A citoplazmában előforduló glikoprotein pentaszacharid szénhidrátrészének szintézise doktori (PhD) értekezés tézisei

Átírás

1 citoplazmában előforduló glikoprotein pentaszacharid szénhidrátrészének szintézise doktori (Ph) értekezés tézisei Szabó Zoltán (Témavezető: r. Lipták ndrás) Synthesis of the pentasaccharide-segment of a glycoprotein found in the cytoplasma theses of doctoral (Ph) dissertation Zoltán Szabó (Supervisor: r. ndrás Lipták) ebreceni gyetem Természettudományi oktori Tanács Kémia oktori Iskola ebrecen, 2007.

2 citoplazmában előforduló glikoprotein pentaszacharid szénhidrátrészének szintézise doktori (Ph) értekezés tézisei Szabó Zoltán (Témavezető: r. Lipták ndrás) Synthesis of the pentasaccharide-segment of a glycoprotein found in the cytoplasma theses of doctoral (Ph) dissertation Zoltán Szabó (Supervisor: r. ndrás Lipták) ebreceni gyetem Természettudományi oktori Tanács Kémia oktori Iskola ebrecen, 2007.

3 1. z értekezés előzményei és célkitűzései szénhidrátok az élő szervezetekben nemcsak energiaforrásként vagy vázanyagként játszanak fontos szerepet, hanem a biológiai információk hordozóiként (glikokonjugátumok) is nagy jelentőségűek. zen felismerésre a tisztítás és a szerkezetmeghatározás során alkalmazott technikák, illetve műszerek (HPL, MS, G-MS, NMR) terén történt nagymértékű fejlődés után nyílt lehetőség. z oligoglikozil rész a glikokonjugátumokban sokféle szerepet tölthet be: a glikoproteinekben védi a fehérjét a proteázok támadásával szemben, másodlagos kölcsönhatásokkal rögzíti a fehérjét egy bizonyos konformációban, valamint alkalmassá teszi a glikoproteint egy adott szervezet citoplazmájában vagy sejtmagjában a betöltendő szerep ellátására. plazmamembrán felületén lévő oligoszacharid szekvenciák receptorként működnek. glikokonjugátumok vizsgálataiból sikerült olyan összefüggésekre fényt deríteni, amelyekkel mélyebben megérthetjük a glikokonjugátumok szénhidrát részének szerepét, a sejtek és a környezetük közötti kapcsolattartást és a sejt-sejt kölcsönhatást. z oligoszacharidok biológiai jelentőségének felismerése újabb kihívást jelent a kémikusok számára. magasabb tagszámú, elágazó láncú oligoszacharidok szintézisének igénye megkövetelte újfajta blokkszintézisek, védőcsoport stratégiák és új, sztereospecifikus glikozilezési módszerek kidolgozását, ezzel együtt a vegyületek izolálásában, szerkezetük meghatározásában használt technikák további fejlődését. -MT Szénhidrátkémiai Tanszéki Kutatócsoportjában régóta folynak a természetben fellelhető glikokonjugátumok cukor részeinek szintézisére irányuló kutatások. változatosan kapcsolódó oligoszacharidok előállítását nagymértékben elősegítette, hogy Lipták és munkatársai egy új, acetál/éter típusú védőcsoport stratégiát dolgoztak ki. Felismerték, hogy a szénhidrátok benzilidén acetáljai, a cukorgyűrűn való elhelyezkedésüktől függően, regio- és sztereoszelektíven, reduktív úton felnyithatók, és így szabad hidroxilcsoporttal rendelkező, benzil-éter származékok keletkeznek. hidroxil-csoportot szinte tetszőleges helyzetben felszabadítva oligoszacharid építőelemek szintézisére nyílt lehetőség ben, egyetemi hallgatóként kapcsolódtam be a Kutatócsoportban folyó cukorvédőcsoportok vizsgálatába, és témavezetőmtől, r. Lipták ndrás akadémikus Úrtól a (2- naftil)metilén acetál és (2-naftil)metil éter védőcsoportok vizsgálatát kaptam feladatomul. zek a csoportok, a benzilidén acetál / benzil éter stratégia analógiájára, alkalmazhatóak szénhidrátok szelektív védelmére, de sokkal enyhébb és változatosabb körülmények között manipulálhatóak. 1

4 élul tűztük ki, hogy a (2-naftil)metilén acetál / (2-naftil)metil(NP) éter stratégiát monoszacharid építőelemek szintézisére használjuk fel és az építőelemek segítségével izomer oligoszacharidokat állítunk elő. z értekezés témáját az ebben a kutatásban elért eredmények adják. 2. z alkalmazott vizsgálati módszerek szintetikus munka során a modern preparatív szerves kémia makro-, félmikro- és mikromódszereit alkalmaztam. reakciók követésére, az anyagok tisztaságának ellenőrzésére és a termékarányok meghatározására vékonyréteg kromatográfiás módszert használtam, a nyerstermékek tisztítását és az izomerek szétválasztását kristályosítással, valamint oszlopkromatográfiával hajtottam végre. z előállított vegyületek jellemzésére, azonosítására és szerkezetének igazolására elemanalízist, olvadáspont- és fajlagos forgatóképesség meghatározást, egy- és kétdimenziós ( 1 H- 1 H-SY, TSY, 13-1 H-HSQ) NMR spektroszkópiát és MLI/SI-TF tömegspektrometriai módszert használtunk. 3. z értekezés új tudományos eredményei 3.1 pentaszacharid építőelemek előállítása ictyostelium discoideumban található Skp1 fehérje 143. aminosavja egy pentaszachariddal glikozilezett. pentaszacharid vizsgálata során West és munkatársai nem tudták egyértelműen eldönteni, hogy a redukáló végi triszacharid [Fucα(1 2)Galpβ(1 3)GlcNc(1 )HyPro; ++] fukóz egységének melyik pozíciójához kapcsolódik a Galpα(1 6)Galpα(1?) szerkezetű diszacharid (+). probléma megoldásául három izomer - a fukóz egységen eltérő kapcsolódású pentaszacharid szintézisét terveztük megvalósítani, (2-trimetilszilil)-etil-glikozidok formájában. pentaszacharid + és + részlete a megfelelő monoszacharidokból építhető fel. -egységek előállítása viszont körültekintőbb tervezést igényelt. Három olyan izomer származékra volt szükség, amelyeknek egy-egy hidroxil csoportja szelektíven felszabadítható a fukozilezési lépést követően. nnek megoldását terveztük a (2-naftil)metil védőcsoporttal, mert a benzilek mellől szelektíven eltávolítható. + diszacharid fragmenst 61 * -es és 62-es, irodalomból ismert vegyület összekapcsolásával állítottam elő 72 %-os hozammal. képződött 63-as diszacharidról a 2 - * vegyületek számozása azonos az értekezésben használttal. 2

5 helyzetű acetil-csoport Zemplén-módszer szerinti lehasításával nyertem a kívánt 64-es akceptort (1. ábra). n n n c r Ph gtf, s-kollidin + n nph H S NPhth KM, toluol S n NPhth c , 1 éjszaka % S = H 2 H 2 Si(H 3 ) 3 i) 1 M NaMe MeH/KM, 72 h ii) TF, piridin 30 min. iii) kat. 1 M NaMe MeH/KM, 2.5 h n n n Ph H S NPhth 1. ábra dezacetilezési lépés közben a ftálimid-csoport is reagált, ennek visszazárása megnehezítette 64-es előállítását. védőcsoport manipuláció elkerülése végett megpróbáltam a glikozilezést 61-hez hasonló, 2--klóracetilezett donorokkal, de nem sikerült a kívánt β- kötésű származékot főtermékként kinyernem % (hozam a három lépésre) 2, 3 és 4 fukozid-vegyületeket - amelyek eltérő pozícióban tartalmaztak (2- naftil)metil védőcsoportot - 74-ből, valamint 77-ből állítottam elő. NP csoport bevitelét háromféleképpen hajtottam végre: közvetlen alkilezéssel, (2-naftil)metilén acetálok gyűrűnyitásával és sztannilén acetálon keresztüli alkilezéssel. H 3 74 H NPr, NaH MF, 2 h H 3 2. ábra 76-os vegyület 2-NP csoportját közvetlen alkilezéssel alakítottam ki (2. ábra). 3-NP és 4-NP vegyületek előállítását először a megfelelő sztereokémiájú (2- naftil)metilén acetál gyűrűnyitásával végeztem el (3. ábra). NP % NP i) Hl (aq), MeH 50, 3 h ii) nr, NaH MF, 3 h H 3 n n NP % (hozam a két lépésre) 3

6 H 3 H H H 2-naftaldehid-dimetilacetál pts H 3 N, reflux, 5h H 3 H + H 3 H 77 H H nr, NaH MF, 3h LilH 4 : ll 3 (3 : 1) H 2 l 2 : t 2 (1 : 1) 30 min. H 3 H NP % H 78exo 41 % 79endo 44 % LilH 4 : ll 3 (3 : 1) H 2 l 2 : t 2 (1 : 1) 30 min. H 3 NP nr, NaH MF, 3h H % H H 3 3. ábra 82-es és 83-as származékok szintézisét sztannilén acetálon keresztüli alkilezéssel is végrehajtottam, és - még több szintézislépés kivitelezése mellett is - jobb hozamokat sikerült elérnem (4. ábra). H 3 H H 84 n n NP % n i) u 2 Sn, toluol, sf reflux, 5 h ii) nr, MF, 16 h H 3 H n % n H 3 NP nr, NaH MF, 3h n % H 3 NP n n % n 84 i) u 2 Sn, toluol, sf reflux, 5 h ii) NPr, MF, 16 h H 3 H NP % n nr, NaH MF, 3h H 3 n NP % n 4.ábra z + diszacharid donor előállítását egy 6-os helyzetben szabad galaktóztioglikozid akceptor (88, 5. ábra) és egy tetra--benzil-galaktopiranozil-donor összekapcsolásával sikerült kivitelezni. glikozilezést kétféle, irodalomból ismert, donorral (89 és 91) is megpróbáltam, ám egyik esetben sem sikerült anomertiszta formában az α- glikozidot előállítanom (6. ábra). 4

7 MIP 70 H NPr, NaH MF, 3 h MIP % NP H 3 H (aq), KM 55, 2.5 h H % NP 5. ábra n n NH n l 3 n n n 91 r 68 % 6. ábra 90-es keverékből védőcsoportcsere után sikerült a számomra szükséges α- glikozidot kinyernem kromatográfia segítségével (7. ábra). 3.2 Glikozilezési reakciók 7. ábra redukáló végi triszacharidok szintézise a 64-es akceptor és a megfelelő fukoziddonor (76, 82, 83) összekapcsolásával történt. három izomer vegyület előállítását és védőcsoportjainak átalakítását ugyanolyan körülmények között végeztem, mert a reakciók lefutásában nem észleltem jelentős különbséget. fukozilezést és a (2-naftil)metil-csoport szelektív eltávolítását követően izoláltam 96-os, 97-es és 98-as triszacharid akceptorokat (8. ábra). n n n n n n r 2, KM 0, 10 min. 90 NP n n H NP n n TMSTf, t 2-30, 45 min. 88 % i) Hl(aq), THF, 50, 5 h ii) c 2, piridin, 1 éjszaka iii) kromatográfia n n u 4 Nr, KM/MF, , 24 h n n n n n n c % c 90 NP NP védett pentaszacharidokat a 92-es diszacharid-donor és a megfelelő helyzetben egyetlen H-csoporttal rendelkező triszacharid-akceptor [96 (2 -H), 97 (3 -H), 98 (4 - H)] összekapcsolásával hoztam létre. reakciókat NIS/gTf promotor jelenlétében 5

8 hajtottam végre és elfogadható hozammal nyertem 99-es, 100-as és 101-es vegyületeket (9. ábra). H 3 NIS/TMSTf NP n n KM, -50, 30 min. 76 H 3 NIS/TMSTf n n NP KM, -50, 30 min % % Q KM:H 2 (9:1) 25 min. Q KM:H 2 (9:1) 25 min. n n n Ph H 3 96 H n n n n n Ph S NPhth 75 % H 3 97 n n H S NPhth 73 % H 3 NIS/TMSTf n NP n KM, -50, 30 min % Q KM:H 2 (9:1) 25 min. n n n Ph H 3 98 n H n S NPhth 75 % 8. ábra n n nph S NPhth NIS/gTf KM, -7, 3 h H 3 n n NP c c % n n n n NIS/gTf KM, -7, 3 h 100 ("Galp-1-3-Fucp") 50 % NIS/gTf KM, -7, 3 h 101 ("Galp-1-4-Fucp") 50 % 9. ábra 6

9 3.3 Védőcsoportok eltávolítása a pentaszacharidokról 99-es, 100-as és 101-es vegyületeket hidrazin-hidráttal kezelve, majd ecetsavanhidriddel acetilezve a ftaloil-csoport N-acetillé alakítását hajtottam végre. nyert származékokat Zemplén szerint dezacetilezve izoláltam 102-es, 103-as és 104-es vegyületeket. reduktív úton hasítható védőcsoportokat nyomás alatti katalitikus hidrogénezéssel távolítottam el, és az 58-as, 59-es és 60-as, szabad célpentaszacharidokat kaptam (10. ábra). 99 i) NH 2 NH 2.H 2 th, reflux, 24 h ii) c 2, piridin iii) NaMe MeH/KM % (három lépésre) H 2, Pd/ 26 bar, 1 éjszaka 96 % th : THF (2 : 1) H H 3 H H H H H H H S NHc H H % H H H H 100 i) NH 2 NH 2.H 2 th, reflux, 5 h ii) c 2, piridin iii) NaMe MeH/KM % (három lépésre) H 2, Pd/ 26 bar, 1 éjszaka 96 % th : THF (2 : 1) H H H H H 3 H H H H H H % S NHc H H H H H H H H H S NHc i) NH 2 NH 2.H 2 th, reflux, 5 h ii) c 2, piridin iii) NaMe MeH/KM % (három lépésre) H 2, Pd/ 26 bar, 1 éjszaka 96 % th : THF (2 : 1) H H H 3 H H H % 101 H H H H 10. ábra 7

10 4. Összefoglalás Munkám során sikerrel előállítottam a célkitűzésben megfogalmazott izomer pentaszacharidokat szabad formában, ~ mg-os mennyiségekben. szintetizált vegyületek az irodalom számára még nem ismertek. feladat végrehajtásához ismert glikozilezési módszereket és a Kutatócsoportunkban először alkalmazott (2-naftil)metilén acetál / (2-naftil)metil éter védőcsoport stratégiát alkalmaztam. (2-naftil)metil védőcsoport kialakítható volt a fukóz monoszacharid egység bármely pozíciójában és könnyedén el lehetett távolítani benzil-éterek jelenlétében. NP-védőcsoport több donor molekulánál is -2 pozícióban szerepelt, és a vártnak megfelelően nem résztvevő csoportként működött. z általam szintetizált vegyületek, remélhetőleg, képesek lesznek alátámasztani, vagy megcáfolni a természetből izolált vegyület szerkezetére tett javaslatot. 8

11 5. Publikációk jegyzéke 5.1 Közlemények jegyzéke 1.). orbás, Z.. Szabó, L. Szilágyi,. ényei,. Lipták: ioxane-type (2-naphthyl)- methylene acetals of glycosides and their hydrogenolytic transformation into 6-- and 4--(2-naphthyl)methyl (NP) ethers, Tetrahedron 2002, 58, ). orbás, Z.. Szabó, L. Szilágyi,. ényei,. Lipták: Stereoselective (2-naphthyl)- methylation of sugars by hydrogenolysis of diastereomeric dioxolane-type (2- naphthyl)methylene acetals, arbohydr. Res., 2002, 337, ) T. Kurtán,. orbás, Z.. Szabó,. Lipták,. ényei, S. ntus: ircular ichroism of 1,3-ioxane-Type (2 -Naphthyl)Methylene cetals of Glycosides, hirality 2004, 16, ) Magdolna sávás, Zoltán. Szabó, nikó orbás, ndrás Lipták; 2-Naphthylmethyl bromide: lectronic ncyclopaedia of Reagents for rganic Synthesis, (2004). 5.) nikó orbás, Magdolna sávás, Zoltán. Szabó, ndrás Lipták; 2- (imethoxymethyl)naphthalene: lectronic ncyclopaedia of Reagents for rganic Synthesis, (2004). 6.) Zoltán. Szabó, nikó orbás, István ajza, ndrás Lipták: Synthesis of fully protected α-l-fucopyranosyl-(1 2)-β--galactopyranosides with a single free hydroxy group at position 2, 3 or 4 using -(2-naphthyl)methyl (NP) ether as a temporary protecting group, Tetrahedron: symmetry 2005, 16, lőadások és poszterek 1.). Lipták,. orbás, Z.. Szabó, L. Jánossy, L. Szilágyi: Preparation of (2- naphthyl)methylene acetals of glycosides and their hydrogenolytic transformation into 2- naphthylmethyl(np) ethers, 20 th International arbohydrate Symposium, Hamburg, Germany, 27 ugust 01 September, poszter (p. 170, bstract book ) 9

12 2.) Szabó Zoltán: Glikozidok (2-naftil)metilén acetáljainak szintézise és hidrogenolitikus átalakításuk (2-naftil)metil éterekké, XXV. TK Kémiai és Vegyipari Szekció, Szerves Kémia "" tagozat, Gödöllő, április előadás 3.) Szabó. Z., Lipták., orbás., Szilágyi L., ényei.: Glikozidok (2-naftil)metilénacetáljainak szintézise és hidrogenolitikus átalakításuk (2-naftil)metil(NP) éterekké, MK Vegyészkonferencia, Hajdúszoboszló, június P-99 poszter (konferencia kiadvány 133. old) 4.). Lipták,. orbás, Z.. Szabó, L. Szilágyi: Preparation of (2-naphthyl)methylene acetals of glycosides and their selective hydrogenolysis into (2-naphthyl)methyl ethers, 11 th uropean arbohydrate Symposium, Lisboa, Portugal, 2-7 September, P035 poszter (p. 163, bstract book) 5.) Z.. Szabó,. Lipták, L. Jánossy: L-Fucoside building blocks suitable for oligosaccharide synthesis, 12 th uropean arbohydrate Symposium, Grenoble, France, 6-11 July, P-025 poszter 6.) Z.. Szabó,. Lipták, L. Jánossy: L-Fucoside building blocks suitable for oligosaccharide synthesis, First ustrian-hungarian arbohydrate onference, urg- Schlaining, ustria, September előadás 7.) Szabó. Zoltán, Lipták ndrás, Jánossy Lóránt: α-l-fukopiranozil kötések kialakítására alkalmas védett tioglikozidok szintézise, XXVI. Kémiai lőadói Napok, Szeged, október előadás (konferencia kiadvány 23. old.) 8.) Zoltán. Szabó, nikó orbás, ndrás Lipták: L-Fucose uilding locks Suitable For ligosaccharide Synthesis, First German-Hungarian Workshop, Hannover, Germany, 5-6 July előadás 9.) Zoltán. Szabó, Mihály Herczeg, Magda sávás, nikó orbás, Gyula atta, ndrás Lipták: Synthetic Studies on the Pentasaccharide Side-hain of the Skp1 Glycoprotein Found in ictyostelium discoideum, Second German-Hungarian Workshop, ebrecen,hungary, 4-9 pril előadás 10