus hatás, ugyanakkor megfigyeléseink alapján biológiai körülmények között (az alkalmazott médiumban) ezen vegyületek oldhatósága kisebb volt a többi vizsgált vegyületéhez képest. További érdekesség, hogy amennyiben összevetjük a Ser-t (39), poláros aminosavat illetve az Ala-t (15) apoláros aminosavat tartalmazó peptid-hatóanyag konjugátumokat, melyek között csupán egy hidroxi-csoport különbség van, láthatjuk, hogy ez a változtatás nem befolyásolja lényegesen a citosztatikus hatást, ellenben a hidroxi-csoport megjelenése jelentősen növeli az oldhatóságot, és így a konjugátum biohasznosíthatóságát. 6. táblázat Az aminosavak hidrofilitása aminosav Engleman ** Kyte és Doolittle ** Hopp és Woods * Phe apoláros 3,7 2,8-2,5 Met apoláros 3,4 19, -1,3 Ile apoláros 3,1 4,5-1,8 Leu apoláros 2,8 3,8-1,8 Val apoláros 2,6 4,2-1,5 Cys poláros 2,0 2,5-1,0 Trp apoláros 1,9-0,9-3,4 Ala apoláros 1,6 1,8-0,5 Thr poláros 1,2-0,7-0,4 Gly apoláros 1,0-0,4 0,0 Ser poláros 0,6-0,8 0,3 Pro apoláros -0,2-1,6 0,0 Tyr poláros -0,7-1,3-2,3 His (+) töltés -3,0-3,2-0,5 Gln poláros -4,1-3,5 0,2 Asn poláros -4,8-3,5 0,2 Glu (-) töltés -8,2-3,5 3,0 Lys (+) töltés -8,8-3,9 3,0 Asp (-) töltés -9,2-3,5 3,0 Arg (+) töltés -12,3-4,5 3,0 * Kisebb érték az erősebb hidrofób jelleg ** Nagyobb érték az erősebb hidrofób jelleg A pirossal jelőlt aminosavakat beépítettük a pozíciós-szkennelés során, a kékkel jelöltek további vizsgálatokhoz tett módosítási javaslatok. 28

33 Amennyiben a kapott eredményeket összevetjük három gyakran használt hidrofilitási skálával (6. táblázat), észrevehetjük, hogy minél inkább hidrofób karakerű aminosavat alkalmaztunk, annál inkább nőtt a citosztatikus hatás. Azt is megállapíthatjuk, hogy bár a Glu ezeken a skálákon a leghidrofilabbak között szerepel, mégis azonos hatást ért el hidrofób aminosavakkal (Ser, Asn, Ala), mivel biológiai körülmények között protonált formában van jelen, tehát poláros tulajdonságú, de nem ionos karakterű. Ezen adatok alapján nem magyarázott a Pro-t (42) tartalmazó konjugátum citosztázis értéke, itt feltehetően a gátolt rotáció a nitrogén és a 2-es helyzetű szén atom között okozza a kedvezőtlen hatást. A gátolt rotáció merev szerkezetet, esetenként töréseket okoz a konformációban, így gátolva a peptidhatóanyag konjugátumnak a receptorhoz való hozzáférhetőségét/kötődését. A fenti meggondolások alapján a későbbiekben érdemes ebben a pozicióban Trp, Met, Val, Tyr, valamint Ile aminosavakat beépíteni, illetve azok biológiai hatását vizsgálni. Valamint az oldhatóság növelése érdekében a fentebb említett médiumban való oldódási problémák miatt célszerű lehet az apoláros jellegű aminosavat tartalmazó peptid-hatóanyag konjugátumok további módosítása (pl. oligo(etilén-glikol)), mely így lehetőséget adhat jobb biológiai hatás elérésére. A sejtbejutási vizsgálatok ezen anyagokból folyamatban vannak. 29

34 5 Kísérleti rész Az aminosav-származékokat és a gyantát az Iris Biotech GmbH-tól (Marktrewitz, Németország) szereztük be, a gyökfogókat, kapcsolószereket és hasítószereket a Sigma- Aldrich Kft.-től (Budapest, Magyarország) vásároltuk. Az (CH 3 ) 2 C=Aoa-OH vegyületet magunk állítottuk elő. A daunomicin hidroklorid az IVAX (Budapest, Magyarország) ajándéka volt. Az N,N-dimetil-formamidot és diklórmetánt a Molar Chemicals Kft.-től (Budapest, Magyarország), a HPLC-hez használt oldószert (acetonitril) a VWR International Kft-től (Debrecen, Magyarország) vettük. A dolgozatomban szereplő peptideket manuálisan, szilárdfázisú peptidszintézissel állítottam elő az alábbi protokollt követve (7. táblázat). 7. táblázat Fmoc/ t Bu stratégia protokollja művelet alkalmazott oldószerek és reagensek időtartam (perc) Mosás DMF 3 x 0,5-1 Fmoc-csoport hasítása 2% piperidin 2% DBU/DMF 2 x 2 1 x 5 1 x 10 Mosás DMF 8 x 0,5-1 Kapcsolás 3 ekv. aminosav-származék + 3 ekv. DIC + HOBt/DMF 1 x 60 Mosás DMF 3 x 0,5-1 DCM 3 x 0,5-1 Kaiser-teszt Ninhidrin-oldat, KCN-oldat, fenololdat (izatin oldat) 1 x 3-5 A Kaiser-teszt során a gyantaszemekhez pár csepp ninhidrin- (2,5 g ninhidrin 50 ml absz. EtOH-ban oldva), fenol- (40 g fenol 10 ml absz. EtOH-ban oldva), és KCN-oldatot (2 ml 0,01 M KCN-oldat 98 ml piperidinnel hígítva) adunk Pro utáni aminosav kapcsolása után izatin-oldatot (3% izatin + 5% Boc-Phe-OH benzilalkoholban oldva) is adunk az elegyhez, majd 104 C-on 3-5 percig melegítjük. Ha a gyantaszemek színe sárga marad a kapcsolás sikeres volt, ellenben ha megkékül (izatin esetén megbarnul), akkor maradt szabad aminocsoport, tehát a kapcsolást meg kell ismételni. 30