IZOINDOLIN VÁZÚ LIGANDUMOK FÉMKOMPLEXEINEK ELŐÁLLÍTÁSA ÉS ENZIMUTÁNZÓ REAKCIÓINAK VIZSGÁLATA

Átírás

1 IZOINDOLIN VÁZÚ LIGANDUMOK FÉMKOMPLEXEINEK ELŐÁLLÍTÁSA ÉS ENZIMUTÁNZÓ REAKCIÓINAK VIZSGÁLATA A DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI Készítette: Csay Tamás okleveles vegyész Dr. Speier Gábor egyetemi tanár Témavezetők: és Dr. Kaizer József egyetemi docens PANNON EGYETEM KÉMIAI ÉS KÖRNYEZETTUDOMÁNYI DOKTORI ISKOLA VESZPRÉM 2011

2 I. ELŐZMÉNYEK, CÉLKITŰZÉSEK Az élő szervezetekben végbemenő reakciók kellő sebességgel történő lejátszódása megfelelő katalizátorok nélkül elképzelhetetlen. Az élőlények anyagcseréjük (metabolizmus) során a felvett tápanyagok átalakításával felépítik sejtjeiket (anabolizmus), vagy lebontják őket energiaszerzés céljából (katabolizmus). Mind a szükséges anyagok előállításához, mind pedig a felesleges, esetleg káros anyagok lebontásához kémiai reakciók sokaságára van szükség. A legtöbb ilyen reakció normál körülmények között nem, vagy csak rendkívül lassan megy végbe. A reakciók aktiválási energiájának csökkentéséhez az élőlények biokatalizátorokat, ún. enzimeket használnak. Az enzimek bonyolult felépítésű fehérjék, közvetlen vizsgálatukat csak az utóbbi évtizedek műszertechnikai fejlődése tette lehetővé. Ilyen vizsgálati módszerek szilárd fázisban a röntgendiffrakció, a folyadékfázisban a röntgenabszorpciós finomszerkezet spektroszkópia (EXAFS) és az NMR. Az enzimek felépítését és reakcióikat a kémia mai tudásával még megközelítőleg sem vagyunk képesek leutánozni, viszont egyszerűbb szerkezeti és működési modelleken keresztül közvetett módon vizsgálhatjuk őket. Erre az aktív centrumukban fémionokat tartalmazó enzimek esetében a bioszervetlen, vagy más néven biokoordinációs kémia módszerei adnak lehetőséget. Ilyen modellekkel ún. bioutánzó reakciókat dolgozhatunk ki, amelyek az enzimkatalizált reakciók szelektivitásának és sebességének vizsgálatára alkalmasak. A biokatalizátorok által gyorsított reakciók rendkívül sokfélék lehetnek. Mi a jelen értekezésben olyan enzimek modelljeinek vizsgálatával foglalkozunk, melyek metabolitikus folyamatokban vesznek részt és reakcióikhoz oxigént vagy hidrogén-peroxidot használnak fel. Ilyen, általunk modellezett enzimek a katechol oxidáz és a kataláz. A biológia folyamatok megismerése sok szempontból fontos lehet az emberiség számára. Az, hogy egyre mélyebben tekinthetünk be a saját és a minket körülvevő élőlények szervezetébe, egyre több lehetőséget adhat számunkra, hogy újfajta gyógyszereket és terápiás módokat dolgozhassunk ki a különböző betegségek ellen. De nem csak a már meglévő problémáink kezelésében, hanem a szervezetünket érő rengeteg káros hatás csökkentésében is fontos eredményeket érhetünk el ily módon. És akkor még nem is beszéltünk a manapság rendkívül gyorsan fejlődő zöld kémiában rejlő lehetőségekről és az ipari felhasználhatóságról. Ez a fiatal tudományág, a bioszervetlen kémia mindegyik említett 1

3 területen produkált már előrelépéseket és minden bizonnyal tartogat még új és lényeges eredményeket az emberiség javára. A dolgozat témája olyan új bioutánzó vegyületek előállítása és bemutatása, amelyek valamilyen szempontból előre mozdíthatják a kutatásokat az enzimműködés és a kémia jobb megértése felé, de akár ötletekkel is szolgálhatnak későbbi gyakorlati alkalmazhatóságok megvalósítására. II. ALKALMAZOTT KÍSÉRLETI MÓDSZEREK A levegőre érzékeny anyagokkal végzett preparatív munkát és a kinetikai méréseket Schlenk-tecnika alkalmazásával, argon atmoszférában végeztük. Az alkalmazott oldószereket víz- és dioxigén-mentesítettük, majd argon atmoszférában levegőtől és fénytől elzárva tartottuk. Az előállított modellvegyületek összetételét elemanalízissel határoztuk meg, felépítésük meghatározására számos szerkezet-felderítési módszert (UV-Vis, IR, ESR, röntgendiffrakció, NMR) alkalmaztunk. Az oxigénezési és oxidációs reakciók során képződő intermedierek és termékek azonosítása különböző spektroszkópiai módszerekkel történt (UV- Vis, IR, ESR, NMR). A kinetikai vizsgálatokat UV-Vis spektroszkópiás illetve gázvolumetrikus mérési módszerek alkalmazásával végeztük. III. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK Két oxidoreduktáz enzim, a katechol oxidáz és a kataláz négy új modellvegyületét állítottuk elő, melyek közül három esetben sikerült a szerkezet röntgendiffrakciós módszerekkel történő pontos meghatározása. Egy esetben a komplexet spektroszkópiai módszerekkel (IR, UV-Vis) azonosítottuk. Továbbá, előállítottunk és szerkezetileg leírtunk (IR, UV-Vis, NMR) egy új izoindolin alapvázú ligandumot is. A modellek bioutánzó reakcióit kinetikai módszerekkel vizsgáltuk. Eredményeink és irodalmi ismereteink alapján javaslatot tettünk a lehetséges reakciómechanizmusokra is. Az új tudományos eredmények témákra lebontva a következők: A kataláz enzimmodellek: A mangántartalmú kataláz enzim működési mechanizmusának jobb megértése céljából előállítottunk és szerkezetileg leírtunk egy új mangántartalmú komplexet a 2

4 [Mn(IndH)Cl 2 ](CH 3 OH)-at. A röntgenszerkezet alapján megállapítható, hogy az egymagvú komplexet egy IndH és két klorid ligandum veszi körül enyhén torzult trigonális bipiramis elrendeződésben. A modellvegyületünkhöz használt ligandum az 1,3-bisz(2 -piridilimino)- izoindolin volt. Ennek a bázikus sajátságú molekulának a felépítése tautomer szerkezetekkel írható le. A vegyület a fehérjék egyes aminosav alegységeihez hasonlóan (pl.: szerin, hisztidin) a nitrogénatomok nemkötő elektonpárjainak révén képes a központi fémmel koordinatív kötés kialakítására, akár kelátkomplexet is képezve, így merevítve a szerkezetet. Egyes réz-, ruténium-, kobalt- és vastartalmú vegyületeiről pedig már korábban leírták, hogy képesek különböző oxidációs folyamatok katalízisére is. 1.) A komplex az enzimmel ellentétben, önmagában nem mutatott katalitikus aktivitást a hidrogén-peroxid dizmutációjában. Különböző nitrogéntartalmú bázisok (például imidazol, 1- metil-imidazol, piridin) jelenlétében azonban acetonitril oldószerben aktívnak bizonyult. Alátámasztottuk, hogy a bázisok közül az erős -donor képességekkel bíró imidazolszármazékok nagyobb mértékben segítik a katalízist. Ez alapján elmondhatjuk, hogy a nukleofil tulajdonságok előnyösen befolyásolják a sebességmeghatározó lépés lefolyását. A sebességi egyenlet a komplexre és a szubsztrátumra nézve is elsőrendűnek adódott. Eredményeink alátámasztják azt a feltételezést, hogy a kataláz enzim aktív centrumának környezetében jelenlévő bázisoknak fontos szerepe lehet az enzimatikus körfolyamatban. 2.) Vizsgáltuk továbbá ugyanennek a komplexnek a katalitikus képességeit vizes közegben, különböző ph-értékeknél, hozzáadott bázisok jelenléte nélkül. A [Mn(IndH)Cl 2 ](CH 3 OH) ebben az esetben lényegesen nagyobb sebességgel bontotta a szubsztrátumot. Azt tapasztaltuk, hogy a hidrogén-peroxid diszproporció mértéke a ph növelésével emelkedik és ~9,6-nél maximumon megy át. A reakció a vizsgált körülmények között a katalizátorra nézve elsőrendű volt, míg a szubsztrátumra nézve Michaelis-Mententípusú kinetikát kaptunk. 3.) Feltételeztük, hogy stabilis szabadgyök (TEMPO) szintén képes aktiválni a komplexet és koncentrációjának változtatása hatással lesz a reakciósebességre. Ennek érdekében acetonitril oldószerben különböző körülmények között megvizsgáltuk a szabadgyök hatását a hidrogén-peroxid katalitikus bontásának során. Az eredményeink szerint a sebességi egyenlet trimolekuláris volt. A feltételezett mechanizmus alapján a TEMPO koordinálódik a fémcentrumhoz, megváltoztatva annak redox tulajdonságait kialakítva egy Mn(III) centrumot, amely már képes reakcióba lépni a szubsztrátummal. 3

5 A katechol oxidáz enzimmodellek: 1.) A katechol oxidáz enzim aktív centrumának modellezése céljából előállítottuk a kétmagvú [Cu 2 (4 MeInd) 2 (MeOH)(µ-OH)]ClO 4 MeOH és az egymagvú Cu(4 MeInd)(dtBCatH) komplexeket. Szerkezetüket spektroszkópiai módszerekkel azonosítottuk. A [Cu 2 (4 MeInd) 2 (MeOH)(µ-OH)]ClO 4 MeOH komplexből egykristályt növesztettünk, amely röntgendiffrakciós mérésre is alkalmasnak bizonyult. Ez alapján elmondhatjuk, hogy komplex kétmagvú és a két réz(ii)centrumot hídligandumként egy hidroxil-csoport köti össze. A rézionok egymástól mért távolsága 0,4 Å-mel nagyobb, mint az enzimben mért érték. A Cu(1)-atom környezete torzult síknégyzet piramisos szerkezettel írható le, míg a Cu(2)-atomhoz közvetlenül kapcsolódó részek némileg torzult trigonális piramisos geometriát mutatnak. A komplex katalitikus képességeit vizsgálva azt tapasztaltuk, hogy dtbcath 2 hozzáadására a [Cu 2 (4 MeInd) 2 (MeOH)(µ-OH)]ClO 4 MeOH hidroxohídja felhasad és feltételezhetően Cu(4 MeInd)(dtBCatH) keletkezik belőle. Ezt bizonyítandó, a kerülő úton előállított Cu(4 MeInd)(dtBCatH)-lal is elvégeztük a reakciókat. A kísérletek szerint a két esetben a reakciósebességek megközelítőleg azonosak voltak, tehát az enzimkinetikát követő katalitikus ciklusban már az egymagvú komplex vesz részt. Az Evansféle módszer alapján az NMR spektroszkópiával végrehajtott mágneses szuszceptibilitási értékek bizonyítják, hogy [Cu 2 (4 MeInd) 2 (MeOH)(µ-OH)]ClO 4 MeOH oldat fázisban is egymagvú, de a szubsztrátum hozzáadására disszociál. A reakciókinetikai mérések szerint a vizsgált körülmények között a reakció a komplexekre és az oxigénre nézve elsőrendű, míg a szubsztrátumra nézve Michaelis-Menten-típusú a kinetika. 2.) Annak érdekében, hogy modellezzük a katechol oxidáz enzim aktív centrumában jelenlévő bázisok hatásait, elkészítettünk egy új ligandumot (3 MePyOIndH) tartalmazó, komplexet a Cu(3 MePyOInd) 2 -t. A ligandum és a komplex szerkezetét is spektroszkópiai módszerekkel azonosítottuk. A komplexről készült röntgendiffrakciós felvételek alapján elmondható, hogy a központi rézatomhoz a két ligandum egymáshoz képest transz helyzetben koordinálódott és a fém közvetlen környezete enyhén torzult tetraéderes szerkezetű. A ligandumok deprotonált állapotban egy-egy piridin és egy-egy pirrol nitrogénjük révén létesítenek kötést a centrummal. Sav hozzáadására változások figyelhetőek meg a komplex UV-Vis spektrumában, mely változások bázissal történő visszatitrálás során reverzibilisek. A sav esetében tapasztaltakhoz hasonló, ámde kisebb mértékű protonáció figyelhető meg 3,5-diterc-butil-katechol hozzáadásakor. A komplex hatékonyan bontja a szubsztrátumot, a reakciósebességi egyenletben a katalizátor és az oxigén első renddel szerepel, míg a 4

6 szubsztrátumra nézve enzimkinetikát tapasztaltunk. Bizonyítottuk, hogy komplex kettős hatással bír, ugyanis redox-katalizátorként hatékonyan bontja o-kinonná a katecholt és eközben bázisként is működik. IV. A TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK JELENTŐSÉGE A katalázoknak és főleg modelljeiknek rendkívül széles a gyakorlati felhasználhatóságuk. Az iparban gyakran használnak hidrogén-peroxidot oxidálószerként (például azofestékek bontásakor). Ezt a zöld kémia jegyében teszik, ugyanis a peroxid viszonylag gyorsan lebomlik a természetben, azonban a kibocsátás környékének élővilágát ettől még károsíthatja. Ezért minél olcsóbb és hatékonyabb lebontásuk így is szükséges. A szervezetünkre egyre gyakrabban és egyre pusztítóbb hatással van az ún. oxidatív stressz. Ide tartoznak többek között a hidrogén-peroxidból levezethető hidroxil-gyök okozta panaszok (például az acatalasemia). Az ellenük való védekezés egyik lehetősége megfelelő antioxidáns hatással bíró vegyületek kifejlesztése, melyek nem mérgezőek, valamint könnyen és olcsón előállíthatóak. Mindemellett fontos szempont az enzimműködés részletesebb vizsgálata, mely ebben az esetben különösen nehéz, ugyanis a vastartalmú katalázok a leghatékonyabb ma ismert biokatalizátorok. Egyetlen másodperc alatt akár hat millió szubsztrátum átalakítására is képesek, így a reakció nyomon követése nem teljesen megoldott és sok részlet vár még tisztázásra. Olyan mangántartalmú kataláz modellvegyületet állítottunk elő, mellyel hatékonyan szemléltethetjük az enzim aktív centrumában jelenlévő bázisok esetleges hatásait. Megvizsgáltuk, milyen hatással van a reakcióra a ph, illetve hogyan befolyásolja a fémcentrum redox állapotának megváltozása a mechanizmust. Úgy gondoljuk, ezekkel a kutatásokkal hozzájárultunk a kataláz enzimatikus körfolyamatának jobb megértéséhez és talán ötletet adtunk új gyógyszerek kifejlesztésére. Az aromás szerves vegyületek oxidatív lebontása enyhe körülmények között nagy érdeklődésre tart számot az iparban és a környezetvédelemben is. A széles körű felhasználhatóságot ebben az esetben nem az enzimreakciókra jellemző specifikusság, hanem éppen ellenkezőleg, az azonos katalizátorral elvégezhető minél többféle vegyület hatékony lebontása jelenti. A katecholáz reakciónak jelentős szerepe van az orvosi diagnosztikában is, mivel ennek segítségével határozzák meg a katecholamint, az adrenalint, a noradrenalint és a dopamint is. Különböző mesterséges vegyületekkel lényegesen olcsóbbá lehetne tenni ezeket a vizsgálatokat. A katechol oxidáz enzimmodelljeink ilyen jellegű felhasználhatóság 5

7 szempontjából is érdekesek lehetnek, azonban legfontosabb célunk ezekkel a vegyületekkel az enzimműködés egyedi lépéseinek feltárása volt. Kutatásainkkal új információkat szereztünk arról, hogy a szubsztrátum egy, vagy két foggal koordinálódik fémcentrumhoz és eközben hogyan képes deprotonálódni. Ezzel az enzimatikus körfolyamatban résztvevő bázisok, például a centrumhoz közel elhelyezkedő glutamátnak a szerepét vizsgáltuk. Vizsgáltuk továbbá a fémek közötti hídkapcsolatok jelentőségét a reakció során. Lényegét tekintve az értekezésben bemutatott munka alapkutatás jellegű, így az eredmények elsősorban a tudományos ismereteink bővítését szolgálják. V. A DOKTORI ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ TUDOMÁNYOS KÖZLEMÉNYEK, ELŐADÁSOK ÉS POSZTEREK KÖZLEMÉNYEK (1) J. Kaizer, T. Csay, P. Kővári, G. Speier, L. Párkányi: Catalase mimics of a manganese(ii) complex: The effect of axial ligands and ph J. Mol. Cat. A: Chem., 2008, 280, 203. IF.: (2010) (2) T. Csay, J. Kaizer, G. Speier: Tempo-activated manganese-based catalase mimics Reaction Kinetics and Catalysis Letters, 2009, 96, 35. IF.: (2010) (3) T. Csay, G. Baráth, B. Kripli, J. Kaizer, G. Speier: Synthesis and catalase-like activity of manganese(ii) complexes with isoindolinebased ligands Insights into Coordination, Bioinorganic and Apllied Inorganic Chemistry: M. Melnik, P. Segl am, M. Tatarko, Eds.; Slovak University of Technology Press: Bratislava, Vol. 9, 2009, (könyvfejezet) (4) T. Csay, B. Kripli, M. Giorgi, J. Kaizer, G. Speier: A flexible hydroxy-bridged dicopper complex as catechol oxidase mimic Inorg. Chem. Commun., 2010, 13, 227. IF.: (2010) (5) J. Kaizer, T. Csay, G. Speier, M. Giorgi: Dual activation process in a copper(ii)oxoisoindoline-catalyzed catechol oxidation J. Mol. Cat. A: Chem., 2010, 329, 71. IF.: (2010) 6

8 Egyéb közlemények: (1) J. Kaizer, T. Csay, M. Czaun, G. Speier, M. Réglier, M. Giorgi: Copper-catalyzed oxygenation of 3-hydroxy-2-phenylquinolin-4(1H)-one. Synthesis, structure and spectral properties of [Cu(idpa)(N-baa)]ClO 4, [idpa = 3,3 -iminobis(n,ndimethylpropylamine), N-baa = N-benzoylanthranilic acid)]. Inorg. Chem. Commun., 2005, 8, 813. IF.: (2010) (2) J. Kaizer, M. Czaun, T. Csay, G. Speier, L. Párkányi, M. Giorgi, M. Réglier: Synthesis and oxidation of copper complexes of 1H-2-phenyl-3-hydroxy-4- oxoquinoline. In Advances in Coordination, Bioinorganic and Inorganic Chemistry; M. Melnik, J. Sima, and M. Tatarko, Eds.; Slovak Technical University Press: Bratislava, Vol. 7, 2005, (könyvfejezet) (3) J. Kaizer, É. Balogh-Hergovich, M. Czaun, T. Csay, G. Speier: Redox and nonredox metal assisted model systems with relevance to flavonol and 3- hydroxyquinolin-4(1h)-one 2,4-dioxigenase. Coord. Chem. Rev., 2006, 250, IF.: (2010) (4) J. Kaizer, T. Csay, G. Speier, M. Réglier, M. Giorgi: Synthesis, structure and catalase-like activity of Cu(N-baa) 2 (phen), (phen = 1,10- phenantroline, N-baa = N-benzoylanthranilic acid). Inorg. Chem. Commun., 2006, 9, IF.: (2010) ΣIF.: Előadások a dolgozat témájában: (1) T. Csay, P. Kővári, J. Kaizer, G. Speier: Mangán(II)tartalmú kataláz-modellek előállítása és vizsgálata. LXII. Komplexkémiai Kollokvium, Mátrafüred, május (2) T. Csay, P. Kővári, J. Kaizer, G. Speier: Funkcionális katalázmodellek előállítása és vizsgálata. Centenáriumi Vegyészkonferencia, Sopron, május június 1. (3) T. Csay, P. Kővári, J. Kaizer, G. Speier: Réz(II)-tartalmú pirokatechin-oxidáz modell előállítása és vizsgálata. LXIII. Komplexkémiai Kollokvium, Siófok, május (4) Kripli B., Csay T., Kaizer J., Speier G.: Pirokatechin oxidáz enzim modelljének előállítása és vizsgálata LXIII. Komplexkémiai Kollokvium, Siófok, május

9 (5) T. Csay, G. Baráth, B. Kripli, J. Kaizer, G. Speier: Synthesis and catalase-like activity of manganese(ii) complexes with isoindolinebased ligands XXII. International Conference on Coordination and Bioinorganic Chemistry, Smolenice, Slovakia, June Idegen nyelvű poszterek a dolgozat témájában: (1) T. Csay, J. Kaizer, B. Kripli, G. Speier: Catechol oxidase activity of a flexible OH-bridged dicopper complex. XXXVIIIth International Conference on Coordination Chemistry, Jerusalem, Israel, July 20-25, 2008, Book of Abstracts P 362. (2) T. Csay, J. Kaizer, B. Kripli, G. Speier: Studies on a mononuclear copper-based catechol oxidase mimic. XXXVIIIth International Conference on Coordination Chemistry, Jerusalem, Israel, July 20-25, 2008, Book of Abstracts P 372. Eddig elnyert díjak: (1) Csay T.: Magyar Kémikusok Egyesülete Nívó-díj a 2-Fenil-3-hidroxi-4(1H)-oxokinolin és N-benzoil-antranilsav réz(ii)komplexeinek előállítása, flavonol 2,4-dioxigenáz-, valamint katalázaktivitásának vizsgálata című diplomamunkáért. Szeged, október 30. (2) Csay T.: Magyar Tudományos Akadémia Veszprémi Akadémiai Bizottság évi pályázata. II. díj kémia szekcióban az Egy mangántartalmú katalázmodell előállítása és vizsgálata című pályamunkáért Veszprém, december 6 8