Magas mortalitású tumoros betegségek célzott kezelésére alkalmas biokonjugátumok és moduljaik fejlesztése

Átírás

1 Magas mortalitású tumoros betegségek célzott kezelésére alkalmas biokonjugátumok és moduljaik fejlesztése NVKP_ Mező Gábor MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport MEDInPRT Konferencia Budapest

2 PÁLYÁZATI FELHÍVÁS NEMZETI VERSENYKÉPESSÉGI ÉS KIVÁLÓSÁGI PRGRAM KÓDSZÁM: NVKP_16 A alprogram (Kiemelkedő halálozási kockázattal járó betegségek gyógyításának eredményességét lényegesen javító nemzeti program) B alprogram (Anyagtudományi, technológia nemzeti program) C alprogram (Víz-egészség-élelmiszer nemzeti program)

3 Miért foglalkozunk a daganatos megbetegedésekkel? Évente kb ember hal meg rákos megbetegedésben Magyarországon; A daganatos betegségekben meghaltak 40 százaléka 65 év alatti; A 65 év alattiak esetében a vezető halálok; Az elmúlt harminc évben közel 30 százalékkal nőtt, miközben az Unió országaiban folyamatosan csökkent;

4 A tíz leggyakoribb daganatos megbetegedés és leggyakoribb halált okozó rák típus

5 A rák terápiás kezelései Sebészeti beavatkozás: Jól hozzáférhető, jól körülhatárolt tumorokra Nem alkalmas: hematológiai tumorokra (leukémia) metasztázisok kezelésére Sugárkezelés (radioterápia): szilárd tumorok leukémia esetén is

6 Kemoterápia cisplatin doxorubicin vinblasztin 5-fluoruracil metotrexát kamptotecin taxol

7 A kemoterápia mellékhatásai Kemoterápiás szerek: a gyorsan osztódó sejtekre hatnak (tumorsejtek) de hatnak a normális körülmények között gyorsan osztódó sejtekre is és károsítják azokat pl. csontvelő (vérképző szerv) sejtjei, emésztőszervek hajhagymákat tartalmazó tüsző A kemoterápia legáltalánosabb mellékhatásai: - mieloszuppresszió (vérsejtek képződésének csökkenése) - immunszuppresszió (érzékenység fertőző betegségekre) - mukozitisz (bél és emésztő rendszer gyulladása, hányás) - alopecia (foltos hajhullás) Egyedi toxikus hatások: kardiotoxicitás, veseelégtelenség, ödémásodás, májfunkció zavarai, terratogén (magzat károsító) hatás

8 A terápia fokozott szelektivitásának lehetősége az egészséges sejtek és a tumorsejtek különbségén alapul Néhány különbség az egészséges és tumorsejtek, szövetek között: Sejtfelszíni (pl. tumorspecifikus vagy túltermelődött receptor) egészséges sejt tumorsejt Sejtbeni (pl. enzimek, egyéb fehérjék eltérő mennyiségben, minőségben) katepszin B mátrix metallopeptidáz 9 (MMP9) Lokalizálható szilárd tumorok (pl. újonnan kialakult vérerek)

9 Gélelektroforézis Western Blot fehérje analízis Műszerpályázat HT-29 vastagbél tumorsejteken a GnRH-III kezelés nem befolyásolja szignifikánsan az EGFR szintet.

10 Monoklonális antitestek terápiás alkalmazása Új erek képződésének feltétele: VEGF (vaszkuláris endoteliális növekedési faktor) kötődése receptorához (VEGF-R) Új erek képződésének gátlása: VEGF mennyiségének csökkentése a receptorhoz kötődés megakadályozása bevacizumab (Avastin ) - monoklonális VEGF antitest - angiogenezis gátlása

11 Regisztrált molekulárisan irányított szerek Név Típus Támadáspont Indikáció Alemtuzumab (Mabcampath) Monoclonal antibody, humanized CD52 CLL, CML Daclizumab Monoclonal IgG1, chimeric IL-2 R rák, leukemia (Zenapax) Basiliximab Monoclonal IgG1, chimeric IL-2 R (Simulect) Rituximab Monoclonal IgG1, chimeric CD20 rák, lymphoma (Rituxan/Mabthera) Trastuzumab (Herceptin) Gemtuzumab Monoclonal IgG1, humanized Monoclonal IgG4, humanized HER2/neu CD33 emlő-, prosztatarák, NSCLC rák, leukemia Ibritumomab (Y 90 ) Calicheamicinnel konjugált Monoclonal IgG1, murine CD20 rák, lymphoma Edrecolomab Gefitinib Imatinib Monoclonal IgG2, murine EGFR-TKI KIT-TKI EpCAM EGFR TK TK CRC NSCLC GIST, CML

12 Gonadotropin Releasing Hormon - GnRH Andrew Victor Schally Roger Guillemin 1977-ben megosztott orvosi Nobel Díj "for their discoveries concerning the peptide hormone production of the brain" Human GnRH-I (LH-RH): Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH disznó hipotalamuszából kivonva és tisztítva: 800 mg

13 A Gonadotropin Releasing Hormon szerepe Peptide hormon, hipotalamuszban termelődik és pulzálva kiválasztódik A reprodukciót kontrollálja, a hipofízisben lévő gonadotróp sejtek stimulálása útján A gonadotropin hormonok termelődésének és kiválasztásának stimulálása - luteinizáló hormon (LH) (sárgatest hormon) heterodimer glikoprotein ( aminosav) - follikulusz stimuláló hormon (FSH) heterodimer glikoprotein ( aminosav) tesztoszteron ösztrogén Szex-szteroidok Hormonfüggő tumorok kialakulásában fontos szerepük van Férfiaknál tesztoszteron

14 Agonista és antagonista peptidek alkalmazása a tumorterápiában Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH 2 Agonista: [D-Lys 6 ]-GnRH-I Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH 2 Antagonista: Cetrorelix X Ac-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH 2 Nal: 2-naftilalanin Cpa: p-klór-fenilalanin Pal: 2-piridilalanin Cit: citrulin nem természetes aminosavak A B GnRH agonista GnRH antagonista szérum hormon szint szérum hormon szint A szérum hormon szint csökkentése a kasztrációs szint alá (kémiai kasztráció) nap óra

15 Tumorspecifikus célbajuttatás GnRH (LHRH) receptoron keresztül GnRH receptorok tumorsejteken: > 50% emlődaganat ~ 100% melanoma > 70% petefészekrák > 90% prosztatarák > 75% méhtestrák > 80% vesedaganat > 40% agytumor > 90% non-hodgkin limfóma tartalmaz GnRH receptorokat. GPCR GnRH receptorok megtalálhatók egészséges szövetekben is, különösen a szaporító szervekben, de sokkal kisebb mértékben, mint a tumorsejteken.

16 GnRH receptorok a tumorsejteken GnRH-I GnRH-II Számos tumorsejten nagy mennyiségben Egészséges sejteken nem vagy csak kis mennyiségben fordul elő A GnRH peptidek hatása a tumorsejteken egy bonyolult folyamat GnRH-R G ai RPTK p38 JNK PTP P GRB 2 SS RAS AP-1 c-jun P EGFR PI3K AKT RAF MAPKK P MAPK P Sejt osztódás c-fos TCF P

17 Célzott tumorterápia: szelektív hatóanyag célba juttatás irányító molekulákkal konjugált hatóanyag összekötő irányító molekula receptor-közvetített endocitózis szabad hatóanyag konjugált hatóanyag összekötő irányító molekula receptor hatás helye vezikula szabad hatóanyag lizoszóma endoszóma hatás helye tumorsejt egészséges sejt Mező G, Manea M. Expert pinion on Drug Delivery 7, (2010)

18 Antibody Drug Conjugates (ADCs) Adcetris (Seattle Genetics, Bothell, WA) brentuximab vedotin antimitotikus hatású (tengeri kagylóból izolálták)

19 Antibody Drug Conjugates (ADCs) Kadcyla (Genentech, South San Francisco, CA) Mertansine (emtansine, tubulin inhibítor) Trastuzumab (HER2 receptor ellenanyag) DM1/Mab ~ 3,5 DM1 4-(maleimidylmethyl) cyclohexane-1-carboxylate

20 Doxorubicin-[D-Lys 6 ]-GnRH-I (AEZS-108, AN-152) Zoptarelin doxorubicin (AEterna Zentaris Inc.) [D-Lys 6 ]-GnRH-I Doxorubicin [D-Lys 6 ]-GnRH-I egy GnRH-I agonist analog Észter-kötéssel kapcsolják a Doxorubicinhez Klinikai Fázis II-ben vizsgálják, emlő, petefészek és méh daganatokra Észter-kötés gyors lebomlása humán szérumban (t 1/2 ~ 2 óra) karboxil-észterázok hatására

21 GnRH-III a nagy tengeri ingolából izolált GnRH analog GnRH-I: Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH 2 GnRH-III: Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH 2 A GnRH receptor(ok)hoz kötődik a tumor sejteken szor kisebb az endokrin hatása emlősökön, mint a humán GnRH-I Tumorellenes hatását kimutatták emlő, prosztata, méh, hasnyálmirigy, vastagbél daganat sejeteken GnRH-III: Hatásos szállító molekula lehet az irányított tumorterápiában

22 Daunorubicin-GnRH-III konjugátumok tervezése GnRH-III: Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH 2 e NH 2 a Lys 8 e-aminocsoportja felhasználható konjugálásra a Lys 8 bázikus oldalláncának módosítása nem eredményezi a receptor kötődés és az antiproliferatív hatás elvesztését, de tovább csökken a hormon hatása Daunorubicin (Daunomicin) kemoszelektív ligáció: oxim-, hidrazon-kötés H antraciklin antibiotikum, a rák gyógyításában alkalmazott szer (e.g., leukémia, neuroblastoma) DNA interkaláció; topoizomeráz II inhibitor CH 3 H amid-kötés Toxikus mellékhatások: CH 3 H NH 2 H - emésztőrendszer, vese, máj, bőr toxicitás, stb. - immunszupresszió, mieloszupresszió - kardiotoxicitás CH 3 Kovács M., et al. Peptides 28, (2007) Mező, G., Manea M.: Prot. Pept. Lett. 24, (2013)

23 Az oxim-kötést tartalmazó Dau-GnRH-III konjugátumok lebomlása Katepszin B enzim hatására Szabó, I., et al. Bioconjug. Chem., 20, (2009) Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH 2 N--CH H 2 -C- H N--CH 2 -C- H-Lys-H H H CH 3 H NH 2 CH 3 H NH 2 H CH 3 H CH 3 Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH 2 H N--CH 2 -C-Gly-Phe-Leu-Gly- H N--CH 2 -C-Gly-H H H CH 3 H NH 2 CH 3 H NH 2 H H CH 3 CH 3 Citosztatikus hatás (IC 50 mm) MCF-7 (humán emlő): 7,8 ± 2,1 HT-29 (humán vastagbél): 17,9 ± 4,0 MCF-7 (humán emlő): 3,9 ± 1,2 HT-29 (humán vastagbél): 22,5 ± 1,7

24 Daunorubicin és daunorubicint tartalmazó metabolitok kötődése csirke eritrocita DNS-hez Anyag K (x 10 5 ) (M -1 ) n Dau 11,70 2,5 Dau=Aoa-H 2,21 3,8 H-Lys(Dau=Aoa)-H 6,80 3,0 Dau=Aoa-Gly-H 6,74 3,5 Dau=Aoa-Arg-H 6,78 3,2 Dau=Aoa-Tyr-H 4,40 3,5 Dau=Aoa-Leu-H 3,23 3,6 GnRH-III(Dau=Aoa) 0,83 4,2 K: kötődési állandó; n: kizárási paraméter Dau CH közelsége gátolja a kötődést Bázisos aminosav (esetleg ikerionos szerkezet miatt) segíti a kötődést Nagy térkitöltésű oldalláncot tartalmazó aminosav gátolja a kötődést rbán E., et al. Amino Acids 41(2): (2011) rbán E., et al. Bioconjugate Chemistry 22(10): (2011)

25 Antraciklinek konjugálása GnRH-III hormon peptidhez H <EHWSHDWKPG-NH 2 N--CH 2 -C-GFLG- H hasadás lizoszómális enzimekkel savlabilis lizoszómákban ph < 5 H H <EHWSHDWKPG-NH 2 N-NH-C-CH 2 -CH 2 -C- CH 3 H NH 2 CH 3 H NH 2 H H CH 3 oxim-kötés hidrazon-kötés CH 3 <EHWSHDWKPG-NH 2 H H -C-(CH 2 ) 3 -C- H H hasadás észterázokkal CH 3 H <EHWSHDWKPG-NH 2 NH-C-(CH 2 ) 3 -C-Y- CH 3 H észter-kötés CH 3 NH 2 H amid-kötés CH 3 H Mező, G., Manea, M. et al. (2008) Curr. Med. Chem. 15, 2366

26 PABC spacert tartalmazó konjugátum lebomlása Katepszin B enzim hatására GnRH-III p-aminobenziloxikarbonil (PABC) Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH 2 Katepszin B Ac-Cys S (CH H 2 ) 5 Phe-Lys- N N H Daunorubicin (Dau) H NH H H 2 N Katepszin B 37 C, ph 5 H H NH H H 2 N 1,6-elimináció + + H C Dau H Me Me

27 A szabad Dau és hatóanyag - GnRH-III konjugátumok in vitro citosztatikus hatása MCF-7 and HT-29 tumorsejtvonalakon Vegyület Citosztázis (MCF-7) IC 50 (µm) Citosztázis (HT-29) IC 50 (µm) Daunorubicin 0,4 ± 0,1 0,3 ± 0,2 Dau-GnRH-III (hidrazon) 0,5 ± 0,2 2,4 ± 0,5 Dau-PABC-GnRH-III 0,4 ± 0,0 1,7 ± 0,2 Dox-GnRH-III (észter) 0,1 ± 0,1 2,4 ± 0,2 Dox-[D- 6 Lys]-GnRH-I (észter) 0,2 ± 0,1 1,9 ± 0,3 Dau-GnRH-III (amid) > 100 > 100 Az in vitro citosztatikus hatást (IC 50 értékek) MTT teszttel mértük. MTT = 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid Mező, G. et al. (2008) Curr. Med. Chem., 15(23): ; Szabó, I et al. (2009) Bioconjug. Chem., 20(4): ; rbán, E. et al. (2010), Amino Acids, 41(2), ; Schlage, P. et al. (2011) J. Control. Release 156(2),

28 Daunorubicin-GnRH-III biokonjugátumok rövidszénláncú zsírsavakkal Glp-His-Trp-Lys(X)-His-Asp-Trp-Lys(Dau=Aoa)-Pro-Gly-NH 2 acetil propionil izo-butiril butiril krotonil izo-valeril hexanoil mirisztoil Manea, M. et al. (2011) Bioconjug. Chem. 22(7): Hegedüs, R. et al. (2012) Eur. J. Med. Chem. 56(10):

29 Primer tumor tömeg (g) Dau-GnRH-III konjugátumok antitumor hatása orthotopikus HT-29 vastagbél modellen Máj tömegek (g) Tumorok tömege a terminálás napján (50. nap) Máj tömegek a terminálás napján (50. nap) 1,6 1,6 1,4 1,4 1,2 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 100 % 70,3 % 92,9 % P=0, ,6 % 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 100 % 89,1 % 102,2 % 105,0 % 0,0 Kontroll Dau Lys-Ac Lys-nBu 0,0 Kontroll Dau Lys-Ac Lys-nBu Daunorubicin: heti egy alkalommal (7x1 mg/ttkg) Konjugátumok: heti két alkalommal (5x15 mg Dau-tartalom/ttkg, 8x 7,5 mg/ttkg) Proliferációs index: konjugátumok (15%-kal csökken), Dau (nincs változás) Vaszkularizáció: konjugátumok (30-40%-kal csökken), Dau (12%-kal nő) Metasztázis gátlás: nincs

30 Hogyan növelhető a hatóanyag peptid konjugátumok hatása? Korlátok: A receptorok száma a tumorsejteken limitált. Ezért a biokonjugátumok mennyiségének növelése önmagában nem megoldás. Lehetséges megoldások: Azonos vagy különböző hatóanyagok kapcsolása egy irányító molekulához. Több különböző receptoron keresztül történő sejtbe juttatás két vagy több hatóanyag irányító molekula konstrukcióval. receptor 1 receptor 2 irányító molekula 1 hatóanyag molekula 1 irányító molekula 2 hatóanyag molekula 2

31 Biokonjugátum tervezés biokonjugátumok két azonos tumorellenes hatóanyaggal Glp-His-Trp-Lys-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH 2 Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH 2 e NH e NH Lys H N N H H a NH N e NH N H CH 3 H H H H CH 3 CH 3 H H H H CH 3 H NH 2 H NH 2 H NH 2 H NH 2 Anyagok MCF-7 IC 50 [µm] HT-29 IC 50 [µm] LNCaP IC 50 [µm] Daunorubicin 0,4 ± 0,1 0,2 ± 0,2 0,1 ± 0,1 GnRH-III[ 4,8 Lys(Dau=Aoa)] 2,9 ± 0,9 6,8 ± 1,0 4,9 ± 0,3 GnRH-III[ 8 Lys(Dau=Aoa-Lys(Dau=Aoa))] 3,0 ± 0,4 5,6 ± 2,0 3,8 ± 1,6 GnRH-III[ 8 Lys(Dau=Aoa)] 6,7 ± 1,9 29,9 ± 0,6 15,2 ± 2,4 Leurs, U. et al. (2012) Biopolymers Pept. Sci. 98:1 10

32 Biokonjugátum tervezés biokonjugátumok két különböző tumorellenes hatóanyaggal Glp-His-Trp-Lys-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH 2 Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH 2 N N N N N H e NH H e NH N H H H CH 3 N N N N N H a NH H Lys e NH N H H H CH 3 H 2 N N NH 2 H NH 2 H 2 N N NH 2 H NH 2 Anyagok MCF-7 IC 50 [µm] LNCaP IC 50 [µm] HT-29 IC 50 [µm] Daunorubicin 0,4 ± 0,1 0,1 ± 0,1 0,2 ± 0,2 Methotrexate n,d, 0,3 ± 0,2 1,4 ± 0,6 GnRH-III[ 4 Lys(MTX), 8 Lys(Ac)] > 50 > 50 > 50 GnRH-III[ 4 Lys(MTX), 8 Lys(Dau=Aoa)] 5,8 ± 1,1 28,8 ± 4,7 3,6 ± 1,5 GnRH-III[ 8 Lys(MTX-Lys(Dau=Aoa)] 5,4 ± 0,7 11,3 ± 0,5 5,6 ± 3,0 GnRH-III[ 8 Lys(Dau=Aoa)] 6,7 ± 1,9 15,2 ± 2,4 29,9 ± 0,6 Leurs, U. et al. (2012) Eur. J. Med. Chem. 52:

33 Horizon MAGICBULLET MSCA-ITN-2014-ETN: Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Networks (ITN-ETN) ELTE, rszágos nkológiai Intézet Univeristy of Helsinki Bielefeld Cologne Milan Como Bayer, Heidelberg Pharma, Exiris, Italpharmaco,

34 Primer tumor tömege (g) Máj tömegek (g) Új hatékonyabb GnRH-III daunomicin konjugátum K2: Glp-His-Trp-Lys(Bu)-His-Asp-Trp-Lys(Dau=Aoa)-Pro-Gly-NH 2 P19-H: Glp-D-Tic-Lys(Bu)-His-Asp-Trp-Lys(Dau=Aoa)-Pro-Gly-NH 2 1,2,3,4-tetrahidroizokinolin-3-karbonsav (Tic) 1,0 Átlag ± SD, Mann-Whitney teszt 1,2 Átlag ± SD, Mann-Whitney teszt 0,9 0,8 1,0 0,7 0,6 0,8 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 100% P = 0, ,6% P = 0, ,0% 0,6 0,4 0,2 100% P = 0, ,7% 115,7% 104,8% 0,0 Kontroll N=11 9,0% Dau N=5 K2 N=5 P19-H N=5 0,0 Kontroll N=11 Dau N=5 K2 N=7 P19-H N=5 Terminálás a tumor transzplantációt követő 34. napon A Dau csoportot előbb - a 30. napon - kellett terminálni

35 Potenciális konjugátumok a MAGICBULLET projekt keretében kriptoficin GnRH, szomatosztatin RGD-, NGR- peptidek a-anamitin paclitaxel auristatin

36 Konzorcium az NVKP_ pályázat megvalósítására Ft támogatás Mező Gábor MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport Csámpai Antal ELTE Kémiai Intézet Kőhidai László Semmelweis Egyetem Bertók Béla ComInnex Zrt

37 A projekt célja Kiemelkedő halálozási kockázattal járó betegségek gyógyításának eredményességét lényegesen javító nemzeti program Hazánk versenyképességének szempontjából stratégiai jelentőségű kutatásfejlesztési és innovációs tevékenységeket, illetve az azok keretében jelentős szellemi hozzáadott értéket tartalmazó piacképes termékek, szolgáltatások, technológiák létrehozását támogatja Célzott tumorterápia hatóanyag irányító molekula kapcsoló elem linker

38 Vegyülettárak, amelyek számos, nagy variációs lehetőséget tartalmazó modult tartalmaznak és alkalmasak személyre szabott, illetve kombinációs célzott tumorterápiára funkcionalizált hatóanyag bifunkciós linker funkcionalizált irányító molekula funkcionalizált hatóanyag bifunkciós linker funkcionalizált irányító molekula funkcionalizált hatóanyag bifunkciós linker funkcionalizált irányító molekula

39 Vastagbél tumorsejthez (HT-29) kötődő peptidek kiválasztása fág-bemutatás technikával Szekvencia 2-3 szelekciós lépés után Fág könyvtár VHLGYAT kiválasztott peptid Ismétlés 2-3-szor Vastagbél tumorsejt Dau=Aoa-VHLGYAT-NH 2 Mosás Kötődés E. coli-ban való kifejeztetés Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAT-NH 2 Dau=Aoa-GFLG-VHLGYAT-NH 2 Nem kötődött fágok Kötődött fágok Eluálás Dau: daunomicin fág klón felhasználásával, 50 kiválasztott, amelyek kevés és csak dipeptid szakasz homológiát mutattak Zhang Y., et al. (2007) J. Biomol. Screen. 12, Aoa: aminooxiacetil GFLG, LRRY: Katepszin B enzim által hasítható szekvenciák

40 Hatékonyabb konjugátum kiválasztása Ala-szken segítségével Dau=Aoa-LRRY- V A V V V V V H H A H H H H L L L A L L L G G G G A G G Y Y Y Y Y A Y A A A A A A A T T T T T T A -NH 2 Kód Konjugátum Citosztázis (IC 50 (mm)) (24 órás kezelés + 48 óra) KK06/2 Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAT-NH 2 50,5 ± 5,5 KK11 Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAA-NH 2 60,9 ± 3,1 KK12 Dau=Aoa-LRRY-VHLGAAT-NH 2 > 100 KK13 Dau=Aoa-LRRY-VHLAYAT-NH 2 14,0 ± 1,5 KK14 Dau=Aoa-LRRY-VHAGYAT-NH 2 > 100 KK15 Dau=Aoa-LRRY-VALGYAT-NH 2 26,8 ± 0,4 KK16 Dau=Aoa-LRRY-AHLGYAT-NH 2 > 100

41 Konjugátumok sejtfelvételének tanulmányozása áramlási citométerrel (3 órás kezelés) fluoreszcencia int. Dau+ sejtek [%] HT mm 100 mm KK06/2 KK11 KK12 KK13 KK14 KK15 KK16 HT mm 100 mm KK06/2 KK11 KK12 KK13 KK14 KK15 KK16

42 Konjugátumok sejtfelvételének vizsgálata fluoreszcens mikroszkóppal KK06/2 15 perc KK13 15 perc c=20 mm c=20 mm KK06/2 30 perc KK13 30 perc c=20 mm c=20 mm

43 Dau=Aoa-LRRY- -NH 2 V V V V V V V H H H H H H L L L L L L A S P F K E Y Y Y Y Y Y A A A A A A A T T T T T T H L Y T L További módosítások a 4. pozícióban a hatás fokozása érdekében

44 In vitro citosztázis Konjugátum Citosztázis * 24 óra (IC 50 SD; mm) Dau=Aoa-LRRY-VHLGYAT-NH 2 39,4 5,9 Dau=Aoa-LRRY-VHLAYAT-NH 2 27,9 6,4 Dau=Aoa-LRRY-VHLKYAT-NH 2 50,3 3,0 Dau=Aoa-LRRY-VHLEYAT-NH 2 29,5 6,2 Dau=Aoa-LRRY-VHLLYAT-NH 2 7,5 3,5 Dau=Aoa-LRRY-VHLFYAT-NH 2 6,6 2,9 Dau=Aoa-LRRY-VHLSYAT-NH 2 24,8 7,4 Dau=Aoa-LRRY-VHLTYAT-NH 2 21,7 6,5 Dau=Aoa-LRRY-VHLNYAT-NH 2 28,0 19,4 Dau=Aoa-LRRY-VHLPYAT-NH 2 >50 F L T S A N E G K P

45 Dau+ sejtek [%] Fluoreszcencia int. In vitro sejtbejutási vizsgálatok Dau=Aoa-LRRY-VHLAYAT-NH 2 Dau=Aoa-LRRY-VHLFYAT-NH 2 Dau=Aoa-LRRY-VHLSYAT-NH 2 Dau=Aoa-LRRY-VHLPYAT-NH ,25 12, c / mm 6,25 12, c / mm

46 Egy üst reakcióban kialakított konjugátum ClAc-GFLG-PABC-Np DMF - 0,1 M Tris puffer 8:2 (V/V) ph 8, szobahő, 5 óra daunomicin ciklo[rgdfc] ciklo[rgdfc(ch 2 C-GFLG-PABC-Dau)]

47 Támogatók NK K K MSCA-ITN-2014-ETN: Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Networks (ITN-ETN) NVKP_ Szinergia program Műszer pályázat

48 Köszönöm a figyelmet!