Tumorellenes hatóanyagok irányított célbajuttatása peptidekkel

Átírás

1 Tudományos Diákköri Dolgozat HEGEDÜS RÓZSA Tumorellenes hatóanyagok irányított célbajuttatása peptidekkel Témavezető: Dr.Mező Gábor tudományos tanácsadó Szerves KémiaiTanszék Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2008

2 Tartalomjegyzék 1. Bevezetés, irodalmi áttekintés Daganatterápia Sebészeti beavatkozás Sugárterápia Immunterápia Hormonterápia Kemoterápia Irányított terápia Gonadotropin releasing hormon (GnRH) A Gonadotropin releasing hormon típusai GnRH-I GnRH-II MI-1892: H-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys-Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-H2)- DEA GnRH-III A vinka alkaloidok Vinka alkaloidok hatásmechanizmusa Daunorubicin Peptidszintézis Lépésenkénti szilárdfázisú peptidszintézis (SPPS) A SPPS két általánosan alkalmazott stratégia: Boc/Bzl stratégia Fmoc/ t Bu stratégia: Kapcsolási reakciók követése A peptidek hasítása a gyantáról Célkitűzések Eredmények Peptidek szintézise A H-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac)-Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-H 2 )-DEA előállítása A H-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac-Cys-Gly-Phe-Leu-Gly)-Asp(Leu-Gln-Pro-D- Ala-H 2 )-DEA előállítása A Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys(Aoa-Gly-Phe-Leu-Gly-Cys)-Pro-Gly-H 2 (GnRH-III(Aoa-GFLGC)) előállítása Biokonjugátumok előállítása A Br-Vindolin-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac)-Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala- H 2 )-DEA előállítása A Br-Vindolin-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac-Cys-Gly-Phe-Leu-Gly)- Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-H 2 )-DEA előállítása A [Br-Vindolin-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Gly-Leu-Phe-Gly-Cys)-Asp-(Leu-Gln- Pro-D-Ala-H 2 )-DEA] 2 dimer előállítása A Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys(Aoa-Gly-Phe-Leu-Gly-Cys)-Pro-Gly-H GnRH-III(Dau=AoaGFLGC) konjugátum dimerizálása Biológiai vizsgálatok: A konjugátumok in vitro citosztatikus hatásának meghatározása MTT teszt alkalmazásával Kísérleti rész...32

3 4.1. H-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac)-Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-H 2 )-DEA szintézise, tisztítása, analízise A H-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac-Cys-Gly-Phe-Leu-Gly)-Asp((Leu-Gln-Pro-D-Ala- H 2 )-DEA szintézise, tisztítása, analízise GnRH-III(Aoa-GFLGC) (Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys(Aoa-Gly-Leu-Phe-Gly- Cys)-Pro-Gly-H 2 ) molekula szintézise, tisztítása, analízise Konjugátumok szintézise A Br-Vindolin-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac)-Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala- H 2 )-DEA szintézise, tisztítása, analízise: A Br-Vindolin-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac-Cys-Gly-Leu-Phe-Gly)-Asp- ((Leu-Gln-Pro-D-Ala-H 2 )-DEA szintézise, tisztítása, analízise A Br-Vindolin-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac-Cys-Gly-Leu-Phe-Gly)- Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-H 2 )-DEA dimerizálása, tisztítása, analízise GnRH-III(Aoa-GFLGC) molekula konjugálása daunorubicinhez, a konjugátum tisztítása, analízise GnRH-III(Aoa-GFLGC) Dau konjugátum dimerizálása, tisztítása, analízise Citosztatikus hatásvizsgálatok MTT teszt alkalmazásával Összefoglalás Rövidítés jegyzék Irodalomjegyzék...45

4 1. Bevezetés, irodalmi áttekintés A rák világszerte egyike a legfőbb halálozási okoknak. A statisztikák alapján a szív- és érrendszeri betegségek után a második leggyakoribb halálok ben 7,9 millió ember halt meg rákban és a WH ( Egészségügyi Világszervezet) becslései szerint a következő 10 évben 84 millió ember halálát okozza majd rákos megbetegedés, amennyiben nem tesznek megfelelő lépéseket ellene táblázat: A haláleseteket okozó főbb ráktípusok a WH adatai alapján 2007-ben: Daganat tüdő gyomor máj vastagbél Emlő Esetszám (millió) 1,4 0,866 0,653 0,677 0,548 Hazánkban is hasonló statisztikák születtek az elmúlt években (lásd függelék 2. táblázat) 2, amely a népességszámot figyelembe véve az egyik legrosszabb Európában. Az orvosok és a biológusok véleménye megegyezik abban, hogy a rák keletkezésének oka az egészséges sejtek szaporodásában és érésében fennálló szabályozási egyensúly megbomlása. 3 Ennek számos oka lehet (kémiai karcinogén anyagok; fizikai rákkeltők: például hő, dörzsölés; radioaktív sugárzás; onkogén vírusok), azonban a dolgozatomban részletesen ezekre nem térek ki. A munkám szempontjából sokkal fontosabb a már kialakult tumoros megbetegedések gyógyítása. Ezért az alábbiakban a terápiás módszereket foglalom össze röviden Daganatterápia 4 Egyetlen általános gyógymódot találni a tumoros megbetegedések kezelésére nem lehet, ugyanis a rák kifejezés egy betegség osztályra vonatkozik, amely mintegy 130 féle daganatos megbetegedés gyűjtőfogalma. A malignus daganatok kezelésére többféle lehetőség van a daganat helyétől, méretétől, a betegség stádiumától függően. A gyógyítás történhet sebészeti úton, kemo-, radio-, immun-, illetve hormonterápiával, vagy ezek kombinációjával. 5 Számos további rákkezelési lehetőség még kutatási fázisban van. A rák azonosítása után elsőként azt kell felmérni, hogy az milyen stádiumban van. Ezután dolgozható ki a terápia helyes stratégiája. A kezelések során a kóros sejtszaporodást próbálják kivédeni, pontosabban a sejtproliferációt megfékezni. Sajnos a jelenlegi gyógymódok nagy része ezáltal a normál sejtosztódást is érinti. 1

5 Sebészeti beavatkozás A daganatterápia során a legfőbb cél az, hogy a daganat teljes eltávolítása mellett ne okozzunk további sérülést a test egészséges szöveteiben. Ez gyakran megoldható sebészi beavatkozással, különösen a jól lokalizálható szolid tumorok esetén. A múlt században élt sebész professzor William Stewart Halsted által felállított modell szerint a daganat először lokálisan növekszik, majd átterjed a nyirokcsomókra, végül a teljes testre. A műtét sikerességét csökkentheti, ha a rák áttéteket képez távolabbi testtájakon, ugyanis ez esetben az összes tumoros szövetet nem lehet maradéktalanul eltávolítani. Ilyenkor a puszta szemmel nem látható rákos sejtek újra növekedésnek indulhatnak, és ezáltal kiújulhat a betegség. Sebészeti eljárást alkalmaznak például emlőrák esetén vagy prosztatarák esetén. A sebészeti beavatkozásnak a primer daganat eltávolításán kívül fontos szerepe van a betegség stádiumának megállapításában, továbbá, hogy megtudják a rák átterjedt-e már a szomszédos nyirokcsomókra Sugárterápia A sugárterápia (más néven radioterápia, röntgenterápia vagy sugárkezelés) a rákos sejtek elpusztításához és a tumor méretének csökkentéséhez ionizáló sugárzást használ. A sugárzást megpróbálják lokalizáltan irányítani, hogy csak a kezelni kívánt területet érintse. A kezelés során a kezelt terület sejtjei sérülnek, vagy pusztulnak el azáltal, hogy genetikai állományuk károsodást szenved, és képtelenné válnak a további növekedésre és osztódásra. A módszer hátrány, hogy a sugárzás a rákos és normál sejtekben is károsodást okoz. A sugárterápia célja az, hogy minél több rákos sejtet pusztítson el úgy, hogy közben minél kevesebb egészséges sejtben tegyen kárt. Emiatt a kezeléseket szakaszosan hajtják végre, hogy az egészséges szövetnek legyen elegendő ideje a gyógyulásra. A radioterápiát többféle szolid tumor kezelésére alkalmazzák (például agy-, emlő-, méhnyak-, gége-, tüdő-, hasnyálmirigy-, prosztata-, bőr-, gyomorrák vagy a lágyrészi szarkóma). A sugárkezelés használható leukémia és nyirokcsomódaganat kezelésére is. Az alkalmazott sugárzás dózisát számos tényező befolyásolja, mint például az egyes daganat típusok radioszenzitivitása, van-e a kezelendő terület közelében szövet vagy szerv, ami esetleg sérülhetne a sugárzás által. 2

6 Immunterápia A tumor immunterápia során a beteg saját immunrendszerét késztetik arra, hogy felvegye a harcot a daganat ellen. Jelenleg olyan vakcinák kifejlesztése a cél, amelyek specifikus immunválaszt adnak a rákos sejtek ellen. Ilyen gyógymódon dolgoznak például a malignus melanóma és a vese karcinóma ellen Hormonterápia Bizonyos hormonok túladagolásával vagy termelődésének direkt blokkolásával közvetlenül vagy több hormon egymásra hatásának folytán gátolhatjuk néhány tumortípus növekedését. A hormon-érzékeny tumorok közé tartoznak egyes emlő-, és prosztatarákok. Az ösztrogén és a tesztoszteron szint csökkentése gyakorta fontos kiegészítő kezelés a terápia során. A hormonkezelést gyakran alkalmazzák a sebészeti beavatkozás előtt a tumor visszafejlődése és jobb lokalizáltsága érdekében, vagy utána az esetleges metasztatizált tumorsejtek elpusztítására Kemoterápia A kemoterápia a rákos megbetegedések gyógyszerekkel ("antitumor hatású drogok") történő kezelésének típusa, amely során ezek a szerek elpusztítják a rákos sejteket. éhány citosztatikum a teljesség igénye nélkül: alkilezőszerek (DS szintézis gátlása, vagy hibás replikáció, pl. melfalán), antimetabolitok (a köztes anyagcsere vagy enzimek antagonistái, pl. metotrexát), antibiotikumok (interkalációs komplexek, a DS-be épülnek be, pl. daunorubicin), antimitotikumok (orsómérgek, az osztódási orsó kialakulását gátolják, pl. vinblasztin). 3 A kemoterápiás szerek különböző módokon zavarhatják meg a sejtosztódást például a DS megkettőződést vagy az újonnan létrejött kromoszómák szétosztását akadályozhatják. A citotoxikus drogok minden gyorsan osztódó sejttípusra hatnak. Ezáltal nem specifikusak a rákos sejtekre, bár kis fokú specifikusság származhat abból, hogy a rákos sejtek egy része nem lesz képes a hibás DS-ének kijavítására, ellentétben a normál sejtekkel. Ezen okok következtében a kemoterápia az egészséges szövetekre is káros lehet, különösen azokra, amelyek nagy arányban cserélődnek (például: bél hámsejtek). Ezek a sejtek a kemoterápiát követően kijavítják a kemoterápiás szer okozta károsodásaikat. Gyakran alkalmazzák ezeket a kemoterápiás gyógyszereket kombinációban, mert együtt 3

7 jobban hatnak az eltérő hatásmechanizmus miatt, mint külön-külön (kombinációs kemoterápia). Problémát okozhat azonban az, hogy a tumorsejtek rezisztensé válhatnak azokra a mérgekre, melyeket ellenük alkalmaznak (multidrog-rezisztencia, MDR). A kemoterápia a legáltalánosabban alkalmazott eljárás előrehaladott vagy áttételes rákos megbetegedések gyógyítására. A módszer hatékonyságát korlátozza a rákos sejtek kialakuló rezisztenciája, valamint a szelektivitás hiánya, mivel a kis molekulatömegű (kisebb, mint 1000 Da) hatóanyagok szabadon diffundálva a test minden szövetéhez eljuthatnak. Szintén problémát okoz a drog gyors kiürülése a véráramból, ami miatt néha nagy dózisokat kell alkalmazni, és ez jelentős toxikus mellékhatásokhoz vezethet. Az utóbbi években a rákkutatás azon megoldások felé fordult, amelyekkel, a hatóanyagokat sokkal szelektívebben, célzottan a tumorsejtekbe lehet juttatni. Így nagyobb hatékonyságú és kevesebb mellékhatással rendelkező terápiás eljárások születtek, amelyek többségének bevezetése jelentős áttörést jelenthet a 21. század tumorterápiájában Irányított terápia Az irányított terápia amivel a dolgozatomban kiemelten kívánok foglalkozni manapság a kutatások egy rendkívül aktív részét képezi. Az alapgondolat ( Magic Bullet ) az éppen 100 évvel ezelőtt obel-díjjal jutalmazott német kutatótól, Paul Ehrlichtől származik. Ehrlich célja az volt, hogy olyan kémiai anyagot találjon, amelynek a kórokozó organizmus iránt specifikus affinitása van. Ezt úgy képzelte el, hogy a hatóanyag, mint antitoxin megtámadja a toxint, és mágikus lövedékként egyenesen a célzott szervezethez jut el. Mégpedig úgy, hogy olyan sejtfelszíni oldalláncokhoz kapcsolódik, amelyek a metabolizmus termékek asszimilálása miatt jelennek meg. 7-9 Hosszú időnek kellett eltelnie addig, amíg ez az elv a gyógyászatban és különösen a tumorterápiában bevezetésre kerülhetett. A módszer ugyanis igényelte azt az ismeretet, amely jelentősen megkülönbözteti a rákos és egészséges sejtek felépítésében és működésében rejlő különbségeket, amelyek az irányított terápia célpontjai lehetnek. Először az 1990-es években vált lehetővé az ilyen jellegű kezelések alkalmazása, és vált jelentőssé egyes ráktípusok esetén. A terápia célkeresztjében a rákos sejtek szabályozás alól felszabadult fehérjéi állnak. A tumoros sejteknek egyedülálló biokémiai metabolizmusa van. Ezért a terápiás drogok általában a rákos sejtben található mutálódott, túlexpresszált vagy más okból kritikusnak számító fehérjék enzimatikus doménjeinek inhibitorai. Jelentős példái ennek a tirozin kináz inhibitorok pl. az imatinib és a gefitinib. Egy másik stratégia lehet a monoklonális antitest terápia, amelyben a terápiás ágens egy antitest, amely specifikusan kapcsolódik a rákos sejtek 4

8 egy bizonyos fehérjéjéhez. Ezen antitestekhez, mint irányító molekulákhoz további drog molekulák is kapcsolhatók a hatás fokozása érdekében. Az irányított terápiában célpontként olyan peptidhormon receptorok is szóba jöhetnek (mint pl.: GnRH, szomatosztatin, bombezin receptorai), amelyek a tumoros sejteken expresszálódnak nagy mennyiségben, és így citotoxikus ágenshez kötött peptid ligandumokkal célba vehetők. Mivel ezek a receptorok a tumoros sejteken sokkal nagyobb mennyiségben expresszálodnak, mint az egészséges sejteken, ezért segítségükkel jelentős szelektivitás érhető el a hatóanyagok rákos sejtbe juttatása során. A peptidhormonok és analógjaik a citotoxikus anyagot, mint hordozómolekula közvetlenül a tumorsejtekhez szállítják, így növelve a drog koncentrációt a tumoros sejtekben. Ezzel a módszerrel az egészséges sejtek megkímélhetők a drog felvételétől. Az irányított tumorterápia számos előnnyel bír: megnövekedett drog szelektivitás oldékonyság növelése a hatóanyag lassabb távozása a véráramból stabilitásnövekedés a normál lebontó folyamatokkal szemben retard/késleltetett hatás: egyenletes vérkoncentráció érhető el kontrollált hatóanyag felszabadulás csökkent toxikus mellékhatások a rákos sejtek multidrog-rezisztenciájának elkerülése Milyen molekulákkal vehetjük célba a sejteket? cukor molekulák lektinek receptor ligandumok antitestek hormonok lizoszóma Fluid endocitózis Diffúzió/aktív transzport Hatás kifejtés helye receptor Receptor mediált endocitózis lizoszóma degradáció degradáció 1. ábra: Hatóanyagok irányított célbajuttatásának mechanizmusa. 5

9 1.2. Gonadotropin releasing hormon (GnRH) A gonadotropin releasing hormon, vagy más néven luteinizáló hormon releasing hormon (LHRH) a hipotalamuszban képződő és szekretálódó dekapeptid hormon. A hipofízisen keresztül jut el az adenohipofízisbe, majd a GnRH receptorokhoz kapcsolódva szabályozza a gonadotróp hormonok (FSH, LH) szekrécióját. 10 Az FSH szabályozza az emberi szervezet növekedését, fejlődését, pubertáskori érését és a szaporodási folyamatokat. A nők esetén a FSH a petefészekben a primer follikulusokat (tüszőket) serkenti érésre, valamint az ösztrogén termelődését szabályozza. A tűsző növekedés hatására inhibin szabadul fel, amely leállítja az FSH termelődését. A férfiaknál a herében található Sertoli-féle dajkasejtek androgénkötő fehérjéinek termelődését fokozza ezáltal a spermatogenezisben is fontos szerepet tölt be. A LH hirtelen megnövekedése váltja ki a nők szervezetében az ovulációt. 11 A férfiak esetében a LH, vagy ICSH (intersticiális sejt stimuláló hormon) a Leydig sejtek tesztoszteron termelését stimulálja A Gonadotropin releasing hormon típusai Az előgerinchúrosokban és gerincesekben 23 GnRH variánst azonosítottak. Számos gerincesben 3 különböző GnRH-t és azok receptorait ismerték fel, amelyek eltérő módon oszlanak el a szervezetben, és funkciójuk is más és más. Az elsőként izolált Glp-His-Trp-Ser- Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-H 13 2 szekvenciájú emlős GnRH-nak már számos természetes analógját azonosították. Mivel a GnRH az emlősök szaporodásában rendkívül fontos szerepet játszik, ezért más állatfajok szervezetében is megpróbálták ugyanezen családba tartozó változatokat fellelni. A gerincesek szervezetében talált néhány GnRH-analógot a függelék 3. táblázatában foglaltam össze. Az összes típus megegyezik abban, hogy 10 aminosavból épül fel, és szekvenciájuk legalább 50%-a azonos. A különbségek az aminosavakban vannak. 14 Kezdetben azt gondolták, hogy az elsőkent felfedezett, a hipofízisben található GnRH az egyetlen fajtája az emlősökben megtalálható hormonnak. Ezért a későbbiekben, a további GnRH peptidek felfedezése után a humán GnRH-t nevezték el GnRH-I-nek, amely a mai napig párhuzamosan használatos az irodalomban a hgnrh es az LHRH jelölésekkel. Később egy újabb formáját is azonosították a hormonnak az emberi agyban és a perifériás szövetekben, amelyet azonban először a csirke agyból izolálták (innen a név: cgnrh). Ez a típus a halaktól az emberi szervezetig mindenhol azonos szerkezetben található meg, amely azt sugallja, hogy fontos szerepe és saját receptora(i) van(nak). Ez a típus kapta a GnRH-II 6

10 elnevezést. A harmadik típust a tengeri ingolában találtak meg (ingola/lamprey GnRH-III, lgnrh-iii), de az emberi szervezetben még nem mutatták ki. 15 Abból, hogy többféle megjelenési formája is fellelhető a GnRH-nak ugyanabban a szervezetben arra következtethetünk, hogy az egyes változatok más és más funkcióval rendelkeznek. A GnRH peptidek amellett, hogy lényeges szerepet töltenek be a neuroendokrin rendszer szabályozásában, lehetséges, hogy a központi idegrendszerben neurotranszmitterként és neuromodulátorként vagy néhány perifériás szövetben autokrin/parakrin faktorként szerepelnek GnRH-I A hipotalamusz neuronjaiban termelődő, onnan pedig pulzusszerűen a keringéssel a hipofízisbe kerülő GnRH-I tulajdonságait már korábban tárgyaltam. Ha alacsony dózisban pulzáló jelleggel adagolnak szintetikus GnRH-t hipogonadizmusban szenvedő nőknek és férfiaknak, akkor ezzel a terápiával visszaállítható a kezeltek termékenysége azáltal, hogy stimulálják az endogén GnRH termelődését, de magas dózisú GnRH vagy agonista analógok érzéketlenítik a gonádokat. Ezt a jelenséget széles körben alkalmazzák hormonfüggő megbetegedések kezelése során, ugyanis ilyenkor leáll a LH, FSH szekréció, a petefészek-, és here-funkciók (kémiai kasztráció), amelyek ezáltal nem termelnek szteroid hormonokat. Tumoros megbetegedések esetén ennek eredményeként a hormonfüggő tumor növekedése csökken. 12 Az emlős GnRH-t a célzott daganatterápiában is alkalmazhatjuk, mint hordozó molekulát, de endokrin hatása nem mindig kedvező a tumorterápiában. A kezdeti feltételezések alapján a GnRH analógok rákos sejtekre gyakorolt hatásukat indirekt módon a szex szteroidok gátlásával fejtik ki. A GnRH analógok különböző humán tumorsejtekre gyakorolt antiproliferatív hatása azt sugallja, hogy a tumoros sejteken található GnRH receptorokon keresztül direkt hatást is kifejtenek. Az elmúlt 30 évben több mint 3000 GnRH származékot állítottak elő, amelyek többsége GnRH-I agonista, illetve antagonista származék. Ezek közül számos vegyület bizonyult fontos terápiás eszköznek a nőgyógyászatban és az onkológiában. A tumorterápiában legáltalánosabban használt GnRH-I analógok a Triptorelin: [D-Trp 6 ]GnRH; Leuprolide, [D- Leu 6, Pro 9 -HEt]GnRH; Buserelin: [D-Ser( t Bu) 6, Pro 9 -HEt]GnRH (szuperagonisták) és Cetrorelix, Ganirelix, és az Abarelix (szuperantagonisták). 14,18 Az irányított tumorterápiával kapcsolatos kísérletekben pedig legáltalánosabban a [D-Lys 6 ]GnRH-I vegyületet használják, amelyben a Lys oldalláncához kapcsolnak drog molekulákat. Egy vegyület, amelyben 7

11 doxorubicint kapcsoltak észter-kötéssel glutársav spaceren keresztül a [D-Lys 6 ]GnRH-I peptidhez a klinikai kísérletek III. fázisában van jelenleg GnRH-II A GnRH-II (Glp-His-Trp-Ser-His-Gly-Trp-Tyr-Pro-Gly-H 2 ) a GnRH-I aminosav szekvenciájával 70%-ban megegyezik, de más gén kódolja. A peptidhormon megtalálható a központi idegrendszerben csakúgy, mint számos perifériás szövetben. Az agyban hasonlóan a GnRH I-hez, elsősorban a hipotalamuszban fordul elő, de különösen nagy mennyiségben expresszálódik a középagyban és a limbikus rendszer részeiben is. A perifériás szövetekben szignifikánsan nagyobb mennyiségben expresszálódik, mint az agyban. Megtalálható többek között a vesében, a csontvelőben, a prosztatában és a női szaporító szervekben. Ez az elterjedés neurotranszmitter/neuromodulátor funkciókra enged következtetni. A GnRH-II különböző feladatokat lát el a test különböző területein. A feltételezett feladatait a függelék 4. táblázatában foglaltam össze. Az, hogy a szervezetben ilyen széles körben megtalálható a hormon, arra sarkallta a kutatókat, hogy megkeressék a GnRH-II receptorát. Az eredmények azt mutatták, hogy hasonlóan az egyes típusú receptorhoz, ez is a 7TM doménnel rendelkező receptorok (GPCR) családjához tartozik. Ellentétben az előbbivel ez rendelkezik karboxil-terminális citoplazmatikus doménnel, amelyen számos treonin és szerin részlet található, amely részletek nyilvánvalóan foszforilációs helyek és így fontosak lehetnek a gyors deszenzibilizálásában, de a gyors internalizációban is. A 328 aminosavból álló GnRH-IR nem rendelkezik C-terminális citoplazmatikus végződéssel. 16,17 Ez lehet az oka annak, hogy a receptorok nem deszenzibilizálódnak olyan gyorsan és lassan internalizálódnak. Ez a különbség fontos lehet a hatóanyagok célzott sejtbejuttatása esetén. Feltételezhető, hogy a GnRH-IIR-ok alkalmasabbak lehetnek az irányító hormonmolekulához kapcsolt drog tumorsejtbe juttatására. A GnRH-II receptorhoz 20 a GnRH II nagy specifitással kapcsolódik, míg a GnRH-I csak kis mértékben és fordítva: a GnRH-IR jobban köti a GnRH-I hormont, mint a GnRH-II-t. A lgnrh-iii és a lazacból származó sgnrh is kötődik mind az I-es mind a II-es típusú receptorhoz, és aktiválja azokat. A GnRH-II hormon és annak receptora a szaporító szervek tumoros szöveteiben is megtalálható. Ezen szövetekben antiproliferatív tulajdonsága már bizonyított. Humán petefészekből és méhnyálkahártyából izolált sejteken kimutatták, hogy a GnRH-II és 8

12 agonistái jelentősen nagyobb mértékben gátolják a sejtproliferációt, mint a GnRH-I agonistái. Az antagonisták közül egy molekulát szeretnék kiemelni, amelyet Mező Imre állított elő korábban. 21 Ezt az MI-1892 kóddal jelzett GnRH-II antagonistát használtam fel GnRH-drog konjugátumok előállítására MI-1892: H-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys-Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-H2)- DEA Kis koncentrációban adagolva in vitro (10 nm-1 μm koncentráció) LH szekréció nem történt. Kis LH kibocsátás volt tapasztalható miután 10 μm MI-1892-t adagoltak 3 perces pulzusban. Az in vitro LH-felszabadító aktivitásvizsgálatok alapján ez azt jelenti, hogy a GnRH-hoz képest a hatás 0,01%-os. A további állatkísérletekben kiderült, hogy az egyszeri 10 vagy 50 μg-os MI-1892 adagolás nem gátolta az egerekben az ovulációt. MCF-7 sejtvonalakon vizsgálva a hatóanyag 34%-kal (30 μg ) illetve 38%-kal (50 μg ) csökkentette a sejtek túlélőképességét, míg MDA-MB-231 sejtvonalakon vizsgálva az eredmény 60% és 64% volt. Tehát az MI-1892 alacsony endokrin hatással, és magas antitumor aktivitással rendelkezik. 21 A vegyület további előnye, hogy a vizsgálatok során immunstimuláns hatást is mutatott, ami fontos lehet a drog molekulák okozta immunszupresszió kivédése vagy csökkentése érdekében GnRH-III Az irányított tumorterápiában alkalmazni kívánt, új GnRH származékok fejlesztése során a cél a hormonális hatás csökkentése mellet magasabb antitumor aktivitás és szelektivitás elérése. A legígéretesebbnek tűnő természetes GnRH analóg, a tengeri ingolából (Petromyzon marinus, 2. ábra) izolált lgnrh-iii analóg. 15,22 2. ábra: A tengeri ingola 22 A lgnrh-iii (Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-H 2 ) a humán gonadotropin releasing hormontól az aminosavakban különbözik, és az emlősökben elhanyagolhatóan kicsi endokrin aktivitást mutat. 23 Az LH és FSH felszabadító hatása szer kisebb, 9

13 mint a GnRH-I-nél tapasztalt mennyiség. 24,25 Ez a variáns egyaránt kapcsolódik a GnRH-I és GnRH-II receptorhoz, és gátolja különféle ráktípusok sejtjeinek proliferációját. Ez a dekapeptid hormon már mikromólos dózisban elnyomja a sejtproliferációt a humán emlő-, prosztata-, hasnyálmirigy-, méhnyálkahártya-, és vastagbélrák esetén dózis-függő módon. Közvetlen és specifikus tumornövekedést gátló hatása van, valamint az lgnrh-iii nem rendelkezik endokrin aktivitással a sejtproliferációt gátló dózisban. A GnRH-III további előnye a többi jelentős antitumor hatású GnRH-analóggal szemben, hogy csak L- aminosavakat tartalmaz. Mivel az lgnrh-iii 8-as helyzetben lévő Lys nem tölt be fontos szerepet a tumorellenes hatás szempontjából, 26 ezért a lizin oldallánc módosításával megnövelt antitumor hatású származékok állíthatók elő. Ezen hormonszármazékokból készített dimer vegyületek és konjugátumok amellett, hogy megnövelt antiproliferatív hatást mutattak különböző rákos sejteken, a hormonális aktivitásuk is alacsonyabb volt, mint az eredeti hormonnak. Ezek az eredmények azt is mutatják, hogy a szabad lizin oldallánc jelenléte szükséges az endokrin hatás kifejtéséhez. Az lgnrh-iii dimer származékok nagyobb hatékonyságát az indokolhatja, hogy a vegyület stabilabb a lebontó enzimekkel szemben, továbbá elképzelhető, hogy a dimer mindkét monomer részegysége hozzákötődik a receptor molekulákhoz, és így a receptorok mikroaggregációját, a receptor- ligandum komplex képződését és internalizációját növeli. 27 A GnRH-III receptor a másik két típus közül szerkezetében inkább a II-es típusra hasonlít, sugallva ezzel azt, hogy a II-es és III-as receptorok talán egy ősi gén duplikációval jöttek létre az egyszerűbb gerincesekben (halak, kétéltűek, hüllők), azonban emberben még nem találták meg. 28 Mivel a lgnrh-iii az 1-es és 2-es típusú GnRH receptorokhoz is kötődik, ezért az irányított terápia során hordozó molekulaként konjugátumokban alkalmazható. ehány daunorubicint illetve doxorubicint, továbbá metotrexátot tartalmazó GnRH-III-drog konjugátumot korábban már előállították laboratóriumunkban A vinka alkaloidok A vinka alkaloidok a Madagaszkáron őshonos rózsás meténgből (Catharantus roseus 3. ábra) kivont -tartalmú bázisok. A rózsás meténg szubtrópusi és trópusi területeken széles körben termesztett örökzöld növény, amely a monoterpén alkaloid vindolint és katarantint termeli. A vindolin a fő alkaloid a növényben. 30 A madagaszkári őslakosok hagyományosan diabétesz elleni 3. ábra: A rózsás meténg (Catharantus roseus) 10

14 gyógyszerként alkalmazták. Valójában az egész világon évszázadokon keresztül a legkülönbözőbb betegségek kezelésére használták a darázs csipéstől (India) a szemfertőzésekig (Karibi térség). Amikor a kutatók az 1950-es években elkezdték vizsgálni a növényt, felfedezték, hogy 70 féle alkaloidot tartalmaz. Ezek közül néhány a vér cukor szintjét csökkenti, míg mások vérzéscsillapítóként viselkednek. A legérdekesebbnek mégis a Vinblasztin és Vinkrisztin bizonyult, amelyekről kiderült, hogy a vér fehérvérsejtjeinek számát csökkentik, ezáltal a leukémia ellen hatásos gyógyszer lehet. A vinka alkaloidok dimer szerkezetű molekulák. Két többgyűrűs egységből állnak: az indolmagból (katarantin mag) és egy dihidro-indolmagból (vindolin mag), amely egységek komplexeket alkotnak (4. ábra). A két molekularészlet közül a vindolin szerkezete összetettebb, és ez szolgál prekurzorként a vinka alkaloidok bioszintézisében. 31 Bár számos vinka alkaloid biológiai aktivitását megvizsgálták, közülük csak a természetes vinblasztin (VBL) és a vinkrisztin (VCR), valamint a félszintetikus vindezin (VDS) és vinorelbin (VRL) került forgalomba. A vinblasztin főleg a non-hodgkin limfóma gyógyítására, az előrehaladott hererák, és mellrák gyógyítására használatos. A vinkrisztint főként akut leukémia és más típusú limfómák kezelésére alkalmazzák. Katarantin (CT) mag: Vindolin (VD) mag: R 1 C 2 H 5 R 1 R 2 R 3 R 4 Vindezin -H -CH 3 -CH 2 -H Vinkrisztin -H -CH -C 2 CH 3 -CCH 3 H 3 C H C 2 H 5 H Vinblasztin -H -CH 3 -C 2 CH 3 -CCH 3 Vinorelbin -H -CH 3 -C 2 CH 3 -CCH 3 H CCH 3 R 2 H R 3 R 4 4. ábra: A vinka alkaloidok kémiai szerkezete Vinka alkaloidok hatásmechanizmusa A vizsgálatok azt mutatták, hogy a vinka alkaloidok a sejtekben lévő mikrotubulusok szintézisének gátlásán keresztül fejtik ki tumorellenes hatásukat. A mikrotubulusok a sejtek intracelluláris vázának alkotói közé tartoznak; feladatuk, hogy fenntartsák a sejt belső rendezettségét, a sejtmag és az organellumok jellegzetes elhelyezkedését, továbbá a kapcsolódó motorfehérjék segítségével lehetővé teszik az egyes 11

15 sejtalkotók között a transzportot, a kromoszómák szegregációját a sejtosztódás során és általában a belső átrendeződést eredményező mozgásokat. A mikrotubulusok felépítésében két féle, egymáshoz hasonló 55 kda tömegű polipeptid, az α- és a β-tubulin vesz részt. A tubulin egységek polimerizációja során fej-farok illeszkedés jön létre az alegységek között és fonalszerű struktúrákat (protofilamentum) alkotnak. Tizenhárom ilyen protofilamentum egymáshoz kapcsolódva és egymáshoz képest 0,9 nm-rel elcsúsztatva helyezkedik el egy henger palástja mentén. A mikrotubulusok polimerizációjára a dinamikus instabilitás jellemző: folyamatosan rövidülnek, és nőnek a heterodimerek disszociációjával, illetve asszóciációjával. Emiatt a sejt mikrotubuláris apparátusa folyamatos átszerelődésen megy keresztül. Különösen gyors ez a folyamat osztódó sejtek esetén, ahol a kromoszómák szállítását a mikrotubulusokból felépülő magorsó végzi. A gyorsan osztódó rákos sejtek osztódásának szelektív gátlását a dinamikus instabilitás megzavarásával érhetjük el. 34 A vinka alkaloidok citotoxikus hatása a tubulinnal való kölcsönhatásukkal és a mikrotubuláris rendszer gátlásával függ össze. A tubulin molekulákhoz kötődve blokkolják a mikrotubulusok dinamikáját, ami a sejtek pusztulásához vezethet. Mind a vinka alkaloidok, mind más antimikrotubuláris vegyületek (metotrexát, citozin arabinozid) a mitózis során a sejt ciklus DS szintézis fázisában (S fázis) működnek, továbbá hatással vannak a G1, és G2 fázisban lévő daganatos és egészséges sejtekre egyaránt, mivel a mikrotubuláris rendszernek számos nem mitotikus funkciója is van Korábbi feltételezések szerint a dimer szerkezetű vinka alkaloidok katarantin részlete kapcsolódik a tubulin fehérjékhez, míg a vindolin magnak szerkezetstabilizáló, horgonyzó szerepe van. Megvizsgálták külön-külön a katarantin és a vindolin citotoxikus és kötődési tulajdonságait a vinkrisztin-nel és a vinblasztin-nal összehasonlítva. Eredményként azt kapták, hogy a katarantin antimitotikus hatása a VBL és a VCR-éhez képest azok hatásának ezrede. Mind a katarantin mind pedig a vindolin csak nagy dózisban mutatott tubulin polimerizációt gátló hatást. A katarantin 1, M koncentrációig nem volt hatással a tubulin polimerizációjára, a vindolin esetében ez az érték M volt. Ennél magasabb koncentrációk esetén a fenti anyagok gátolták a mikrotubulusok képződését. 38 A monomerek külön - külön történő alkalmazását azok rossz oldhatósága is nagyban megnehezíti. Azonban az újabb vizsgálatok szerint, ha a vindolinhoz aminosavszármazékokat kapcsolnak, akkor javul a vegyület oldhatósága, és citosztatikus hatást is tapasztaltak. Azonban kevés irodalmi adat áll rendelkezésre az olyan vindolin analógok előállításáról, amelyek nem bisz-indol típusú vinka vegyületek. A BME Szerves Kémiai Tanszékén Dr. 12

16 Szántay Csaba professzor kutatócsoportja előállított különböző vindolin származék aminosav konjugátumokat. Ezek in vitro antitumor hatását vizsgálva azt találák, hogy az egyik legjobb hatású vegyület a Br-vindolin-Trp származék. Ennek magyarázata az lehet, hogy a Trp mimikálhatja a katarantin váz indol-csoportját, így növelve a vegyület kötődését a tubulinokhoz. Ezt a vegyületet az ELTE-MTA Peptidkémiai Kutatócsoportjában oligoarginin sejtpenetráló peptidekhez kapcsolták és vizsgálták, hogy a konjugátum vízoldékonysága és sejtbejutási képességének fokozása befolyásolja-e a vindolin-származék tumorellenes hatását HL-60 sejteken Daunorubicin A daunorubicin (daunomicin, Dau) az epirubicin és a doxorubicin mellett az antraciklinek családjába tartozik. Ezen antitumor hatású szereket széles körben alkalmazzák a rák elleni terápiában. A daunorubicin biológiai hatásait először DiMarco és munkatársai írták le 1964-ben. Megállapították, hogy a Dau a DS szintézisének gátlásával fejti ki hatását, így okozva a sejtek osztódásának gátlását vagy pusztulását. 39 Újabb vizsgálatok azt mutatták ki, hogy a hatóanyag a sejtek DS szintézisét az alkalmazott dózistól függően többféleképpen is gátolhatja. Szabadgyökök keletkezhetnek, és szerepe lehet a lipidperoxidációban is; kötődhet a DS-hez, továbbá alkilezheti is azt; interkalálodhat a DS-ben; befolyásolhatja a DSszálak szeparációját és a helikáz enzim aktivitását, valamint a topoizomeráz II-vel stabil komplexet képezhet, ezáltal gátolja annak működését. 40 Ezek a hatások az egészséges sejtekben is érvényesülnek, így a aunorubicin azonban számos toxikus mellékhatással is rendelkezik (hasmenés, hányás, hajhullás, étvágytalanság, kardiotoxicitás). Annak érdekében, hogy a káros mellékhatásokat elkerüljék és az alkalmazott dózist emelhessék, a daunorubicint számos peptidhez/proteinhez és egyéb molekulához konjugálták. Az alkalmazott hordozó molekulák kétfélék voltak: célfelismerő egységet tartalmazó vegyületek (pl.: GnRH és transzferrin) és a célfelismerő egységet nem tartalmazók (pl. HPMA és DIVEMA szintetikus kopolimerek). A korábban már ismertetett GnRH molekula felhasználható felismerő egységet tartalmazó hordozóként is, amellett, hogy tumorellnes hatása is van. Korábban már sikerült különböző kemoterápiás szereket (pl.: D-melfalán, metotrexát, doxorubicin) amid és észter -kötésen keresztül [D-Lys 6 ] -GnRH molekulához kapcsolni. 40,41 A GnRH származék szuperagonista volta miatt azonban mellékhatásként az agyalapimirigy részleges károsodása lépett fel. 19 Hasonló kísérletek töréntek szuperantagonista GnRH származékok felhasználásával is, de 13

17 ebben az esetben mellékhatásként ovulációgátlást tapasztaltak. A mellékhatások kiküszöbölése érdekében tehát egy olyan GnRH analógra van szükség, amely gyenge endokrin tulajdonságokkal rendelkezik, ennek a feltételnek a lgnrh-iii megfelel. Ez amellett, hogy gyenge agonista, specifikusan kapcsolódik a rákos sejteken lévő receptorokhoz. Az antraciklinek közül mind daunorubicinnel, mind doxorubicinnel kialakított lgnrh-iii konjugátumok készültek már. A doxorubicinhez amid-, észter-, oxim- és hidrazon--kötéssel is kapcsolhatunk hordozó molekulát (pl.: [D-Lys 6 ]GnRH-hoz kapcsolt Dox-14--hemiglutarát), míg a daunorubicinhez csak amid-. oxim- és hidrazon--kötésen keresztül (5. ábra). A doxorubicin a daunorubicinhez képest nagyobb kardiotoxikus hatással rendelkezik. 42 CH 3 CH 3 H H H 3 C H H 2 amid-kötés H 3 C H H 2 amid-kötés H H H észter-kötés CH 3 CH 2 oxim-és hidrazon-kötés oxim- és hidrazon- kötés 5.ábra: A daunorubicin és doxorubicin konjugálási reakcióban résztvevő csoportjai Azon Dau konjugátumok, amelyekben a -kötést az aminocukor részlet amino csoportján keresztül alakították ki, biológiai hasznosíthatósága jelentősen csökkent. A hidrazon--kötésen keresztül kapcsolt vegyületeket kis kitermeléssel sikerült előállítani, és a hidrazon--kötés labilitása miatt a vegyület tisztíthatósága is nehézkes. Ezzel szemben az oxim--kötéssel előállított Dau-GnRH-III (a daunorubicin keto-csoportja és GnRH-III-(Aoa-GFLG) aminooxiacetil-csoportja között alakították ki a -kötést) konjugátum in vitro és in vivo antitumor hatással rendelkezik, és a szabad drogmolekuláhozképest mellékhatása is kevesebb volt a konjugált formának. 42, Peptidszintézis A peptidek előállításának két fő módja van: az oldatban végzett és a szilárdfázisú peptidszintézis. Munkám során szilárdfázisú peptidszintézissel állítottam elő különböző GnRH származékokat, ezért részletesebben ezt a módszert ismertetném. 14

18 Két alternatív eljárás alkalmazható a peptidek szilárd hordozón történő felépítésére. Az elterjedtebb, és az általam is használt módszert a lépésenkénti (stepwise) szintézist Bruce Merrifield fejlesztette ki, és publikálta 1963-ban. A másik módszer a konvergens szilárdfázisú peptidszintézis (CSPPS), amely során védett (esetleg részlegesen védett) peptid fragmenseket kapcsolnak össze szilárd hordozón Lépésenkénti szilárdfázisú peptidszintézis (SPPS) Merrifield az oldatfázisú technika során felmerülő problémák (a peptidlánc növekedésével kialakuló oldékonysági, tisztítási nehézségek) kiküszöbölésére dolgozta ki a szilárdfázisú peptidszintézis. Manapság ez az általános módszer peptidek és kisebb fehérjék előállítására laboratóriumi körülmények között, melynek alapja, hogy oldhatatlan szilárd porózus gyantaszemcséket látnak el funkciós csoportokkal vagy funkcionalizált linkerekkel, melyekhez kovalens - kötésen keresztül hozzáépíthetik a növekvő peptidláncokat. Így az épülő lánc a szintézis végéig a szilárd hordozóhoz van rögzítve és így az oldott reagensek és a melléktermékek egy szűrő segítségével eltávolíthatók mellőle, kikerülve az oldatfázisú szintézisnél alkalmazott tisztítási lépéseket (pl.: kikristályosítás). A technika nemcsak leegyszerűsíti, de nagymértékben meg is gyorsítja a szintézist. A szilárdfázisú peptidszintézis kifejlesztése óta számos polimert (cellulóz, polivinil-alkohol, polimetakrilát, szulfonált polisztirol) próbáltak ki. A legjobbnak a klórmetilezett sztirol 1,4- divinilbenzol (1-2%) kopolimer bizonyult. Ezt a gyantatípust különböző linkerekkel módosítják attól függően, hogy milyen petidet (karboxil- vagy karboxamid C-terminális) és milyen módszerrel kívánnak felépíteni a gyantán. Kereszt-kötéseket létrehozó ágensként újabban 1,2-divinilbenzol tartalmú gyantákat alkalmaznak azok jobb duzzadóképessége miatt. A SPPS általános eljárása a karboxilcsoportján aktivált, védett aminosavszármazék kapcsolásának és az α-amino-csoporton lévő védőcsoport eltávolításának ismétlődő ciklusából áll. A szintézis menetét a 6. ábrán foglaltam össze. A SPPS során alkalmazott acilező szerek nagy feleslege miatt elkerülhetetlen, hogy az aminosavak oldalláncában lévő funkciós csoportokat védőcsoporttal lássuk el (ellentétben az oldatban végzett szintézissel). Mivel a szintézis során az intermedierek izolálására és azonosítására nincs lehetőség, a szintetikus lépések közel 100 %-os hatásfokának elérése érdekében az aminosavszármazékokat és a kapcsoláshoz szükséges reagenseket nagy feleslegben (3-5 ekvivalens a gyanta kapacitásra számolva) kell alkalmaznunk. 15

19 A peptidet a szintézis végén a gyantáról lehasítjuk, lehetőleg úgy, hogy egy lépésben eltávolítsuk az oldallánc funkciós csoporton található védőcsoportokat is. Aminosav oldallánc védőcsoport: pl.: t Bu, Bzl α-amino védőcsoport: pl.: Boc, Fmoc aktiváló csoport pl.: HBt*, DCC**, DIC***,BP**** szilárd hordozó = gyanta újonnan kialalkított peptid-kötés *HBt:, **DCC :, DIC***:, PF 6 BP**** P (H 3 C) 2 (CH 3 ) 2 (CH 3 ) 2 6. ábra: A szilárdfázisú peptidszintézis folyamata A SPPS két általánosan alkalmazott stratégiája: 1) Boc/Bzl stratégia: amelyben az aminosav-származékok α-amino-csoport védelmére terc-butil-oxikarbonil-csoportot alkalmazunk 46 2) Fmoc / t Bu stratégia: amelyben az aminosavszármazékok α-amino-csoport védelmét 9- fluorenil-metoxikarbonil-csoport látja el Boc/Bzl stratégia 47 A módszer (7. ábra) különböző erősségű savakra hasadó savérzékenyebb (átmeneti) és kevésbé érzékeny (állandó) védőcsoportokon (Függelék: 5. táblázat) alapszik. Az α-aminocsoport védelmére alkalmazott terc-butil-oxikarbonil-csoport lúgokkal és nukleofil reagensekkel szemben stabil, de szervetlen vagy szerves savakkal eltávolítható. Eltávolítása térfogat%-os TFA/DCM (trifluorecetsav/diklórmetán) -oldatban perces reakcióidővel történik (8. ábra). 16

20 8. ábra: A Boc védőcsoport hasítása Mivel az acidolízis során az α-amino-csoport trifluor-acetát sója jön létre, ezért a hasítást követően semlegesíteni kell a reakcióközeget. Erre a célra alkalmazhatunk 5-10 térfogat%-os DIEA (diizopropil-etil-amin) DCM-os oldatát. Mivel a peptid-gyanta -kötésnek stabilnak kell lennie a szintézis során, ezért olyan -kötés kialakítása szükséges az első aminosav és a gyanta között, amely nem bomlik TFA hatására. Ennek megfelelően a peptidet a gyantáról csak erős savval (HF, TFMSA, TMSTf) tudjuk hasítani, amelyek során az oldallánc védőcsoportok is lehasadnak. A módszer hátránya, hogy a savas körülmények között érzékeny (oxidábilis és könnyen alkileződő) aminosavakra (Trp, Met, Cys, Tyr) csak korlátozottan és megfelelő körültekintéssel (gyökfogók, redukálószerek) alkalmazható. 48 A szintézis módszer során alkalmazott gyantatípusok a következők: hasítás után a C- terminálison szabad karboxilcsoportot eredményezők: klórmetil (Merrifield)-, PAM-gyanták és az amid csoportot adók: BHA-, MBHA - gyanták. CH 2 Bzl Bzl 7. ábra: Boc/Bzl stratégia: Boc-Glu(Bzl)-Thr(Bzl)-Merrifield gyanta Boc C HF CH 2 CH 3 CH 2 CH 2 H 3 C CH H 3 C C C H CH C H CH C CH 2 R CH 3 TFA HF Fmoc/ t Bu stratégia: Az Fmoc / t Bu stratégia (9. ábra) élőnye az előzőleg ismertetett Boc/Bzl módszerrel szemben, hogy az oxidációra, alkileződésre hajlamos aminosavak (Trp, Met, Cys, Tyr) ezen mellékreakciói visszaszoríthatóak. Védett peptidek szintézisére szintén ez a módszer kínál megfelelő megoldást 49, továbbá ezzel a stratégiával elkerülhetjük a HF használatát a gyantáról 17