RÉZ- ÉS MANGÁNTARTALMÚ KOMPLEXEK ENZIMUTÁNZÓ TULAJDONSÁGAINAK VIZSGÁLATA

Átírás

1 PANNN EGYETEM RÉZ- ÉS MANGÁNTARTALMÚ KMPLEXEK ENZIMUTÁNZÓ TULAJDNSÁGAINAK VIZSGÁLATA DKTRI (PhD) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI Készítette: CSNKA RÓBERT okleveles vegyész Témavezető: Dr. SPEIER GÁBR egyetemi tanár PANNN EGYETEM KÉMIAI ÉS KÖRNYEZETTUDMÁNYI DKTRI ISKLA VESZPRÉM 2010

2 I. ELŐZMÉNYEK, CÉLKITŰZÉSEK Az élő szervezetekben lezajló biokémiai folyamatok többsége összetett, gyors konszekutív reakciók sorozata. A reakciók sebességét és specifikusságát az enzimek alakítják. Az emberi test harmonikusan működő összetett rendszer. Működése közben fellépő problémák, zavarok eredményeként betegségek alakulnak ki, és ez sok esetben éppen a biokatalizátorok hiányos, vagy túlműködésének következménye. Felépítésüket tekintve az enzimek nagy része fehérjéken kívül fémet is tartalmazhat. Ez alakítja ki az ún. aktív centrumot, ami teljes mértékben meghatározza az enzim specifikusságát. Egyik nagy és jelentős csoportjuk az oxidoreduktázok, melyek reakcióiban elektron, vagy hidrogénatom transzfer történik a kölcsönhatásba lépő molekulák között. Általunk vizsgált képviselőik a fenoxazinon szintetáz, a kataláz, a pirokatechin oxidáz, dioxigenáz, és a metán-monooxigenáz enzimek. Ezek bemutatása, valamint funkciójuknak pontosabb megismerése modellvegyületeik reakcióin keresztül, reakciókinetikai vizsgálatok kivitelezésével a PhD értekezés témája. A fenoxazinon szintetáz enzimnek (EC ) a gyógyszeripar egy fontos készítményének az aktinomycin D bioszintézisének az utolsó lépésében van szerepe. Ez az egyik legrégebben alkalmazott tumorellenes kemoterápiás szer, ráadásul gyulladáscsökkentő hatása is ismeretes. Az enzim kristályszerkezetét 2006 óta ismerik, azonban a protein tisztítási eljárások miatt még nem tudták pontosan azonosítani az aktív centrumaiban jelenlevő fémeket. Modellezése leggyakrabban o-amino-fenol oxidatív kapcsolási reakciójának katalizálásával történik. A folyamatot jelentősen gyorsítják a kofaktorként is számon tartott Mn 2+ -ionok, valamint gyökök szerepe is bizonyított. Ennek bizonyítására enzimutánzó kísérleteinkben TEMP szabadgyököt és egy mangán(ii)komplexet alkalmaztunk. A tirozináz enzimhez működésében hasonló, azonban annál kevesebb funkcióval rendelkező pirokatechin oxidáz enzim (EC ) a melaninszintézis első lépésében játszik szerepet. Jelentősége így nem csak az aromás polifenolok lebontásában van, hanem a szervezet védekezőképességének kialakításában is. Szelektivitásának legfontosabb paramétere a kétmagvú rézcentrumában az egyes rézionok közötti távolság. Ezt figyelembe véve egy réz- és egy mangántartalmú komplexet állítottunk elő és használtunk modellként reakciókinetikai vizsgálataink elvégzéséhez.

3 A réztartalmú enzimmodellek előállításakor egy különös viselkedésű rendszert sikerült megfigyelni. A Cu-(2,2 -bipiridin)-(2,5-di-terc-butil-pirokatechinát) komplex oldószertől függően eltérő enzimutánzó tulajdonságokat mutatott. A metánmonooxigenázhoz (EC ) hasonlóan rövid szénláncú oldószerel végzett kísérleteknél (acetonitril) annak oxidációját tapasztaltuk (oxálsavvá). Ezzel szemben, a szénlánc növelésével (propionitril) a pirokatechin hasítása ment végbe a pirokatechin dioxigenáz (EC ) enzimek reakcióihoz hasonlóan. A fejezetben a rendszer vizsgálata és leírása volt elsődleges célunk. A kataláz enzim modelljeinek elkészítése régóta kihívás a bioszervetlen kémiában. Az enzimatikus H 2 2 lebontás hatékony és gyors annyira, hogy a legjobb modellek is csak ezredakkora sebességgel bírnak. Mindazonáltal, a lassabb katalitikus hatást kifejtő vegyületek is jó szolgálatot tehetnek a még nem teljesen ismert mechanizmus megismerésében. Ennek elősegítésére szintén réz- és mangántartalmú komplexeket vizsgáltunk reakciókinetikai méréssorozatainkban. II. ALKALMAZTT KÍSÉRLETI MÓDSZEREK A kísérleti rész mind preparatív kémiai, mind kinetikai jellegű munkát is magába foglal. A dolgozatban szereplő ligandumok és komplexek előállítása során inert laboratóriumi körülményeket, Schlenk technikát alkalmaztunk. A szerkezetük meghatározása, fizikai-kémiai tulajdonságaik vizsgálata az általános UV-Vis, IR, NMR, ESR, AAS és elemanalízis módszerekkel történt. A reakciókinetikai kísérletekhez UV-Vis spektroszkópiai és gázvolumetriás módszereket alkalmaztunk. III. ÚJ TUDMÁNYS EREDMÉNYEK 1. A fenoxazinon szintetáz enzim (PHS) modelljei: a) A PHS enzim szubsztrátumának modelljeként o-amino-fenolt (AP) és o- fenilén-diamint (PDA) alkalmazva TEMP (2,2,6,6-tetrametil-1-piperidinil-oxil) szabadgyök felhasználásával oxidációs reakciókban 2-amino-3H-fenoxazin-3-on (APX) és 2,3-diamino-fenazin (DAP) termékek képződését azonosítottuk. Az AP autooxidációs

4 reakciójának sebességi állandója k aut = (1,46 ± 0,03) 10-8 mól -1 dm 3 s -1, amit meglehetősen felülmúl a katalitikus reakció során észlelt k = (1,49 ± 0,02) 10-4 mól -1 dm 3 s -1 érték. A PDA szubsztrátum esetén a reakciósebesség kisebb, ami az N H és H kötések erősségének különbségéből adódik. Eredményeink azt sugallják, hogy a sebességmeghatározó lépésben H absztrakcióval AP (illetve PDA ) gyök képződik, ami benzokinon-monoimin (BQMI) (diimin) köztiterméken keresztül gyors, kétszer kételektron oxidációs folyamattal alakul a megfelelő termékké. b) Különböző mangán(ii)vegyületek ismerten jó kofaktorai a szóbanforgó enzimnek. [Mn(6 -MeIndH)(H 2 ) 2 (CH 3 CN)](Cl 4 ) 2 (ahol 6 -MeIndH = 1,3-bisz(6 -metil- 2 -piridil-imino)-izoindolin) formájában egymagvú komplexet készítettünk, ami megfelelő funkcionális modellnek bizonyult. Az AP dimerizációjának mechanizmusára az előző fejezetben (a) leírt tapasztalatok alapján tettünk javaslatot. Ennek fontos elemei az előegyensúlyi folyamatban kialakuló komplex (1), annak oxidációja (2), valamint a sebességmeghatározó lépésben képződő AP gyök (3). A BQMI kialakulását végül 2 2 e - -os oxidáció követi (8), aminek az eredménye az APX termék. K 1 [Mn II (6'-MeIndH)] 2+ + AP [Mn II (6'-MeIndH)(AP)] + + H + K 2 [Mn II (6'-MeIndH)(AP)] [Mn III (6'-MeIndH)(AP)( 2 )] + k cat [Mn III (6'-MeIndH)(AP)( 2 )] + (lassú) [Mn III (6'-MeInd)( 2 H)] + + AP [Mn IV (6'-MeInd)()] + + AP [Mn III (6'-MeInd)( 2 H)] + (3) + AP [Mn IV (6'-MeInd)()] + + BQMI + H 2 (4) [Mn II (6'-MeInd)] + + BQMI + H 2 (5) [Mn II (6'-MeInd)] + + H + [Mn II (6'-MeIndH)] 2+ (6) 2AP BQMI (7) (1) (2) NH AP H N H NH 2 N BQMI NH 2 2 H -2H + -2e N 2 NH 2 (8) -2H + -2e H

5 2. A pirokatechin oxidáz enzim (C) modelljei: Az pirokatechin oxidáz enzim modellezésére [Cu 4 (bnac) 4 (µ-et) 4 ] (ahol bnach = benzoil-aceton) és [Mn 2 (6 -Me 2 PAP) 2 Cl 4 ] (ahol 6 Me 2 PAPH = 1,4-di-(6 -metil-2 -piridil)- aminoftalazin) komplexeket állítottunk elő. Az előbbi szerkezetét röntgendiffrakciós módszerrel is sikerült meghatározni. A részletes kinetikai vizsgálatok során 3,5-di-tercbutil-pirokatechin (DBCatH 2 ) oxidációját vizsgáltuk. A rézkomplex esetén megállapítottuk, hogy elektronküldő funkciós csoportokkal rendelkező piridinszármazékok növelik a reakciósebességet. A mangánkomplex katalitikus hatását az alacsonyabb redox potenciálú szubsztrátum-származékok erősítették. Katalitikus aktivitásuk rendre k cat = 5, s -1 és k cat = 46, s -1. A Cu 4 (bnac) 4 (µ-et) 4 komplex röntgendiffrakciós képe Mindkét komplexnél úgy találtuk, hogy a reakciók a Michaelis-Menten kinetikát követik, amely alapján javaslatot tettünk az oxidációk mechanizmusára. Kiemelkedő szerepű a fémek közötti távolság, ami elősegíti a DTBCatH 2 koordinációját az előegyensúlyi lépésekben (9). A környezetből származó dioxigén aktiválása ebben a formában történik (10), az pedig a 3,5-di-terc-butil-o-benzokinon (DBQ) termék képződését teszi lehetővé. K [Mn II 1 2 (6'-Me 2 PAP) 2 Cl 4 ] + DBCatH 2 [Mn II 2 (6'-Me 2 PAP) 2 Cl 4 (DBQ)] H + [Mn 2 II (6'-Me 2 PAP) 2 Cl 4 (DBQ)] ,5 2 K 2 [Mn 2 II,III (6'-Me 2 PAP) 2 Cl 4 (DBQ)()] 2- (9) (10) [Mn 2 II,III (6'-Me 2 PAP) 2 Cl 4 (DBQ)()] 2- [Mn 2 II,III (6'-Me 2 PAP) 2 Cl 4 ()] H + k cat (lassú) [Mn II,III 2 (6'-Me 2 PAP) 2 Cl 4 ()] 2- + DBQ (11) [Mn II (12) 2 (6'-Me 2 PAP) 2 Cl 4 ] + 0,5 H 2

6 3. A pirokatechin dioxigenázok (CTD) és metán-monooxigenázok (MM) modelljei: Röntgendiffrakciós vizsgálatokkal sikerült meghatározni a pirokatechin dioxigenázok modellreakciója során kialakuló [Cu(bpy)(bma)H 2 ] n összetételű és a metán-monooxigenázok modellezésével keletkező [Cu(bpy)(ox)] n összetételű komplexeket. (bpy = 2,2 -bipiridin, bmah 2 = 2-terc-butil-maleinsav, oxh 2 = oxálsav.) A [Cu(bpy)(bma)H 2 ] n és [Cu(bpy)(ox)] n komplexek röntgendiffrakciós képe 13 CH 3 CN és 18 2 alkalmazásával egyértelműen igazoltuk, hogy a [Cu(bpy)(ox)] n komplexben található oxalát képződése az oldószerként használt acetonitrilből vezethető le oxidatív C H aktiváláson keresztül. A terc-butil-maleáto-ligandumot tartalmazó komplex a pirokatechin dioxigenáz enzim intra- és extradiol gyűrűhasítási mechanizmusához hasonló módon alakult ki. Különösen előnyös tulajdonsága a rendszereknek (főleg a C H aktiválás esetén), hogy a reakciók enyhe, standard körülmények között kivitelezhetőek. Mindkét reakciót részleteiben is megvizsgáltuk különböző oldószerek, fémek és reagensek felhasználásával. 4. A kataláz enzim modelljei: A kataláz enzim funkciójának modellezésére egy, az enzimével megegyező fémtartalmú [Mn 2 L(Ac)(H 2 ) 4 ] (H 3 L = 2,6-bisz-[(1-prolinil)-metil]-4-terc-butil-fenol) összetételű, és attól eltérő [Cu 2 (bpy) 2 (ba) 4 ] és [Cu 2 (bpy) 2 (phga) 4 ] (bah = benzoesav, phgah = fenil-glioxilsav) komplexeket készítettünk. Az utóbbi szerkezetét sikeres átkristályosítás után röntgendiffrakciós módszerrel is meghatároztuk. A komplexeknek a

7 hidrogén-peroxid dizmutációjával szemben mutatott katalitikus hatását vizsgáltuk a modellreakciók során. A Cu 2 (bpy) 2 (phga) 4 komplex röntgendiffrakciós képe a) A réz(ii)komplexek sebességi állandói k phga = 0,05 M -0,5 s -1 és k ba = 0,62 M -1 s -1 -nek adódtak. A javasolt reakciómechanizmus szerint ezek monomerré disszociált formában, réz(iii)-hidroxo, -peroxo, esetleg -hidroperoxo oxigén adduktumokon keresztül képesek katalitikus hatást kifejteni: Cu 2 II K 1 2 Cu II (13) Cu II + H 2 2 k 2 lassú 2 Cu III -H (14) k 2 2 Cu III -H + H Cu II H 2 (15) b) A mangán(ii)komplex sebességi állandója k Mn = 0,27 M -1 s -1. Az érték a legjobb mangántartalmú modellekétől meglehetősen elmarad, azonban kicsi hatékonysága ellenére a [Mn 2 L(Ac)(H 2 ) 4 ] komplexnél több cikluson keresztül tartó újrahasznosíthatóságot tapasztaltunk. A feltételezett mechanizmus szerint az aktivitásának alapja a Mn 2 (II,II) és Mn 2 (III,III) oxidációs állapotok közötti átmenet: H Mn(II) Mn(II) H 2 H 2 H H 2 Mn(II) Mn(II) H H k 2 Mn(III) lassú Mn(III) H H (16)

8 IV. A TUDMÁNYS EREDMÉNYEK JELENTŐSÉGE Az értekezésben bemutatott munka alapkutatás jellegű, így az eredmények a tudományos ismereteink bővítését szolgálják. A röntgendiffrakciós módszerrel meghatározott komplexek szerkezete minden esetben új, előállításuk célja a leírt enzimek modellezése volt. Egy újonnan előállított, jó funkcionális és szerkezeti enzimutánzó adottságokkal rendelkező komplex akár gyógyszerként is felhasználható. A kevésbé aktív vegyületek általában a legalkalmasabbak a reakciómechanizmusok meghatározására, ugyanis a kisebb sebességgel lejátszódó reakciók jobban nyomonkövethetőek. Az enzimek teljesítményét túlszárnyaló modelleknek az ipari folyamatok javításában is nagyszerű lehetőségeik vannak (például MM modellek), ezért kutatásuk nagy jelentőséggel bíró feladat. V. A DKTRI ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ TUDMÁNYS KÖZLEMÉNYEK (A), ELŐADÁSK (L) ÉS PSZTEREK (P) A1. J. Kaizer, R. Csonka, G. Speier TEMP-initiated oxidation of 2-aminophenol to 2-aminophenoxazin-3-on J. Mol. Catal. A: Chem., 180, 91, (2002) A2. J. Kaizer, R. Csonka, G. Speier TEMP-initiated oxidation of o-phenylenediamine to 2,3-diaminophenazine React. Kinet. Catal. Lett., 75, 367, (2002) A3. J. Kaizer, R. Csonka, G. Speier, M. Giorgi, M. Réglier Synthesis, structure and catecholase-like activity of a new dicopper(ii) complex with benzoylacetonate ligand J. Mol. Catal. A: Chem., 235, 81, (2005) A4. J. Kaizer, R. Csonka, G. Speier, M. Giorgi, M. Réglier Synthesis, structure and catalase-like activity of new dicopper(ii) complexes with phenylglyoxylate and benzoate ligands J. Mol. Catal. A: Chem., 236, 12, (2005)

9 A5. J. Kaizer, R. Csonka, G. Baráth, G. Speier Synthesis, properties, and catecholase-like activity of the [1,4-di(6 -methyl-2 - pyridyl)aminophthalazine]dimanganese(ii) complex, Mn 2 (6 Me 2 PAP) 2 Cl 4 Trans. Met. Chem., 32, 1047, (2007) A6. J. Kaizer, G. Baráth, R. Csonka, G. Speier, L. Korecz, A. Rockenbauer, L. Párkányi Catechol oxidase and phenoxazinone synthase activity of a manganese(ii) isoindoline complex J. Inorg. Biochem., 102, 773, (2008) A7. J. Kaizer, R. Csonka, G. Speier Synthesis and catalase-like activity of a dimanganese(ii) complex with a pentadentate L- prolin-based ligand React. Kinet. Catal. Lett., 94, 157, (2008) A8. R. Csonka, J. Kaizer, M. Giorgi, M. Réglier, L. Hajba, J. Mink, G. Speier xidative C-H and C-C bond cleavage by a (2,2 -bipyridine)copper(i) chloride complex Inorg. Chem., 47, 6121, (2008) L1. R. Csonka, J. Kaizer, G. Speier Aromás aminok TEMP-katalizált kapcsolási reakcióinak reakciókinetikai vizsgálata XXVI. Kémiai Előadói Napok (KEN), Szeged, október L2. R. Csonka, J. Kaizer, G. Speier Pirokatechin dioxigenáz és kataláz enzimek néhány réztartalmú modelljének vizsgálata Az MTA Kémiai Tudományok sztálya Fizikai-kémia és Szervetlen Kémiai Bizottsága (FkSZKB) ülése, Veszprém, április 14. L3. R. Csonka, G. Speier, J. Kaizer (Ketokarboxiláto-) és (karboxiláto)réz(ii) komplexek előállítása és kataláz aktivitásának vizsgálata XLI. Komplexkémiai Kollokvium, Mátrafüred, május 31- június 2.

10 P1. J. Kaizer, R. Csonka, G. Speier Reaction Kinetics of ortho-aminophenol dimerization catalyzed by TEMP NAT Advanced Study Institute (ASI), Törökország, Antalya, szeptember P2. J. Pap, R. Csonka, J. Kaizer, G. Speier Kinetics and mechanism of stable radicals with phenolic antioxidants Conference on Plant Stress, Reactive xygen and Antioxidants, Németország, Freising- Weihenstephan, szeptember P3. R. Csonka, J. Kaizer, G. Speier Synthesis, structure and catecholase-like activity of a new dicopper(ii) complex with benzoylacetonate ligand 1st European Chemistry Congress, Magyarország, Budapest, augusztus P4. R. Csonka, J. Kaizer, G. Speier Synthesis, structure and catalase-like activity of a new dicopper(ii) complex with phenylglyoxalate and benzoate ligand Second International Meeting of the Institute of Metals in Biology of Grenoble (IMBG), Franciaország, Autrans, szeptember