Farkas Viktor KORONAÉTER ÉS CIKLOPEPTID ALAPÚ KOMPLEXEK VIZSGÁLATA. Doktori értekezés tézisei

Átírás

1 Farkas Viktor KRNAÉTER ÉS CIKLPEPTID ALAPÚ KMPLEXEK VIZSGÁLATA Doktori értekezés tézisei Témavezető: Majer Zsuzsa, Ph.D., egyetemi docens Hollósi Miklós, D.Sc., egyetemi tanár ELTE-TTK Kémia Doktori Iskola vezető: Inzelt György, D.Sc. Szintetikus kémia, anyagtudomány, biomolekuláris kémia program programvezető: Horváth István Tamás, D.Sc. ELTE Kémiai Intézet, Szerves Kémiai Tanszék 2007

2 Bevezetés Doktori munkám során vizsgáltam királis koronaéterek és 1-(1-naftil)etil-ammóniumperklorát só (1-NEA) közötti komplexképzést, valamint gyűrűs peptidmodellek kalciumionkötését ECD- és FT-IR spektroszkópia illetve mikrokalorimetria (ITC) alkalmazásával. Munkám első részében királis 18-korona-6-típusú koronaéter gazdamolekulák és az 1- NEA között kialakuló komplexeket vizsgáltam ECD-spektroszkópiával. A koronaéterek komplexképzése régóta ismert tulajdonság. Korábbi kutatások során különböző módszerekkel (röntgenkrisztallográfia, NMR, optikai spektroszkópia, MS, mikrokalorimetria) tanulmányozták a képződő diasztereomer-párok szerkezetét és a komplex stabilitásában szerepet játszó másodlagos kötések (hárompontos hidrogénkötés, ππ kölcsönhatás, valamint a nagy térkitöltésű csoportok közötti taszítás) jelentőségét. A vizsgálatokból kiderült, hogy az általunk tanulmányozott koronaéter-típus (1. ábra) heterokirális komplexei [pl.: (R,R)/(S)] általában stabilisabbak, mint a homokirális [pl.: (S,S)/(S)] komplexek. ECD spektroszkópia alkalmazásával hasonló eredményre jutottunk. Egy királis, biológiailag aktív vegyület entantiomerjenek különböző fiziológiai tulajdonságai vannak. A gyógyszerkutatásból ismert példák bizonyítják, hogy ez az eltérő viselkedés, komoly következményekkel járhat a gyógyszerjelölt vegyületek alkalmazásánál. Ezért olyan hatékony analitikai módszerekre van szükség, amelyekkel elválaszthatók egymástól a királis hatóanyag enantiomerjei. Hatékony kromatográfiás megoldásnak bizonyult a királis állófázisok alkalmazása. A királis koronaéterek enantioszelektivitásuk miatt HPLC oszloptöltetként való felhasználásra alkalmasak. Feladatom az volt, hogy a rendelkezésre álló koronaéterek és 1-(1-naftil)etilammónium-perklorát (NEA) komplexképzését vizsgáljam ECD spektroszkópiával (1. ábra), továbbá királis koronaétert kötő szilikagélből HPLC oszlop készítése és tesztelése. Munkám második része az α-laktalbumin (LA) Ca 2+ -kötő helyének modellezésére tervezett és szintetizált ciklopeptidek kalciumion-kötésének vizsgálatával foglalkozik. A kalciumion szerepe nagyon sokrétű, ezek közül az egyik legfontosabb, hogy fehérjékhez kötődve segít kifejteni biológiai hatásukat. Kutatásaink célja az volt, hogy tisztázzuk az LA kalciumion-kötő helyén a konzervált aminosavak szerepét. Az α-laktalbuminok enyhe denaturálódási folyamat során képesek részleges rendezetlen (unfolded) szerkezet kialakítására. Ebben szerepet játszik a harmadlagos szerkezetet stabilizáló kalciumion. Az LA röntgenkrisztallográfiai vizsgálat alapján határozott szerkezetű (hélix-hurok-hélix) Ca 2+ -

3 kötőhelyet mutat, amely különbözik a fehérjék között elterjedtebb ún. EF-hand típusú kötőhelytől. A hurok tíz aminosavat tartalmaz, és ez a szekvencia (-Lys 79 -Phe-Leu-Asp 82 - Asp-Asp-Leu-Thr-Asp 87 -Asp 88 -) a különböző fajokból származó LA-ban csak nagyon kis mértékben különbözik. A fémion-kötődésért elsősorban az Asp 82, Asp 87 és Asp 88 oldalláncok a felelősek, de a torzult pentagonális bipiramisos szerkezet a peptidgerincből a Lys 79 és az Asp 84 karboniloxigénjével, valamint két vízmolekulával alakul ki. További célunk volt a fehérje kalciumion kötőhelyén található nemkötő negatív töltésű oldalláncok valamint a Lys 79 szerepének tisztázása. lyan ciklopeptid modellvegyületeket szintetizáltunk (1. táblázat), amelyekben az aszparaginsav-részek eredeti helyzetükben gyűrűbe vannak zárva, a gyűrű várhatóan ugyanolyan merevséget biztosít a peptideknek, mint a α-laktalbumin harmadlagos szerkezete. Ezen kívül előállítottunk módosított szekvenciákat is, amelyek a nem-kötő aszparaginsavak illetve a lizin szerepének felderítését célozzák meg. Vizsgáltam a peptidek kalciumion kötésével kapcsolatos fizikai-kémiai paramétereit is. Y Y N R 1 R 2 R 2 R 1 (S,S)-1a: R 1 =H, R 2 =ibu, Y=H (S,S)-1b: R 1 =H, R 2 =ibu, Y=CH 2 CH=CH 2 (R,R)-1c: R 1 =tbu, R 2 =H, Y=H N H R 1 R 2 R 2 R 1 (S,S)-2a: R 1 =H, R 2 =ibu, Y= (R,R)-2b: R 1 =tbu, R 2 =H, Y= (S,S)-2c: R 1 =H, R 2 =Me, Y=S CH 2 CNH(CH 2 ) 3 Si szilikagél (HPLC) Me N Me NH 3 Cl 4 (R/S)-1-NEA (S,S)-KÁF-3 1. ábra A vizsgált piridino-, piridono-, és tiopiridono koronaéter származékok, az 1-(1- naftil)etilamin hidrogén perklorát só és a királis állófázis szerkezete

4 1. táblázat Szintetizált peptidek Szám Szerkezet Szám Szerkezet 4 Ac GKFLDDDLTDDG H 6d Ac (CKFLDDDLTDDC)G NH 2 5a KFLDDDLTDDCG CCH 2 H 6e Ac (CKFLDAALTDDC)G NH 2 5b Ac (CFLDDDLTDDK)G NH 2 CH 2 C 6f Ac (CKFLADDLTAAC)G NH 2 6a Ac (CLDDDLTDDC)G NH 2 6g Ac (CKFLAAALTAAC)G NH 2 6b Ac (CFLADDLTAAC)G NH 2 6h Ac (CFLDDDLTDDC)G H 6c Ac (CFLDDDLTDDC)G NH 2 6i Ac (CSFLDDDLTDDC)G H 7 GLDDDLTDDKβA NH 2 CCH 2 CH 2 C Alkalmazott módszerek A lineáris peptideket manuálisan- illetve peptidszintetizátorral végzett szilárdfázisú peptidszintézissel, a ciklizált termékeket folyadékfázisban állítottuk elő. A termékek tisztítását Knauer-64 típusú HPLC készülékkel végeztük, a tisztaságvizsgálatra Jasco-2000 típusú HPLC készüléket használtunk. A peptideket MS-sel és aminosav analízissel jellemeztük. A koronaéterek és a peptidek, valamint komplexeik ECD-spektrumainak felvételéhez Jasco- J810 dikrográfot alkalmaztunk. Az (S,S)-KÁF-3 királis koronaéter szelektort tartalmazó HPLC-oszlopot egy Haskel MCP71 (Burbank, USA) típusú pumpával készítettük el. Az oszlopteszteléseket és vizsgálatokat Shimadzu típusú HPLC rendszerben végeztük. A ciklopeptid modellek FT-IR spektrumát Bruker Equinox 55 készüléken vettük fel. A kalorimetriás méréseket VP-ITC (Microcal Inc., Northampton, MA, USA) készüléken végeztük.

5 Új tudományos eredmények Koronaéterek vizsgálata: 1.) Hat különböző királis koronaéter-származékot vizsgáltam: piridino-, piridono- és tiopiridono-gyűrűt tartalmazó 18-korona-6 típusú vegyületeket. Kimutattam, hogy a kiralitáscentrumon található szubsztituensek térigényüknek megfelelően befolyásolják a vegyületek ECD-spektrumának intenzitását, és hatással vannak a komplex stabilitására. 2.) Összeg- és különbségspektrumok segítségével igazoltam, hogy az izobutilcsoporttal rendelkező koronaéterek [(S,S)-1a, (S,S)-1b, (S,S)-2a] heterokirális felismerést mutatnak. Az ECD-mérések alapján terc-butil-csoportot tartalmazó piridono-gyűrűs valamint a metil-szubsztituált tiopiridono-gyűrűs koronaéter esetében a homokirális komplex a kedvezményezett. 3.) Vizsgálatainkból kiderült, hogy a piridingyűrűn γ-helyzetben lévő alliloxi-csoport [(S,S)-1b] hatására az enantioszelektivitás megnő és az (S,S)-1b heterokirális komplexének ECD-spektrumában exciton felhasadást tapasztaltunk. Ez a piridinkromofor 1 L a sávjának megnövekedett elektromos átmeneti momentumának köszönhető. 4.) Elkészítettem és teszteltem a dimetil-szubsztituált piridingyűrűt tartalmazó 18- korona-6 típusú koronaéterből [(S,S)-KÁF-3] készült királis állófázis HPLC oszlopot. Sikeresen elválasztottam az 1-NEA, 2-NEA sók enantiomerjeit illetve aromás aminosavakat (Trp, Tyr, Phe) és aromás oldalláncvédő-csoportot tartalmazó aminosavszármazékokat. Mivel a (S,S)-KÁF-3 oszloptöltet szelektorkonfigurációja S,S, ezért a kisebb stabilitású homokirális komplexnek megfelelő (S)-enantiomernek volt kisebb a retenciós ideje, ezért az S-enantiomer eluálódik először az oszlopról. Ciklopeptidek vizsgálata: 5.) Az α-laktalbuminban található Ca 2+ -kötő hely röntgenkrisztallográfiás szerkezetének ismeretében megterveztem a vizsgálandó aszparaginsavban gazdag peptidek szekvenciáját. Egy lineáris (4) és tizenkét darab ciklopeptidet (5-7)

6 szintetizáltunk. A ciklizáláshoz három különböző módszert (tioéter-, laktám- és diszulfid-híd) használtunk sikeresen. 6.) ECD-spektroszkópiai mérések szerint a ciklopeptid modelljeink vizes közegben rendezetlen szerkezetet vesznek fel (U-típusú ECD spektrum), TFE-ban viszont nagyobb rendezettségű szerkezetre utaló (C-típusú) görbelefutást mutatnak. Feltételeztük, hogy TFE-ban különböző kanyar-szerkezetek vannak jelen, amelyet az FT-IR-mérések eredményei is alátámasztottak. 7.) Kimutattuk, hogy a diszulfid-hidas modellpeptidek esetében vizes közegben kalciumion hatására az ECD-spektrumok nem változnak, míg TFE-os közegben a λ= nm-nél található sáv intenzitásában jelentős változás tapasztalható. A kiroptikai vizsgálatok szerint a Ca 2+ -hatására bekövetkező változások nagymértékben függnek a szekvenciában lévő aszparaginsavak számától, illetve a peptidek gyűrűméretétől. Az r Ca 2 arány felett a ππ* tartományban a negatív sávpárt felváltja egyetlen negatív sáv, amely a kanyar-szerkezetek felbomlását jelzi. Ezzel egy időben a nm tartományban lévő sáv eltűnése szintén a Ca 2+ peptidgerinccel való kölcsönhatására utal. 8.) Két modellpeptid esetében (6e, 6f) FT-IR-mérésekre támaszkodva megállapítottuk, hogy a kalciumion kötődése egyensúlyi folyamat. A 6e modellpeptid esetében amely csak a fehérje röntgenkrisztallográfiai szerkezete szerinti kötő aszparaginsavakat tartalmazza egyfogú β-c - - Ca 2+ kötésre jellemző sávokat azonosítottunk, amely megegyezik a α-laktalbuminokban tapasztaltakkal. Az öt aszparaginsavat tartalmazó modellek esetében az FT-IR-mérések körülményei között TFE-ban, már kis Ca 2+ -koncentráció (0,5 ekv.) jelenlétében csapadékkiválást tapasztaltunk, amely az aggregációra való hajlamot mutatja. 9.) A kalorimetriás (ITC) eredmények igazolták, hogy a modelljeink és a kalciumion kölcsönhatása termodinamikailag bonyolult, több komplexképződési lépésen keresztül lejátszódó folyamat. A legkisebb gyűrűs (6a) modellpeptid esetében sikerült azonosítanunk a hagyományos görbeillesztési technikával számolt kötődési állandók segítségével az oldatban jelenlévő peptid-ca 2+ komplexeket, és vizsgáltuk előfordulásuk hőmérsékletfüggését. Méréseinkkel alátámasztottuk, hogy az öt aszparaginsavat tartalmazó peptideknél akkor mutatható ki a karboxilcsoportok és a kalciumion közötti ionos kölcsönhatásra jellemző entalpiaváltozás, ha az oldószer hidrofób jellege növekszik.

7 10.) ECD- és ITC-mérések összehasonlításával megpróbáltunk párhuzamot vonni a kalciumion-titrálás által okozott konformációs- és termodinamikai változások között. Kétféle folyamatot különböztettünk meg: a konformációváltozás miatt bekövetkező másodlagos kötések felszakadását, illetve a peptid-ca 2+ kölcsönhatásra jellemző ionos- és dipol-dipol kötések létrejöttét. Konklúzió Az ECD-spektroszkópia hatékony módszernek bizonyult a királis koronaéterek enantiomer-felismerési tulajdonságainak vizsgálatában. Az NMR-méréseket kiegészítve új szerkezeti információkhoz juthatunk a komplexek térszerkezetéről, valamint hatékony tervezési és vizsgálati eszköz a királis állófázisok (KÁF) fejlesztésében. Az általunk elkészített királis állófázist tartalmazó HPLC-oszlopon az elválasztandó vegyületek körét bővítve további adatokhoz jutottunk a királis koronaéterek komplexképzési tulajdonságairól. A ciklopeptid modellek, és a kalciumion között létrejövő kölcsönhatások optikai spektroszkópiai vizsgálata segítséget nyújthat abban, hogy új nézőpontból ismerjük meg az aszparaginsavak oldalláncainak koordinációs tulajdonságait. Ezek a kutatások segítenek felismerni a peptidek fémionkötésre jellemző fizikai-kémiai paramétereit, illetve a fehérjékben található negatív töltésű klaszterek szerepét és sajátságait. Az értekezés alapjául szolgáló közlemények: 1. Farkas Viktor, Szalay Luca, Vass Elemér, Hollósi Miklós, Horváth György, Huszthy Péter: Probing the discriminating power of chiral crown hosts by CD spectroscopy Chirality (2003) 15(S1): Farkas Viktor, Vass Elemér, Ignace Hanssens, Majer Zsuzsa, Hollósi Miklós: Cyclic peptide models of the Ca 2+ -binding loop of α-lactalbumin Bioorganic and Medicinal Chemistry (2005) 13(17): Farkas Viktor, Tóth Tünde, rosz György, Huszthy Péter, Hollósi Miklós: Enantioseparation of protonated primary aralkylamines and amino acids containing an aromatic moiety on a pyridino-crown ether based new chiral stationary phase Tetrahedron: Asymmetry (2006) 17(12):

8 4. Farkas Viktor, Ignace Hanssens, Majer Zsuzsa: Spectroscopic and thermodynamic studies on cyclic peptides calcium interaction (2007) előkészületben * Konferencia kiadványok, konferencia összefoglalások: Majer Zs., Farkas V., Kőhalmy K., Vass E., Mák M., A. Vanhooren, I. Hanssens: Model cyclic peptides for studying the influence of ion cluster in the protein folding and stability 27 th European Peptide Symposium, Sorrento, Italy 2002 A poszter anyaga bekerült a konferencia összefoglaló könyvbe: PEPTIDES E. Benedetti and C. Pedone (Eds.) Edizioni Ziino, Napoli, Italy 2002 p Farkas, V., Szalay, L., Hollósi, M., Huszthy, P.: CD spectroscopic probing the discriminating power of chiral crown ethers containing heterocyclic subunits 14 th International Symposium on Chirality 2002 (ISCD-14), Hamburg, Germany Farkas V., I. Hanssens, Mák M., Majer Zs.: Ion klaszterek tanulmányozása fehérjékben ciklopeptid modellekkel Vegyészkonferencia 2003, Hajdúszoboszló, 73. oldal Farkas V., I. Hanssens, Vass E., Mák M., Majer Zs.: Design of metal ion binding ligands. Dream and reality 9 th International Conference on Circular Dichroism in Chemistry and Life Sciences, Budapest, Hungary 2003, p.68 Tóth T., Huszthy P., Farkas V., rosz Gy., Hollósi M.: Preparation of New Enantiopure Chiral Pyridino-18-Crown-6 Ether-Based Stationary Phase for Enantioseparation of Racemic Protonated Primary Amines XXIX International Symposium on Macrocyclic Chemistry / RACIC Chemistry Conference, Cairns, Queensland, Australia 2004 Farkas V., I. Hanssens,. Vass E, Majer Zs.: Spectroscopic studies on the metal ion binding loop of alpha-lactalbumin 3 rd International and 28 th European Peptide Symposium, Prague, Czech Republic 2004, p.271 A poszter anyaga bekerült a konferencia összefoglaló könyvbe: PEPTIDES M. Flegel, M. Fridkin, C. Gilon and J. Slaninova (Eds.) Kenes International, Geneva, Switzerland 2005 p Farkas V., rosz Gy., Fetter J., Bertha F. Tóth T., Hollósi M., Huszthy P.: Új királis koronaéterekkel módosított szilikagél alapú állófázis alkalmazása enantiomerek HPLC elválasztásában Vegyészkonferencia 2005, Hajdúszoboszló, 71. oldal Tóth T., Fetter J., Bertha F., Farkas V., rosz Gy., Hollósi M., Huszthy P.: Preparation of an enantiopure dimethylacridino-18-crown-6 ether based CSP and its use for enantiomeric separation of racemic primary ammonium salts XXX International Symposium on Macrocyclic Chemistry (ISMC), July 17 21, 2005, Dresden/Germany * Az előkészületben levő közlemény anyagának nagy részét a doktori értekezés tárgyalja.

9 Farkas V., Tóth T., Huszthy P., Hollósi M., rosz Gy.: Application of a new enantiopure chiral crown ether based chiral stationary phase in enantioseparation of racemic primary organic ammonium salts 17 th International Symposium on Chirality 2005 (ISCD-17), Parma, Italy, p.206 Hollósi M., Farkas V., Tóth T., Huszthy P., Laczkó I.: Enantioseparation of aromatic amino acids and aralkylammonium salts by HPLC using a chiral crown ether-based sorbent 17 th International Symposium on Chirality 2005 (ISCD-17), Parma, Italy, p.218 Farkas V., I. Hanssens, Majer Zs.: Thermodynamic studies on the calcium binding of aspartic acid rich cyclopeptides 29 th European Peptide Symposium, Gdansk, Poland 2006 Az értekezés témaköréhez tartozó közlemények: 5. Szalay Luca, Farkas Viktor, Vass Elemér, Hollósi Miklós, Móczár Ildikó, Pintér Áron, Huszthy Péter: Synthesis and selective lead(ii) binding of achiral and enantiomerically pure chiral acridono-18-crown-6 ether type ligands Tetrahedron: Asymmetry (2004) 15(9): Ann Vanhooren, Allel Chedad, Farkas Viktor, Majer Zsuzsa, Marcel Joniau, Herman Van Dael, Ignace Hanssens: Tryptophan to phenylalanine substitutions allow differentiation of short- and long-range conformational changes during denaturation of goat α-lactalbumin Proteins: Structure, Function and Bioinformatics (2005) 60(1): Lakatos Szilvia, Fetter József, Bertha Ferenc, Huszthy Péter, Tóth Tünde, Farkas Viktor, rosz György, Hollósi Miklós: Preparation of a new chiral acridino-18- crown-6 ether-based stationary phase for enantioseparation of racemic protonated primary aralkyl amines (2007) előkészületben Egyéb közlemények 8. Mahmoud Al-Khrasani, rosz György, Kocsis László, Farkas Viktor, Magyar Anna, Lengyel Imre, Benyhe Sándor, Borsodi A., Rónai Z. András.: Receptor constants for endomorphin-1 and endomorphin-1- ol indicate differences in efficacy and receptor occupancy European Journal of Pharmacology (2001) 421(1): Jan Balzarini, Joeri Auxerx, Fatima Rodriguez-Barrios, Allel Chedad, Farkas Viktor, Francesca Ceccherini-Silberstein, Carlos Garcia-Aparicio, Sonsoles Velazquez, Erik De Clercq, Carlo-Federico Perno, Maria-Jose Camarasa, Federico Gago: The amino

10 acid N136 in HIV-1 reverse transcriptase (RT) maintains efficient association of both RT subunits and enables the rational design of novel RT inhibitors Molecular Pharmacology (2005) 68(1): Szabó Dénes, Nemes Anikó, Kövesdi István, Farkas Viktor, Hollósi Miklós, Rábai József: Synthesis and characterization of fluorous (S)- and (R)-1-phenylethyl amines that effect heat facilitated resolution of (±)-2-(8-carboxy-1-naphtylsulfonyl)benzoic acid via diastereomeric salt formation and study of their circular dichroism Journal of Fluorine Chemistry (2006) 127(10): Mező Gábor, Czajlik Andás, Marilena Manea, Jakab Annamária, Farkas Viktor, Majer Zsuzsa, Vass Elemér, Bodor Andrea, Kapuvári Bence, Boldizsár Marian, Vincze Borbála, Csuka rsolya, Kovács Magdolna, Michael Przybylski, Perczel András, Hudecz Ferenc: Structure, enzymatic stability and antitumor activity of sea lamprey GnRH-III and its dimer derivatives Peptides (2007) nyomdában