Vizsgakövetelmények Tudjon elemezni kísérleteket a DNS örökítő szerepének bizonyítására (Griffith és Avery, Hershey és Chase kísérlete).

Átírás

1 1

2 Vizsgakövetelmények Tudjon elemezni kísérleteket a DNS örökítő szerepének bizonyítására (Griffith és Avery, Hershey és Chase kísérlete). Ismertessen néhány példát a genetikai technológia alkalmazására (inzulintermeltetés, génátvitel haszonnövénybe, klónozott fajták a mezőgazdaságban). Ismerjen a géntechnológia mellett és ellen szóló érveket. Magyarázza a baktériumok felhasználását emberi fehérje előállítására. Értse, hogyan rejlik a DNS szerkezetében az információhordozó, örökítő (önmegkettőződő) szerep. Értse a sejten belüli információáramlás főbb lépéseit: a DNS megkettőződés folyamata, a DNS mrns átírása és az mrns leolvasása. Értelmezze annak jelentőségét, hogy a genetikai kód általános érvényű. Ismerje és alkalmazza a gén, a genetikai kód fogalmakat. Ismerje az általános összefüggést a DNS, a fehérje aminosavsorrendje, térszerkezete és biológiai funkciója, valamint a tapasztalható jelleg között. Használja a kodonszótárt. A kodonszótár segítségével vezesse le különböző típusú pontmutációk következményeit az aminosavsorrendben. Kösse a fehérjeszintézis fázisait az eukarióta sejt alkotórészeihez. Ismerje fel ábrán a laktóz-operon részeit, értelmezze szerepüket. Értse a stresszfehérjék (hősokkfehérjék) működésének és a sejt öngyógyító folyamatainak a kapcsolatát, térszerkezetében betöltött szerepét. Ismerje a Human Genom Program lényegét, jelentőségét. 2

3 Az öröklődés molekuláris alapjai Szerk.: Vizkievicz András A DNS örökítő szerepét bizonyító kísérletek A DNS-nek addig nem szenteltek különösebb figyelmet, amíg biológiai kísérlettel ki nem mutatták, hogy bizonyos baktériumok öröklődését megváltoztatja. Ezt a kísérletet egyáltalán nem tervezték meg előre ban Fred Griffith egy gömb alakú baktérium - Diplococcus pneumoniae - kórokozó képességét patogenitását - vizsgálta, amely egérben vérmérgezést, emberben tüdőgyulladást okoz. E baktériumnak két törzse ismert. 1. Patogén (sima felszínű, S-törzs), amelynek egyedei az immunrendszernek ellenálló poliszacharid tokot fejlesztenek maguk köré. A tokképzés örökletes, azaz az utódok is tokosak lesznek. 2. Nem patogén, amelyek nem képeznek tokot. (Ráncos felületű, R-törzs, az immunrendszer meg tudja semmisíteni.) Griffith a baktériumokat egerekbe oltotta, majd a következő eredményeket kapta: 1. Egér + élő tokos baktérium = az egerek 1-2 napon belül elpusztultak. 2. Egér + élő tok nélküli baktérium = az egerek nem pusztultak el. 3. Egér + hővel elölt tokos baktérium = az egerek nem pusztultak el. 4. Egér + hővel elölt tokos + élő tok nélküli baktérium = néhány egér elpusztult! Az elpusztult állatok hulláit megvizsgálták, és meglepődve tapasztalták, hogy bennük élő tokos baktériumok voltak. Griffith tehát azt a váratlan felfedezést tette, hogy az elölt patogén sejtek az élő, nem fertőző sejtekhez keverve, azoknak kis részét patogénné tették. Fertőzővé válva az eredetileg nem fertőző sejtek, tokot fejlesztettek, amely az immunrendszerrel szemben ellenállóvá teszi azokat a sejteket, amelyeken megtalálható. Griffith tehát az örökítő anyag létét fedezte fel, amely ép maradt a fertőző sejteket ért pusztító hőhatás után, s később átkerülve a nem kórokozó sejtekbe, azokat tok képzésére serkentette. Ezt a folyamatot genetikai transzformációnak nevezzük. Griffith szerint a baktérium - általa nem ismert örökítőanyaga okozta a jelenséget, ugyanakkor maga nem próbálta mindenáron meghatározni ezt az anyagot. 3

4 A Griffith által felfedezett természetes baktérium-transzformáció az alapja a modern mesterséges genetikai transzformációnak, melynek során egy sejtbe valamilyen idegen DNS-t juttatnak, azzal a szándékkal, hogy a bekerült örökítőanyag megváltoztatja a befogadó recipiens - sejt tulajdonságait. A bejutott DNS kifejeződik, azaz az általa kódolt fehérjét gyártja le a sejt, amelynek működése átalakítja a befogadó sejt működését. Ez az eljárás az alapja a genetikai mérnökségnek, régiesen génsebészetnek. A mesterséges baktérium-transzformáció során a bejutatott DNS által kódolt fehérje termeltetése a cél, mely különféle módon kinyerve felhasználhatóvá válik, mint pl. az E. coli által termelt inzulin. Az eljárás első lépése a kívánt DNS-szakasz bejuttatása a befogadó sejtbe. Ez többféleképpen történhet pl. transzdukcióval vírusok közvetítésével vagy plazmidok segítségével transzformációval, génágyúval. (A DNS- t néhány μm átmérőjű arany vagy wolfram- részecskére rögzítik, majd ezeket a részecskéket nagy sebességre felgyorsítják, nagy nyomású He vagy N 2 gázzal. A részecskék eltalálják a célsejtet, áthatolnak annak a falán és bejutatják a szállított DNS-t.) Ezeket a bejuttatandó hasznos DNS-egységeket genetikai vektoroknak nevezzük. A mesterséges transzformáció során először ún. hibrid rekombináns - plazmidot hoznak létre. A hibrid plazmidot úgy állítják elő, hogy egy baktériumból kinyert természetes plazmidba beépítik a bejuttatandó DNS szakaszt. Ezt követően a befogadó sejtet arra késztetik, hogy vegye fel az elkészített hibrid plazmidot. A technológia kivitelezését a restrikciós endonukleázok felfedezése tette lehetővé. Nevüket arról kapták, hogy megakadályozzák az idegen DNS, például a baktériumot fertőző vírus DNS-ének invázióját, a molekula feldarabolásával (restrict = korlátozni). Az endonukleáz megjelölése, pedig arra utal, hogy az idegen DNS-t a molekula belsejében levő helyeken hasítják el, és nem a végén kezdik lebontani (görög: endo=belső). A restrikciós endonukleázok nem pontosan szemben vágják el a DNS két szálát, hanem kissé eltolódva, tehát egyfonalas túlnyúló szálakat, ún. ragadós végeket képeznek, ami megkönnyíti két DNS összekapcsolását rekombináns DNS-sé. A genetikai vektorok kialakításához szükség van még az ún ligáz enzimre, amely képes összekapcsolni különböző DNS-ekből származó szabad végű DNS-darabokat, létrehozva a hibrid plazmidot. Ezek után biztosítani kell, hogy a hibrid plazmidok bejussanak a baktériumokba. Egyik lehetőség, hogy a baktériumokat és a plazmidokat kalcium-klorid oldatba helyezik, majd felváltva hideg és meleg sokknak teszik ki őket. A baktériumokra kifejlesztett módszerek módosításokkal ugyan, de használhatónak bizonyultak fejlettebb élőlényekkel kapcsolatban is. Így jöttek létre a genetikailag módosított organizmusok, azaz a GMO-k (Genetically Modified Organisms). 4

5 A GMO olyan élő szervezet, amelynek genetikai anyaga a modern géntechnológia alkalmazásával olyan új genetikai kombinációkkal rendelkezik, amely a természetben nem található meg. Az GMO előállításának módja a genetikai transzformáció. Az 1. generációs GMO tápláléknövények a növény, s így a termesztők szempontjából hasznos géneket fejeznek ki, melyek ellenállóvá teszik a növényt a szárazság, a hideg, a patogének (rovarok, baktériumok, gombák és vírusok), vagy a gyomirtószereik ellen. Pl. a kukoricába olyan géneket ültettek, amelyek a gyomirtó szerek ellen ellenállóvá teszik a növényt, s ezért a kukoricaföldeken kémiailag védekezhetünk a gyomok ellen anélkül, hogy ezzel károsítanánk a kukoricát. Továbbá beültették a Bacillus thüringiensis nevű baktérium faj rovarölő génjét (Bt-toxin), amely a kártevők ellen teszi rezisztensé a növényt, hiszen kártevő elpusztításához szükséges vegyszert maga a növény termeli. A 2. generációs GMO-k olyan gazdasági haszonnövények, amelyek a fogyasztók számára hasznos anyagot termelnek nagyobb mennyiségben. Ilyenek pl. az olajsav összetételében megváltoztatott repce és szója, a ferritin (vasraktározó fehérje) tartalmú saláta, stb. A 3. generációs GMO-k bioreaktoroknak, ill. gyáraknak tekintetők, mert olyan anyagokat termeltetünk velük, amelyeket hagyományosan az ipar produkál: kórokozók elleni vakcinákat, hormonokat (pl. inzulin), véralvadásban szerepet játszó anyagokat stb. Genetikailag módosított haszonállatok, mint pl. gyorsabban növekvő lazac, több kazein fehérjét kifejező transzgénikus tehén, különféle emberi transzgéneket a májában kifejező sertés, abból a célból, hogy a mája átültethető legyen emberbe. Argentin tudósok emberi anyatejet adó szarvasmarhát állítottak elő. Milyen előnyök származtathatnak a GMO növényekből. Csökkentik a növények, állatok, emberek, környezet növényvédőszer terhelését. Megtakaríthatók a permetezési és vegyszerköltségek. Mivel a Bt-toxint a növény termeli, a nem kártevő ízeltlábúak között sokkal kevesebb kárt okoz, mint a hagyományos, vegyszeres rovarirtás (méhek pusztulása). A gyomirtás totális gyomirtószerekkel könnyen megoldható. Csökkentik az öntözővíz, talajjavító anyag és műtrágya szükségletet. Bioszintetizátor élőlények: gyógyszer-, hormon-, enzim-, és szervtermelő állatok. Ellenérvek. A rezisztens növények elszabadulása a természetben, a transzgén megszökése. A szél által terjesztett pollen a szomszédos, hagyományos állományokban is beporoz, ez a hagyományos fajták termelőinek és különösen a biotermesztőknek gazdasági kárt okoz, mivel az ő termékeiket is GM-tartalmúnak kell megjelölni. Abban az esetben, ha a GM-növénybe antibiotikumrezisztencia-gént is beültettek, a rezisztenciáért felelős gén(ek) átkerülhetnek az emberek és állatok szervezetében élősködő baktériumokba és azok ellenállóvá válhatnak az antibiotikummal szemben, hatástalanná téve az antibiotikumok orvosi alkalmazását és számos betegség gyógyítását. Mérgezőképesség emberre és állatra, allergia kiváltása, új allergének megjelenése. 5

6 A Bt-toxint a növény minden sejtje termeli, mennyisége kb szerese a hasonló permetezőszer egyszeri ajánlott dózisának. A talajba szántott növényi részekben lévő toxin lassabban bomlik el, mint a hasonló permetezőszer toxinja. Alig ismerjük a genetikailag módosított szervezetek környezeti, ökológiai, egészségügyi, társadalmi hatásait és kockázatait. Az örökítő anyag meghatározását Oswald Avery végezte el 1941-ben. Avery kísérleteiben a transzformációt előidéző baktériumkivonatot előzetes kémiai tisztítási eljárásnak vetették alá. Azt találták, hogy a baktériumkivonatból poliszacharidok (amiláz), lipidek (lipáz), proteinek (proteáz) és ribonukleinsav (RNáz) vonható ki anélkül, hogy a transzformáció mértéke lényegesen csökkenne. Azonban, amikor DNS-bontó enzimekkel DNáz - kezelték a kivonatot a transzformáció elmaradt. Tehát a transzformációért felelős anyag minden kétséget kizáróan a DNS, mivel a transzformáló képességet DN-áz készítménnyel való kezelés megszüntette ben Alfred Hershey és Martha Chase baktériumokat fertőző és pusztító vírussal, ún. bakteriofágokkal végeztek vizsgálatokat. Mint minden vírus, a fágok is alapvetően két részből állnak: a központi információtároló DNS-ből, és az ezt körülvevő fehérjetokból, a kapszidból. Röviden a fertőzés úgy történik, hogy a fág hozzátapad a baktérium felületéhez, egy enzim feloldja a baktériumsejt falát, s az így keletkezett nyíláson a DNS behatol a baktériumsejtbe. A fág fehérjeburka a sejten kívül marad. A bejutott fáganyag csakhamar elszaporodik a sejt anyag és energiakészletét felhasználva. A fágok érése után a már halott baktériumsejt felreped, és mintegy 1OO-5OO új, fertőzőképes fág szabadul ki belőle. 6

7 Hershey és Chase a kólibaktérium (Escherichia coli) ún. T2-fágját tanulmányozta. Ezzel a fággal olyan baktériumokat kezeltek, melyeket előzőleg radioaktív foszfort ( 32 P) tartalmazó foszforsav ill. radioaktív ként ( 35 S) tartalmazó MgSO 4 tartalmú táptalajon tartottak. A baktériumsejtből kiszabaduló érett fágok a fenti izotóppal jelölődtek, a radioaktív kén a fehérjékbe, a radioaktív foszfor a DNS-be épült be. Az így jelölt fágokkal kólisejteket fertőztek. Rövid idő után rázással a fágokat eltávolították a baktérium felületéről, majd megmérték a baktériumtömeg aktivitását. Azt tapasztalták, hogy a radioaktív foszfort tartalmazó bakteriofágok által megfertőzött baktériumok mutatták a radioaktivitást, míg a radioaktív kénnel megfertőzött baktériumok a rázást követően nem. Ebből egyértelműen következik, hogy a fág-dns nagy része bejut a baktériumsejtbe, a fehérje nagy része pedig kint marad. A baktérium szétesése után a kikerülő fágok 35 S-t nem, de 32 P-t nagy mennyiségben tartalmaztak. Miután egy sejtet egy fág fertőz meg, de ugyanakkor a sejt pusztulásakor több száz fág is keletkezhet, a vírus-dns-nek valamilyen módon sokszorozódnia kell. E problémára Matthew Meselson és Franklin Stahl 1958-ban megdönthetetlen bizonyítékokkal alátámasztott kísérlettel adták meg a választ. A kísérlet során kóli baktériumokat tenyésztettek több generáción át 15 N, tehát nehéz nitrogén-tartalmú tápoldatban. A baktérium DNS-ébe bekerült a 15 N izotóp, vagyis a sejtek nehéz DNS-t tartalmaztak. Majd ezt követően átoltották a baktériumok egy részét normál, 14 N-es tápoldatba. Egy sejtosztódás után mintát vettek, izolálták a DNS-t, és meghatározták a sűrűségét. Ugyanezt megtették a második osztódást követően is. Az első osztódás után csak közepes sűrűségű DNS-t kaptak. A második sejtosztódást követő eredmény szerint a mintában 50-50%-ban volt jelen közepes sűrűségű, és könnyű, azaz normális sűrűségű DNS. A kísérlet eredménye a DNS megkettőződésének replikációjának szemikonzervatív mechanizmusával értelmezhető. A DNS-molekulában észlelhető szabályosság a bázisok komplementaritása képezi az alapját a genetikai információ egyértelműen pontos másolásának, a replikációnak. A replikáció során az egymástól különváló két szál egy-egy újabb DNS-szál szintézisének mintájaként, templátjaként szolgál. új II. szál 5'... T-T-C-A-G-G-T-C...3' régi I. szál 3'... A-A-G-T-C-C-A-G...5' régi II. szál 5'...T-T-C-A-G-G-T-C...3' új I. szál 3'... A-A-G-T-C-C-A-G...5' 7

8 A DNS bázissorrend állandóságának alapja a DNS-szintézis szemikonzervatív jellege. Ez annyit jelent, hogy a replikáció során elváló DNS-láncok templátként szolgálnak az új láncok szintéziséhez. Az utód DNS-molekulák egyik lánca a szülői DNS-ből származik, a másik komplementer lánc újonnan szintetizálódik hozzá (szemikonzervatív félig megmaradó - jelleg). A replikáció mechanizmusa A replikáció a DNS-szál szigorúan meghatározott részén, az ún. kezdő iniciációs - ponton indul meg, amit replikációs origónak nevezünk. 1. A másolást megelőzően a kromoszóma szakaszhoz kicsavaró fehérjék helikázok - kapcsolódnak. Kettős hélix alakban a replikciót meghatározó bázisok kevéssé hozzáférhetők, mivel a kettős hélix centrális részében helyezkednek el. A folyamatban résztvevő enzimek felszakítják a bázisok közötti H-kötéseket, aminek következtében a DNS-szakasz átmenetileg kinyílik, a DNS-szálak elválnak egymástól. E. coli-ban kb kicsavaró fehérje működik egyszerre. A kialakult egyfonalas DNS-szakaszokat stabilizálni kell. Az egyfonalas szakaszokhoz egyszálú DNS-t kötő fehérjék kapcsolódnak, amelyek megakadályozzák a kettős hélix formába való visszarendeződést. A szabaddá vált DNS-szakaszon a DNS-függő RNS polimeráz segítségével megindul a DNS-száléval komplementer, ribonukleotid egységből RNSprimer szintézise. 2. A primer RNS 3'-OH végéhez a DNS polimeráz-iii lépésenként dezoxiribonukleotidtrifoszfátokat kapcsol. A folyamat energia igényét a pirofoszfátok hidrolízise biztosítja. Az új szál tehát 5' 3' irányba nő. Ahogy az új szál hosszabbodik, a kicsavaró fehérjék elválasztják a komplementer szálakat, kialakítják a replikációs villa újabb szakaszait. Mivel a DNS két szála ellentétes polaritású úgy szintézisük is ellentétes irányba történik, hiszen a szintézis iránya mindig 5 3. Minthogy a kicsavaró fehérjék csak az egyik irányba haladnak, azaz a replikációs villa csak az egyik irányba nyílik szét, csak az egyik szál szintézise lehet folyamatos, az, amelynek növekedési iránya megegyezik a helikázok haladási irányával. Ebből következik, hogy a másik ellenkező irányba növő szál szintézise csak szakaszosan mehet végbe. (Okazakifragmentek) Az ellenkező irányba növekvő szálon a szintézis RNS nukleotidegység összekapcsolásáig tart. Az RNS primert a polimeráz I távolítja el, majd helyére komplementer dezoxiribonukleotidokat épít (kitölti a hézagokat). 3. Az egyes DNS-szakaszokat (fragmenteket) a ligáz kapcsolja össze úgy, hogy két nukleotidegység között foszfodiészter kötés kialakulását katalizálja. 8

9 A DNS megkettőződése bonyolult, több lépésből álló folyamat, melynek lebonyolításában több enzim vesz részt. Az E. coli félóránként kettőződik, vagyis ezalatt a sejtnek újabb teljes DNS-t kell szintetizálnia. Tehát a folyamat igen gyors, a kb. 4 millió bp.-ból álló E.-coli DNS nagyjából 20 perc alatt lemásolódik. Ez azonban csak akkor történhet meg, ha a felnyílás és a másolás egy időben egyszerre több helyen indul meg. A replikáció pontossága A tulajdonságok megfelelő öröklődése szempontjából rendkívül fontos, hogy az örökítő anyagot a sejtek pontosan lemásolva adják át egymásnak. Ennek biztosítéka egyrészt a másolás pontossága, másrészt a replikáció során történt hibák kijavítása. E. coli DNS replikációja során átlagosan egyetlen hiba fordul elő 10 9 bázis beépülésekor. Az emberi genom haploid sejtenkénti DNS állomány 3 milliárd bázispárból épül fel, tehát replikációjakor átlagosan 3 hiba történik. A replikáció ilyen pontosságáért a hibajavító mechanizmusok felelősek. A replikációban bekövetkező hibák korrigálásáért a DNS polimeráz I felelős. A DNS polimeráz I felismeri a deformált szakaszt, majd a hiba mellett hasadékot létesít a DNS-szálon. A polimeráz I megfelelő nukleotidokat épít a hibásak helyébe 5' 3' irányba folyó szintézissel. Az enzim 5' 3' nukleáz aktivitással kihasítja a hibás szakaszt. A DNS ligáz az új szálat a régivel összeköti. A DNS polimeráz korrigáló működésének a hiánya emberben, pl. a xeroderma pigmentosum nevű igen súlyos betegség kialakulásához vezethet. A betegek bőre rendkívül érzékeny a napfényre ill. az UV sugárzásra. A bőr igen száraz, a szemlencse szarusodik, rendszerint több helyen bőrrák alakul ki, aminek következtében a betegek már a 30.-életévük előtt meghalnak. Az UV sugárzás a bőrben timindimereket hoz létre. A pirimidinbázisok UV fénnyel történő megvilágítás hatására egymással kovalensen összekapcsolódnak. Ezek nem illeszkednek be a kettős helixbe, megállítják a replikációt mindaddig, amíg a polimeráz- I ki nem hasítja a hibás szakaszt és helyére megfelelőt nem épít. Egészséges emberben a repair mechanizmus a dimereket kihasítja a DNS-ből. A betegekben a javítórendszer hiányzik, a dimerek bennmaradnak a DNS-szálban. A hibás DNS kijavításának hiányával összefüggő, ritka betegségek mind korai halált okoznak: mint pl. a Gilford-szindróma, amely a gyermekkorban az aggkorra jellemző tünetek kialakulása jellemző. Transzkripció - átírás Az élő szervezetek bármilyen életjelensége - anyagcsere, mozgás, stb. - fehérjék működésén keresztül valósul meg. A különböző funkciókért specifikus fehérjék felelősek. Specifitásuk az aminosav sorrendjükben rejlik. Az aminosavsorrend információja a DNSmolekula bázissorrendjével hozható összefüggésbe. Eukariótákban az információt hordozó DNS a sejtmagban helyezkedik el, ugyanakkor a fehérjék szintézise a citoplazmában folyik. A DNS tehát közvetlenül nem szolgálhat mintaként (templátként) a fehérjék szintéziséhez. Ebből az következik, hogy a DNS az információt egy közvetítő molekulának adja át, amely kijutva a citoplazmába irányítja a fehérjék szintézisét. Ezt a szerepet a hírvivő, vagyis a messenger RNS (mrns) látja el. A DNS információjának RNS-molekulára átírását transzkripciónak nevezzük. E folyamattal nemcsak az mrns szintetizálódik, hanem az összes RNS is (trns, rrns). A sejten belül az információáramlás a következő úton halad (centrális dogma): DNS transzkripció RNS transzláció fehérje tulajdonság 9

10 Az információtároló DNS és az információt közvetítő RNS közötti kémiai különbség csekély: DNS dezoxiribóz timin kétszálú hélix RNS ribóz uracil egyszálú Az RNS-ek szintézisét DNS-templáton az RNS polimeráz katalizálja, melynek feladata, hogy a nukleotidtrifoszfát egységeket lépésenként összekapcsolja a mintául szolgáló DNS bázissorrendjének megfelelően. Mechanizmus 1. Kezdés (Iniciáció). Az RNS polimeráz felismeri és hozzá kötődik az átírás kezdőpontjához a promoterhez. A kapcsolódáskor DNS két szála elválik egymástól, majd az értelmes szálon megindul az átírás a bázisok párosodási szabályainak megfelelően. A = U, G = C 2. Folytatás (Elongáció). A startjeltől kezdve az RNS polimeráz leolvasva a DNS értelmes szálát, a ribonukleotidokat foszfodiészter kötéssel kapcsolja egybe. A DNS kettős hélixnek csak az egyik szála íródik át (értelmes szál), a másik soha (néma szál). Az értelmes szál DNSszakaszonként változhat, de egy adott génre mindig állandó. A kialakuló RNS-szál átmenetileg összekapcsolódik a DNS templáttal, majd miután azonban az RNS-DNS kettős hélix labilisabb, mint a DNS-DNS kettős, a polimeráz továbbhaladása után a DNS kettős hélix újra záródik, az RNS leválik. 3. Befejezés (Termináció). A szintézis addig tart, amíg az RNS polimeráz eléri a szintézis befejezését jelentő stopjelt (szignált). A lánc vége előtt egy U-ban gazdag szekvencia található, amely az átírást követően egy hajtűhurkot palindróma - kialakítva megakasztja az enzimet, miáltal az átírás befejeződik

11 A prokariotáknál a transzkripció és a fehérjeszintézis csaknem szimultán folyamat, az mrns 5' vége még jóval a lánc szintézisének a befejezése előtt hozzákapcsolódik riboszómákhoz, s ezen a szakaszon már megkezdődik a fehérjeszintézis. Eukariotáknál az RNS polimeráz hatására kialakuló poliribonukleotid még nem teljes értékű végtermék, biológiai feladatának betöltése érdekében többféle átalakuláson, érésen kell keresztül mennie, mielőtt kikerül a citoplazmába. Az RNS érési folyamatai eukariótáknál (poszttranszkripciós módosítások) 1. Az mrns két végéhez különböző szerkezeti elemek kapcsolódnak. 2. Az elsődlegesen elkészült mrns-ből különböző méretű szakaszok hasadnak ki. Ez a splicing. 1. Az mrns két végéhez különböző szerkezeti elemek kapcsolódnak: védősapka, cap-képződés az 5'-végen. Poli-A farok a 3'-végen. A mrns-nek nemcsak a szintézise, hanem a lebontása is az 5'-végen kezdődik. A sejtben levő nukleázokkal szemben az ún. sapka védi az 5 véget. A cap felépítésére jellemző, hogy az utolsó bázis gyakran G, aminek 7- helyzetű N-je metilálva van (m7g), így ez extra + töltést visel, ami elektromos taszítást eredményez. Közvetlenül a transzkripció után, az RNS 3'-végéhez kb adenin nukleotidot tartalmazó poli-a farok kapcsolódik a fenti okok miatt. Az eukarióta gének néhány tulajdonsága Génnek nevezzük a DNS-molekula adott szakaszát, amely valamilyen öröklődő jelleg kialakulását megszabja egy adott polipeptidlánc kódolásán keresztül. A fejlődés különböző szintjein álló szervezetek DNS-ének információtartalma eltérő. Vírusok esetén a DNS túlnyomó része hordoz információt, sőt átfedés folytán egy-egy szakasz több információt is tartalmazhat. Prokariotákban a DNS zöme átíródik, csak elenyésző része nem. Eukariótákban azonban a DNS-nek csupán néhány %-a hordoz információt, másik nem nagy része valamilyen egyéb feladatot tölt be (szabályozó régió) és tekintélyes részének jelenleg a funkcióját nem ismerjük. A haploid egyszeres kromoszómakészletű - sejtek teljes genetikai állománya a genom. Az eukarióta genom szerveződésére jellemző, hogy a genom mérete sokkal nagyobb, mint a róla átírt, érett RNS-é. Ez azt jelenti, hogy az információ a DNS-ben nem kontinuus. Emberben ma kb gén létét feltételezik, aminek mérete a teljes genom 1-2 %-a, azaz a gének kisebb nagyobb távolságra találhatók egymástól és őket át nem íródó szakaszok választják el. A genom 98 %-ának a funkciója ma még pontosan nem ismert, egy részük a gének átíródási kifejeződési folyamatait irányítják, hiszen egy adott sejten belül a teljes génállomány töredéke fejeződik ki. 11

12 2. Az mrns hasítása - splicing. Sőt ezen túlmenően a gének tartalmaznak intron (intragén) szakaszokat, aminek átírási terméke az érett messengerből kivágódik, és tartalmaz exonokat, amelyek a gének kifejeződő szakaszai. Az exonokat egymástól nukleotidpárból álló intron szakaszok választják el. A kétféle DNS-szakasz aránya a genomban változatos, az intron mennyisége gyakran többszöröse az exonénak. A gén átírása folyamatos, a keletkező elsődleges átiratból egymást követő lépésekben hasadnak ki az üzenetet nem tartalmazó intron szakaszok és a szabadon maradt végek egymással összeillesztődnek. A folyamatot splicingnak nevezik. A vágó-illesztő folyamat mechanizmusának rendkívül pontosnak kell lennie, egy nukleotidot sem tévedhet, mert teljesen megváltozna az információ tartalom. A DNS-ről tehát transzkripcióval egy igen rövid életidejű elsődleges átirat keletkezik, amelyet régebben heterogén nukleáris RNS-nek, röviden hnrns-nek neveztek. Ezt követően felkerül a cap és a poli-a farok. Majd ezek után következik a splicing, azaz az intronok kihasítása. A splicing mechanizmusáért RNS-ből és egy sor fehérjéből álló kis komplex gömböcskék, ún. kis sejtmag ribonukleoproteinek - small nuklear ribonucleoprotein, röviden snrnp felelősek. Az snrnp ejtése: sznörp, amely a hupikék törpikék néven ismert rajzfilmfigurák -angolul smurfs - nevére rímelő lefordíthatatlan szójáték. A genetikai információ realizálódása - transzláció: a fehérjék bioszintézise Ha a DNS az élet tervrajza, akkor ehhez a fehérjék a tégla és a habarcs. De valójában ők jelentik a sejt vagy az élő szervezet összeszerelésekor az állványt és a szerszámokat, sőt ők azok a munkások, akik a kivitelezést végzik. A genetikai információt a DNS-molekula hordozza. Az információ továbbításáért az mrnsmolekulák felelősek. A kérdés az, hogy a DNS-ben foglalt egydimenziós információ - nukleotid sorrend - a különféle RNS-molekulák aktív részvételével hogyan határozza meg a specifikus fehérjemolekulák aminosav sorrendjét, keletkezését. A választ a genetikai kód adja meg, amely egy olyan szabályrendszer, kódolási eljárás (nem anyagi egység), ami szerint a nukleinsavakban szereplő szöveg lefordítható a fehérjékben szereplő szövegre. Ennek a szabályrendszernek a feltárása a biológiai kutatások körében az egyik legnagyobb intellektuális teljesítmény volt. 12

13 A kodonszótár megfejtése (emelt szintű érettségi feladat) A kodonszótár megfejtéséért Robert Holley, Har Ghobind Khorana és Marshall Nierenberg 1968-ban kapott Nobel-díjat. Tervszerű kísérletekkel igazolták a kapcsolatot az mrns bázishármasok és a fehérjék aminosav sorrendje között. Nierenberg kísérletsorozatának első részében olyan mesterséges mrns-t szintetizáltak, amely csupa uracilbázist tartalmazott (poli-u). Ennek segítségével a riboszómákon egy kizárólag fenilalanin aminosavakból álló lánc jött létre. Ez a kodonszótár első megfejtett szava: UUU > Phe (fenilalanin). A kutatók ezután különböző koncentrációjú nukleotidelegyeket alkalmaztak, és figyelték a termékként kapott polipeptidben az aminosavak arányát. Ha például az elegyben csak uracilt (U) és citozint (C) tartalmazó nukleotidok vannak 2:1 arányban, ezek gyakorisága p (U) = 2/3 és q (C) = 1/3. Az egyes bázishármasok keletkezésének valószínűsége föltételezve, hogy kapcsolódásuk véletlenszerű az elemi valószínűségek szorzata lesz. Így például az UUC bázishármas ebben az elegyben x(uuc) = p(u) 2.q(C) = (2/3) 2. (1/3) = 4/27 valószínűséggel keletkezik, s mivel a létrejövő fehérjeláncban éppen ekkora volt a fenilalanin relatív gyakorisága, megállapítható, hogy ez a bázishármas is a fenilalanint kódolja. A genetikai kód A nukleinsavak ABC-je 4 betűs (DNS-ben pl. A,T,G,C), a fehérjéké 20 (aminosavak). Egyetlen nukleotid tehát nem lehet jel kodon -, mert így csupán 4 aminosav beépülését lehetne szabályozni. Ha két-két nukleotid alkotna egy-egy jelet, akkor is csak 4 2 = 16-féle kodon alakulhatna ki. A 3 nukleotidból álló egységek már 4 3 = 64-féle kombinációt hoznak létre, ami bőségesen elegendő a 20-féle aminosav kódolásához. A genetikai információ egységeit, tehát DNS- vagy RNS-nukleotid hármasok ún. tripletek alkotják. Ezeket kodonoknak nevezzük. A kodonok jelentését a kodonszótár tartalmazza. A genetikai kód jellemzői 1. Degenerált, azaz egy aminosavat több triplet határoz meg, hiszen 20 aminosav beépülésére 64 kodon áll rendelkezésre. A leggyakoribb aminosavakat 4-6 kodon is jelöli, pl. az Arg-nak, Ser-nek, Leu-nak 6, a ritkábban előfordulókat viszont csak 1-2, ilyen pl. a Try és a Met. Az AUG-kodon a transzláció start jele (egyben a formil-metionin (21. aminosav) kodonja). Három kodon jelzi a fehérjeszintézis végét, ezeket a tripleteket stop-kodonnak nevezzük, ezek nem kódolnak aminosavakat. A stop jeleknek nincsen, a start jelnek viszont kettő trnsük is van, így a 64-féle kodonhoz csak 62-féle trns tartozik általában. 13

14 2. Univerzális, mivel a genetikai kód a szervezetek fejlettségi szintjétől függetlenül egységes, minden élőlényre igaz (kivéve a mitokondriális DNS-t). 3. Átfedés- és kihagyásmentes, azaz egyetlen nukleotid sem lehet tagja két szomszédos kodonnak. Ha egy vagy két nukleotid kiesik vagy beékelődik, az eltolja a leolvasási keretet, és ezzel értelmetlen aminosavsorrendet hoz létre, ami teljesen működésképtelen fehérjét eredményez (frame shift mutáció). A transzláció mechanizmusa Az mrns kodonjai közvetlenül semmilyen módon nem hozhatók kapcsolatba az általuk kódolt aminosavakkal, mivel szerkezetük nem komplementer. Ezért az aminosavaknak először egy olyan közvetítő molekulához kell kapcsolódni, amely valamilyen módon kapcsolódni képes az mrns-el. A közvetítő molekula a trns amelynek feladata tehát kettős: Az adott aminosavval összekapcsolódik, s mivel szerkezete (antikodon része) komplementer a megfelelő kodonnal, megfelelteti egymásnak az aminosavat és az aktuális kodont. A polipeptidlánc szintézise E-t igényel, ezért előzőleg az aminosavakat magasabb energiaállapotba kell hozni, azaz aktiválni kell. Az aktiválás ATP segítségével történik, majd a befektetett energia konzerválását a trns és az aminosav közötti nagyenergiájú kötés biztosítja. Aminosav aktiválása, a trns feltöltése 1. aminosav + ATP = aminosav-amp + PP 2. Az aktivált aminosav a megfelelő trns 3'-végéhez kötődik. aminosav-amp + trns = aminosav-trns + AMP Az aminosavak kapcsolódását a trns-ekhez specifikus enzimek ún. aminoaciltrns szintetázok katalizálják. Minden aminosavat külön enzim kapcsol trns molekulához, így legalább 20-féle szintetáz létezik. Lásd ábragyűjtemény. A trns szerkezete A trns a ribonukleinsavak között a legkisebb molekula, mindössze nukleotidegységből épül fel. A fehérjéket alkotó 20 aminosav mindegyikének legalább egy, némelyiknek azonban több trns felel meg (összesen 62 féle trns ismert). A trns-nek specifikus háromdimenziós szerkezete van, amely biztosítja a maximális bázispárosodást, a molekula maximális stabilitását. A molekula térbeli szerkezete lóherelevélre emlékeztet. A molekulának 4 specifikus része van. 1. A mrns kodon felismerését biztosító, ún. antikodon rész. 2. Az aminosav megkötésére szolgáló, CCA szekvenciájú 3'-vég 3. Az aktiváló enzimmel való kapcsolódást biztosító enzimfelismerő hely. 4. Riboszóma kapcsolódási hely. 14

15 Az antikodon lehetővé teszi, hogy az adott trnsmolekula, amely adott aminosavat szállít az mrns molekula megfelelő részéhez, a neki megfelelő kodonhoz kapcsolódjon. Az mrns kodon és a trns antikodon komplementaritása a biztosítéka annak, hogy adott DNSbázisszekvenciáról mindig azonos aminosav-szekvencia keletkezzék. A riboszómák A fehérje szintézis helyszínei, rrns-ekből és fehérjékből épülnek fel. Prokarióta sejtekben ezernyi, eukarióta sejtekben sok ezernyi található a citoplazmában, ill. előfordulnak egyes sejtszervecskékben, mint pl. mitokondriumokban, színtestekben. Működésük, hogy az mrns nukleotid sorrendjében foglalt információt fordítják le aminosavsorrendre. Szerkezetük egységes az egész élővilágban, egy nagyobb és egy kisebb alegységből állnak. A nagy alegység köti meg a trns-eket a transzláció során. A nagy alegység felületén három eltérő trns-kötőhely van: E (exit), P (peptidil-trns) és A (aminosav-trns). A két alegység a fehérjeszintézis kezdetén kapcsolódik össze, majd a transzláció végén ismét disszociálnak. A transzláció lépései prokariotákban A polipeptidlánc keletkezésének 3 fő szakasza van. 1. Iniciáció azaz láncindítás. 2. Elongáció azaz lánchosszabbítás. 3. Termináció azaz lánclezárás. Iniciáció A polipeptidlánc szintézise, csakúgy, mint a nukleinsavaké, egy irányba halad. A transzláció iránya, az mrns szintézisének irányával egyezően 5' 3'. Az mrns kevéssel kialakulása után már kapcsolódhat riboszómákhoz és megkezdődhet a polipeptidlánc szintézise. Az iniciáció lépései. Az mrns hozzákötődik a riboszóma kis alegységéhez. Az mrns megkötését a kis alegységben található rrns végzi. Az mrns 5 végének szekvenciája komplementer az rrns-ével. A nagy alegység összekapcsolódik a kicsivel. A start kodon AUG - a P ablakba kerül és hozzá kapcsolódik az első aminosavat szállító -formil-metionin- trns. A metionin később lehasad a polipeptidláncról. A folyamat energia igényét GTP hidrolízise fedezi. 15

16 Elongáció (hosszabbítás) Lényege, hogy a kodon felismerése révén a megfelelő aminosav-trns-ek egymást követően a riboszómához kapcsolódnak, az aminosavak között kialakul a peptidkötés, a kialakult peptidszakasz továbbítódik a riboszóma odébb mozdul - az újabb peptidkötés kialakítása érdekében. A következő trns a riboszómán az A-helyhez kötődik. A riboszóma A-helyére kerülő újonnan érkezett trns aminosava összekapcsolódik a fmettrns aminosav részével. A keletkezett dipeptidil-trns az A-helyen kötődik, míg az aminosavtól megfosztott trns egyelőre még a P-helyen marad. A P-helyen feleslegessé váló trns árkerül az E- helyre, majd leválik a riboszómáról. Egy-egy aminosav kapcsolódása után a keletkező trns az A-helyről a P-helyre kerül (transzlokáció), hogy ez által a következő aminoacil-trns kötődhessen az A-helyhez. A polipeptidlánc az N-terminális felöl nő a C- terminális felé. Termináció Ha a riboszóma A ablaka elérkezik a stop kodonhoz, a transzláció befejeződik. A terminációnak az az oka, hogy a három stop kodonhoz nem kapcsolódik trns, mivel a kodonoknak megfelelő komplementer antikodont tartalmazó trns nincs. A stop-jel felismerését követően a P-helyen levő utolsó trns és az aminosav közötti kötés felszakad, a polipeptidlánc leválik a riboszómáról. A három stop-szignál felismerésében riboszómális fehérjék közreműködnek. Végül riboszóma alegységek disszociálnak. Baktériumokban a fehérje szintézis sebessége rendkívül gyors, másodpercenként akár 30 aminosav is beépülhet. Az intenzív transzlációnak több oka van: az mrns DNS-ről történő transzkripciója alatt, még a nem teljesen kész mrns-en már megindul a transzláció. Ha a riboszóma bizonyos számú kodont már leolvasott, az mrns 5'-végéhez újabb riboszóma kapcsolódhat. Így gyakran egy mrns-en egyszerre jó néhány riboszóma dolgozik, és ún. poliriboszóma alakul ki, ami lehetővé teszi, hogy egy időben egy mrns-ről egyszerre több polipeptidlánc íródjék át. 16

17 Gyakorló emelt szintű érettségi feladatok A fehérjék különbségének vizsgálata Egy faj két populációjából azonos fehérje mintát vettek. Az aminosav sorrend vizsgálatakor kiderült, hogy a fehérjék egyik polipeptid láncának 112. és 117. aminosav közötti szakaszán két aminosav különböző, a többi helyen teljes a megegyezés. Az alábbi táblázat az adott szakasz aminosav sorrendjét mutatja. Az 1. minta esetében sikerült az adott polipeptid lánc szintéziséhez mintaként szolgáló RNS-t is elkülöníteni és bázissorrendjét megállapítani. Az adott szakasz bázissorrendje a következő volt: Milyen a bázissorrendje az információt tároló DNS adott szakaszának? Időközben a 2. minta megsemmisült, így az mrns-t nem tudták elkülöníteni. Adja meg a kodonszótár segítségével a 2. mintában eltérő aminosavak lehetséges kodonjait! 3. A Gly lehetséges kodonjai: 4. A Tyr lehetséges kodonjai: Az eddigi ismeretek alapján állítsa össze a 2. minta mrns-ének bázissorrendjét az adott szakaszon, feltételezve, hogy egy bázishármason belül csak egy bázis változott meg. Írja le, hogy az eredeti DNS átíródó szálán milyen bázisnak mivé kellett változnia, ahhoz, hogy a fenti eltérés kialakuljon! 17

18 6. A 113. aminosav esetében: 7. A 115. aminosav esetében: Megoldás A kodonszótár megfejtése A kodonszótár megfejtéséért Robert Holley, Har Ghobind Khorana és Marshall Nierenberg 1968-ban kapott Nobel-díjat. Tervszerű kísérletekkel igazolták a kapcsolatot az mrns bázishármasok és a fehérjék aminosavsorrendje között. 1. A kísérlet elvégzésekor a bázishármasok léte még nem volt bizonyos, a kódolás módjáról többféle elképzelés is napvilágot látott. Indokolja, hogy a kutatók milyen elméleti megfontolás alapján kerestek mégis bázishármasokat, és nem két bázisból álló egységeket! 2. A sikeres kísérlet feltétele a kémcsőben is végrehajtható mesterséges fehérjeszintézis volt. Melyik baktériumokból is kinyerhető sejtalkotóra volt feltétlenül szükség ehhez a szintézishez?. Nierenberg kísérletsorozatának első részében olyan mesterséges mrns-t szintetizáltak, amely csupa uracilbázist tartalmazott (poli-u). Ennek segítségével a riboszómákon egy kizárólag fenilalanin aminosavakból álló lánc jött létre. Ez a kodonszótár első megfejtett szava: UUU > Phe (fenilalanin). A kutatók ezután különböző koncentrációjú nukleotidelegyeket alkalmaztak, és figyelték a termékként kapott polipeptidben az aminosavak arányát. Ha például az elegyben csak uracilt (U) és citozint (C) tartalmazó nukleotidok vannak 2:1 arányban, ezek gyakorisága p(u) = 2/3 és q(c) = 1/3. Az egyes bázishármasok keletkezésének valószínűsége föltételezve, hogy kapcsolódásuk véletlenszerű az elemi valószínűségek szorzata lesz. Így például az UUC bázishármas ebben az elegyben x(uuc) = p(u) 2.q(C) = (2/3) 2. (1/3) = 4/27 valószínűséggel keletkezik, s mivel a létrejövő fehérjeláncban éppen ekkora volt a fenilalanin relatív gyakorisága, megállapítható, hogy ez a bázishármas is a fenilalanint kódolja. 18

19 Tételezzük föl, hogy kísérletünkben Nierenberg módszerét alkalmazzuk, és az elegyben 1/2 :1/2 arányban adenin- és uraciltartalmú nukleotidokat oldunk. 3. Mit tartalmaznak ezek a nukleotidok az adeninen és uracilon kívül?. és. 4. Milyen típusú kémiai reakcióval kapcsolódnak össze a nukleotidok?. 5. Hányféle bázishármas jöhet létre, ha kísérletünkben tetszés szerinti sorrendben kapcsolódhatnak? A kapott kodonszótár segítségével állapítsa meg, hányféle aminosav alkothatja az ezen mrns láncok alapján létrejövő fehérjéket! Magyarázza a két számérték különbségét! Hányfélék a bázishármasok? Hányféle aminosav?. A különbség okai:. 6. Állapítsa meg, hogy az adott elegyben várhatóan mekkora lesz a izoleucin (ile), illetve a leucin (leu) aminosavak aránya a fölépülő peptidláncban, ha feltételezzük, hogy a szintetikus mrns-ben bármelyik nukleotid azonos eséllyel kapcsolódik bármelyik másikhoz! leucin izoleucin arány: Tételezzük fel, hogy a fenti kísérletben 4 aminosavból álló peptidlánc keletkezett. Adja meg, hányféle lehetséges sorrendben kapcsolódhatnak össze ebben az aminosavak! Megoldás 1. Báziskettősök esetén csak 4 2 = 16 féle aminosav kódolására volna lehetőség, holott a természetben 20 (21) féle van. 2. riboszómákra 3. foszforsavat / foszforsavmaradékot és cukrot / ribózt / pentózt 4. (Poli)kondenzáció / észterképződés. 5. Nyolcféle (AAA, AAU, AUA, UAA, AUU, UAU, UUA, UUU). Hatféle aminosavat kódolhatnak, mert egy STOP jel van köztük, egy aminosavat (az izoleucint) pedig két bázishármas is kódol. 6. A leucin-izoleucin arány: 1: (= 1296) 19

20 Fehérjeszintézis Egy DNS-molekula részletének bázissorrendje látható a táblázatban: 1. Mi jellemző erre a DNS szakaszra? 3 pont A) Amikor ez a DNS-molekula megkettőződik, a molekularészlet harmadik bázisához a bázispárosodás alapján egy timin kapcsolódik. B) A molekularészlet 4. bázisa 2 hidrogénkötéssel kapcsolódik a kiegészítő polinukleotidszál megfelelő bázisához. C) Eukarióta sejtekben előfordulhat a színtestekben is. D) Baktériumok sejtmagjában is előfordulhat. E) Riboszómák alkotórésze lehet. F) Kondenzációs reakciók sora hozta létre. 2. A bázispárosodás szabályait Erwin Chargaff ismerte föl még azelőtt, hogy a DNS szerkezetét kiderítették volna. Chargaff különböző fajú élőlények DNS-eit hidrolizáltatta, és a nukleotidok arányát vizsgálta. Mit állapíthatott meg? 2 pont A) A kétgyűrűs purin- és az egygyűrűs pirimidintartalmú nukleotidok száma bármely faj egyetlen egyedében mindig megegyezett. B) Az adeninek és timinek aránya fajra jellemző volt. C) Az adeninek és guaninok aránya fajonként különbözött. D) Azonos faj két egyedét vizsgálva az adenin- és guaninbázisok aránya mindig azonos. E) Ha egy mintában 25% volt az adenin aránya, akkor 25% volt a guanin aránya is. 3. Ez a DNS-szakasz egy rövid, 5 aminosavból álló peptid génjét tartalmazza (a peptidszintézis során ez az átíródó szál). A peptid első aminosava: lys (lizin), a második aminosava: gly (glicin). A kodonszótár segítségével állapítsa meg, mi a következő három aminosav (elegendő a hárombetűs rövidítéseket megadni)! Kodonszótárt lásd fent! harmadik aminosav:... negyedik aminosav: ötödik aminosav: Mi a jelentése a molekularészlet utolsó bázishármasáról készült mrns-kodonnak? 5. Tételezzük fel, hogy sejtosztódás előtt az adott DNS-molekularészlet 10. bázisának helyére pontmutáció során egy másik bázis épül be, és e hiba átkerül az utódsejtekbe is. Hogyan befolyásolja ez a változás a létrejövő peptid aminosavsorrendjét? Válaszát indokolja!. 6. A példaként megadott DNS-szakasz egy része nem peptidet kódoló génhez tartozik. Milyen más szerepe lehet még az ilyen DNS-részleteknek? Nevezzen meg egy lehetséges funkciót! 20

21 Megoldás 1. A, C, F 2. A, C 3. Arg, Pro, Ala 4. Stop-kodon: befejeződik a leolvasás / fehérjeszintézis / transzláció. 5. Semmilyen változás nem történik, mert bármi is az adott bázishármas harmadik tagja, mindenképpen Gly épül be a polipeptidbe /a genetikai kód degeneráltsága miatt 6. Lehet szabályozó szerepe, például operátor / promoter szakasz. Lac-operon Génműködés szabályzása a prokariótákban A baktériumok tápanyagok levesében úszva élnek. Sokféle különböző cukor fordulhat elő a környezetükben. Ezek felvételéhez és lebontásához szükséges enzimek egyidejű termelése sok energiába kerülne. A baktériumok érzékelni képesek a rendelkezésre álló cukor típusát és csak akkor termelik a felvételhez és lebontáshoz szükséges enzimeket, ha szükség van azokra (enzimindukció). A génműködés szabályozását leíró modell az operon. Az operon általi génműködés szabályozás a sejtek gyors és hatékony alkalmazkodását teszi lehetővé az adott környezeti feltételekhez. A laktóz-operon röviden lac-operon - volt az elsőként leírt génregulációs mechanizmus, aminek felfedezésért két francia kutató, a párizsi Pasteur Intézetben dolgozó Francois Jacob és Jacques Monod Nobel Díjat kaptak 1965-ben. Az operon tehát a génműködés-szabályozás egysége. Megkülönböztetünk a DNSmolekulában strukturális géneket, amelyek fehérjék aminosavsorrendjét kódolják, átíródnak és továbbá régió szakaszokat, amelyekről nincs átíródás nem kódolnak fehérjét -, ezek a struktúrgének átíródását lehetővé tevő szabályozó - egységek. A lac-operon a következő elemekből áll: három strukturális (szerkezeti) gén. Az E. coli a laktózt a β-galaktozidáz enzimmel bontja le, melyet lac Z gén kódol. A laktóz felvételéhez szükséges a permeáz enzim is, melyet a lac Y strukturgén kódol. Egy harmadik, a laktóz hasznosításához közvetlenül nem fontos gén a transzacetiláz (lac A,) is ugyanebbe a csoportba tartozik (piroszőlősav bontásához kell). A transz-acetiláz pontos funkciója nem ismert, eltávolítása nem gátolja számottevően az operon működését. Promóter (lac P), az RNS polimeráz kapcsolódási helye, operátor régio (Lac O), egy olyan DNS szakasz, ahol egy gátló (represszor, regulátor) fehérje képes megkötődni, megakadályozva a fenti strukturgének átírását, abban az esetben, ha nincs laktóz a tápanyagok között. 21

22 Nem tartozik a lac operonhoz, - de alapvetően szükséges annak működéséhez -, az ún. lac I gén. A laci gén kódolja a represszor fehérjét, amely tehát laktóz hiányában az operátorhoz kapcsolódva blokkolja a strukturális gének átíródását. Tehát röviden még egyszer a lac operon áll: promoterből (indító régió) (lac P), operátorból (operátor régió) (lac O), és lac Z, A és Y strukturgénekből áll. Laktóz hiányában a represszor fehérje (lac I terméke) az operátorhoz kapcsolódik és megakadályozza a strukturgének átírását. A környezet laktóz tartalmát a represszor fehérje érzékeli. A laktóz jelenlétében a represszor megköti a laktózt, konformációja megváltozik, levállik az operátorról és nem képes tovább akadályozni az RNS polimerázt a strukturgének átírásában. A lac Z,Y,A gének átírása promóteren kezdődik, ahol az RNS polimeráz megkötődik a DNS-en. Eredményül átíródnak a strukturgének, fokozódik a laktóz felvétele, lebontása. A triptofán operon (trp-operon) A lac-operon egy lebontó anyagcsereutat szabályoz, a laktóz kötődése a represszorhoz serkenti a strukturgének átírását. A trp-operon egy felépítő utat, a triptofán aminosav szintézisét befolyásolja. A Trp kötődése a represszorhoz gátolja a génátírást. A trp-operon egy promoter és egy operátor régióból egy ún. leader-szekvenciából és öt strukturgénből áll. Tehát, ha nincs trp, akkor történhet transzkripció, így a trp-szintézis megindul; ha van trp a rendszerben, akkor trp-represszor fehérje trp-nal kapcsolódva aktiválódik, megtörténik az operátor régióhoz való kötődés, és a transzkripció gátolt lesz. A trp-operonban nemcsak az átírás kezdetét (iniciáció) lehet szabályozni, hanem a végét is (termináció). Ez utóbbi folyamatot attenuációnak nevezzük, és a leader-szekvencia révén megy végbe. (bonyolult) 22

23 Gyakorló emelt szintű érettségi feladatok A DNS összetétele és működése A következő ábra Jacob és Monod francia tudósok által leírt, egyes baktériumokban működő tejcukor operont mutatja. Azonosítsa az operon elemeit! 2. Nevezze meg a funkció feltüntetésével, hogy mit jelöltünk az ábrán: 1-es számmal: 2-es számmal:. 5-összámmal :... Mi jellemző az ábra további részeire? A megfelelő betűjelet írja az állítás után! A) A 3-as és 4-es részletre igaz B) A as részletre egyaránt igaz C) A as részletre igaz D) Egyikre sem igaz 3. Fehérje. 4. Fehérjék készülnek az információja alapján. 5. Nukleotidok alkotják. 6. Ez a szakasz szabja meg a szabályozó fehérje aminosavsorrendjét. 7. Olyan DNS-szakasz, ami nem kódol fehérjét. 8. Az enzimfehérjéket kódoló gének. Megoldás 2. az 1-es számmal jelölt: RNS-szintézist végző / polimeráz enzim a 2-es számmal jelölt: a szabályozó/gátló /represszor fehérje az 5-ös számmal: tejcukor/laktóz/jelként ható vegyület / enziminduktor 3. D 4. C 5. B 6. D 7. A 8. C 23

24 Operonok Az 1. ábra az Escherichia coli baktériumban a laktóz lebontását végző enzimek termelődésének szabályozását foglalja össze. Az a) jelű sor a laktóz hiányában, a b) jelű a laktóz jelenlétében végbemenő folyamatokat mutatja. Tanulmányozza alaposan az ábrát, majd egészítse ki a szöveget! 1. A laktóz lebontását végző enzimek 1,2,3- mal jelölt génjeinek összességét..- eknek nevezzük. Ezekről a génekről Jacob és Monod kutatásai szerint laktóz hiányában nem íródik át mrns, mert a(z) hozzákapcsolódik a DNS. régiójához, és megakadályozza, hogy a(z).. végighaladjon a DNS mentén. Ha a baktériumot laktóz tartalmú táptalajra helyezik, a.. hozzákapcsolódik a gátló molekulához, így nem áll akadály a lebontását katalizáló enzimeket kódoló mrns-ek átírása elé. 2. Az ábrának mely betűi jelölnek fehérjemolekulát? 1 pont A) A B és a D jelű B) Az A és a G jelű C) A C és az E jelű D) A B és a G jelű E) Az A és az F jelű Az Escherichia coli baktériumban a triptofán (Trp) nevű aminosav szintézisét katalizáló enzimek génjeinek az operonja más elven működik. Ezt ábrázolja a 2. ábra. A megfelelő részeket ugyanazokkal a nagybetűkkel jelöltük, mint a laktóz (lac) operon ábráján. Az a) jelű sor alapállapotban, a b) jelű a triptofán aminosav magas koncentrációja mellett mutatja a folyamatot. 24

25 3. Fogalmazza meg röviden, hogy mi az alapvető különbség a két szabályozási modell között!. 4. A triptofán operon működésének modellje hasonlít a hormonrendszernél is ismert szabályozási mechanizmushoz. Hogy nevezzük általában ezt a mechanizmust?... A laktóz vagy a triptofán hozzáadása kb. 10 perc alatt fejti ki hatását. (A nyíl az anyag hozzáadásának időpontját jelzi.) 5. Állapítsa meg, hogy a mellékelt diagram a laktóz bontásáért vagy a triptofán szintéziséért felelős enzimek hatását mutatja! Egészítse ki az alábbi hiányos mondatot! Válaszát indokolja! A diagram a. enzimek / enzimjei aktivitásának (koncentrációjának) változását mutatja az idő függvényében, a szabályozó anyag hozzáadását követően. Megoldás 1. struktúrgének Inhibitor/gátlófehérje Operátor RNS polimeráz/ RNS szintetizáló enzim Laktóz / tejcukor 2. A 3. A laktóz bekapcsolja, a triptofán gátolja a struktúrgének átírását. 4. negatív visszacsatolás 5. triptofán szintézis; Indoklás: Az anyag (triptofán) hozzáadását követően az enzimek szintézise csökken. Stresszfehérjék Forrás: Csermely Péter A stresszfehérjék legfontosabb szerepe, a hibás, nem megfelelő harmadlagos szerkezettel rendelkező fehérjék helyretekerése. A stresszfehérjék sejtjeink igen nagy mennyiségben jelen lévő, létfontosságú alkotóelemei. A stresszfehérjék segítsége nélkülözhetetlen abban, hogy a hibás szerkezetű fehérjék megtalálhassák a rájuk jellemző, helyes szerkezetet. A stresszfehérjék szerepe kettős: a hosszabb polipeptidláncok megfelelő harmadlagos szerkezetének kialakítása, a káros stresszhatásoknak kitett, károsodott fehérjék szerkezetének helyreállítása. 1. A kisméretű fehérjék betekeredése kedvező körülmények között másodpercek alatt végbemegy. Sajnos az ennél nagyobb fehérjék igen gyakran tekeredési csapdák áldozatai lesznek. Ebben az esetben a félkész fehérje egy átmeneti állapotban stabilizálódik, a hidrofób aminosavak a fehérje felszínén maradnak. Sajnos a hidrofób felszínek az ilyen félkész fehérjéket egymással való összetapadásra, aggregációra teszik hajlamossá. A fehérje-aggregátumok felszaporodása a legtöbb neurodegeneratív betegség, pl. az Alzheimer-kór, a Parkinson-kór, a prionbetegségek egyik fontos oka. A stresszfehérjéket a többi fehérjét terelgető, szerkezetük kialakításában segítő hatásuk miatt dajkafehérjéknek is nevezik. 25

26 2. Ha a sejtet környezeti stressz éri, a sejtben lévő fehérjék károsodnak, kitekerednek. E fehérjéknek az újratekeredéshez éppen úgy a dajkafehérjék segítségre van szükségük, mint születésük pillanatában. Innen a stresszfehérje elnevezés. Környezeti stressz szinte bármilyen hirtelen változás lehet: lényegesen melegebb (hősokk fehérjék), vagy hidegebb; a környezet lényegesen savasabb, vagy lúgosabb; túl kevés az oxigén, vagy túl sok; vízhiány. Néha azonban a stresszfehérje is tehetetlennek bizonyul. Ha a selejtes fehérje menthetetlen, akkor helyretekerése helyett a lebontása következik be. Ilyenkor a stresszfehérjék pusztulásra ítélt társaikat kitekerik egészen addig, ameddig be nem férnek a lebontó enzimek szűk bemeneti csatornájába. Human Genom Project Az emberi genom a petesejt vagy hímivarsejt teljes genetikai tartalma, amely hozzávetőleg 3 milliárd DNS bázispárból áll. A HGP elsődleges célja volt kideríteni annak a kb. 3 milliárd bázispárnak a pontos sorrendjét, amely az emberi genomot alkotja. A Humán Genom Projekt tizenhárom éven keresztül zajlott, június 26-án Clinton és Blair közös sajtóértekezleten jelentették be a program első ütemének befejezését. A HGP 9 ember DNS-ét szekvenálta le. Meglepetést okozott, hogy csak kb gén van a humán genomban, ami a teljes DNS állomány 1,5 %-át teszi ki (a korábbi becslések mindegyike fölé helyezte a számukat, de van, aki re becsülte). A gének száma mindössze kétszerese a Drosophilában meghatározottaknak. A komplexitás titka nem a gének számában, hanem a gének által meghatározott fehérjék összerakási módjában van rejtve, amiben fontos szerepet játszik az alternatív splicing mechanizmusa, amely következtében egy gén többféle fehérjét is meghatározhat. Tehát a tudománytörténetben jelentős szerepet játszó klasszikus tézis: egy gén egy enzim messzemenően nem igaz. Az adatok alapján megállapítható hogy az exonok átlagos hossza: bp, az intronoké: bp, 1 gén pedig átlagosan 7-9 exonból áll. A fehérjekódot ténylegesen hordozó exonok a teljes szekvenciának a 1,5 %-át adják. Az összes hasznos információt kb. 10 %-a hordozza a DNS állománynak, amely tartalmazza o tehát az exonokat, o a t-és rrns génjeit, o továbbá a gén kifejeződését szabályozó DNS szakaszokat (promoter régió). A szekvenciák alapján 2 embernek 0,1 %-os eltérést mutatott a szekvenciája, tehát az egyezés 99,9 %-os volt. Azaz bp közül átlagosan 1000 különbözik. A HGP következő szakaszában meg kell határozni, hogy az adott tulajdonságot hány gén, azok milyen viszonylatban határozzák meg, az adott gének pontosan melyik kromoszómán helyezkednek el. 26

27 Ma már kb különböző fajú élőlény (köztük 156 eukarióta) teljes genomszekvenciája ismert, de a futó, azaz még nem teljesen befejezett genomprogramok száma megközelíti a tízezret. További eredmények: Az emberi genom mintegy száz különböző, mikro-rns-eket kódoló, evolúciósan konzervált géncsaládot tartalmaz. A mikro-rns-ek olyan RNS molekulák, amelyek fehérjét nem kódolnak, viszont befolyásolják adott mrns-ek transzlációját azáltal, hogy az mrns molekula 3 végéhez kötődve többnyire gátolják a fehérje szintézist. Vagyis a mirns-ek a génkifejeződés poszttranszkripciós szintű negatív szabályozóinak tekinthetők. Az emberi genom mintegy felét adják a különböző transzpozonok, azaz mozgékony, helyváltoztatásra képes genetikai elemek. A genom 45 százalékát alkothatják ezek a szakaszok. Többségük azonban nem aktív, és változatlanul adódik tovább egyik nemzedékről a másikra. Az átrendeződés úgy történhet, hogy a DNS-szakasz kihasad a genomból és egy másik helyen integrálódik. Ekkor a mobilis elem az eredeti helyéről természetesen eltűnik, vagy úgy hogy a DNS-régió megkettőződik, az egyik kópia marad a helyén, a másik máshol integrálódik. A transzpozíció másik fő típusa RNS közvetítésével történik a donor DNS-régió RNS-be íródik át, majd azon mint templáton reverz transzkriptáz segítségével kettős láncú DNS szintetizálódik és az beépül a cél-dns-be. Így történik az immunglobulin-gének átrendeződése a B limfociták differenciálódása során. Az epigenetika jelentősége. Ez a tudományág azzal foglalkozik, hogy a különféle környezeti tényezők hogyan hatnak a genom működésére, a gének kifejeződésére. Az epigenetikus hatások (pl. anyai hatás, táplálék, mozgás, gyógyszerek, mérgek, lelki hatások, fény, stb.) anélkül befolyásolják a gének működését, hogy megváltoztatnák a DNS bázissorendjét. Tehát e tudományterület a genom olyan megváltozásaival foglalkozik, amelyek nem jelentik a DNS nukleotidsorrendjének megváltozását, csak a DNS másodlagos kémiai módosítását (pl. egyes nukleotidok metilációját), vagy a DNS-el szorosan kölcsönható fehérjék módosulásait. A soksejtű élőlényekben az egyedfejlődés különböző szakaszain, ilyen epigenetikus módosulások irányítják a génkifejezés megváltozásait. Kivételes esetekben öröklődhetnek is az epigenetikus módosulások. A DNS-metiláció során metilcsoportok (-CH 3) kapcsolódnak a DNS-hez, be- vagy kikapcsolják a géneket, és szabályozzák a génkifejeződés (génexpresszió) mértékét. Egyes környezeti tényezőkről, például a hőmérsékletről vagy a stresszről, már kimutatták, hogy megváltoztatja a DNS-metilációt, és ezek a változások öröklődők lehetnek nemzedékeken át. Ezt a folyamatot nevezik epigenetikai transzgenerációs öröklődésnek. Az RNS-metiláció alkalmával a metilcsoportok kapcsolódnak mrns molekulákhoz egy olyan folyamatban, amely megváltoztatja a génkifejeződést és az ezt követő fehérjetermelődést. Hasonló epigenetikai hatás, amikor úgynevezett nem kódoló mikro RNS-molekulák kapcsolódnak a DNS-hez, RNS-hez vagy proteinekhez, és a DNS-szekvenciától függetlenül megváltoztatják a génkifejeződést. Röviden összefoglalva A DNS kutatásának fontosabb korai állomásait Friedrich Miescher ( ) 1869-ben felfedezte a DNS-t fehérvérsejtek sejtmagjában. Fred Griffith 1928-ban felfedezte a baktérium transzformációt. Oswald Avery ( ) azonosította a transzformációért felelős, vagyis a genetikai információt hordozó anyag kémiai természetét, azonosította a DNS-t. Erwin Chargaff ( ) 1950-ben megfogalmazza a bázisok arányára vonatkozó szabályt ben Alfred Hershey ( ) és Martha Chase ( ) megdönthetetlen kísérlettel bizonyította Avery eredményét. Hershey1969-ben fiziológiai és orvostudományi Nobel-díjat kapott. James D. Watson (1928-) és Francis H. C. Crick ( ) 1953-ban leírták a DNS kettős hélix szerkezetét. Watson, Crick és Wilkins 1962-ben fiziológiai és orvostudományi Nobel-díjat kapott ban Menselson és Stahl leírták a szemi-konzervatív DNS replikációt. Marshall Nirenberg ( ) és Har Gobind Khorana ( ) 1968-ban a genetikai kód megfejtéséért megkapta a Nobel-díjat. 27

28 Ábragyűjtemény Fred Griffith Oswald Avery Alfred Hershey és Martha Chase Aminosavak aktiválása Splicing 28