A CD14 biológiai marker alkalmazása a belélegzett endotoxin jelzésére

Átírás

1 FOGLALKOZÁS-EGÉSZSÉGÜGY A CD14 biológiai marker alkalmazása a belélegzett endotoxin jelzésére Tárgyszavak: szálló por; Gram-negatív baktérium; endotoxin; expozíció; foglalkozási ártalom; biológiai marker. A szájüreg belsejét borító nyálkahártya felszínén, az emberek és állatok bélrendszerében, a talaj mikroflórájában számos Gram negatív baktérium élősködik. Ezek a Gram-negatív baktériumok, illetve néhány kékalga sejtfalának külső rétege endotoxint termel, amelynek jelenléte egyes foglalkozási környezetekben rendkívül gyakori; megtalálható például a levegőben szálló gabonaporban, gyapotporban, sertéstelepek, baromfiólak környezetében lévő állati ürülékben, szennyvízben és szennyvíziszapban vagy vizes olajemulziókban (fémmegmunkáló folyadékokban). A légkondicionáló berendezések, a háztartási por szintén tartalmazhat endotoxint. A levegőben terjedő endotoxin belélegzése foglalkozási ártalomnak tekintendő; mennyisége a különböző foglalkozási környezetekben széles körben változik, néhány jellemző példa az 1. táblázatban látható. Az endotoxin belélegzése rövid és hosszú távú légzőszervi megbetegedéseket okoz. A rövid távú hatások fehérvérsejt szaporulattal (leukocitózis) járó lázas állapotot és influenzaszerű tüneteket okozhatnak, amelyek a szervezetbe történő behatolás (hatás kezdete) után 6 12 óra elteltével lépnek fel, és a kezdeti intenzív hatás után kb. 4 órán keresztül tartanak. A reagálás küszöbértéke, mértéke, a tünetek egyénenként változnak. Egészséges emberben µg endotoxin belélegzése esetén léphetnek fel klinikai tünetek (láz, fejfájás, mellkasi szorító érzés, szaggatott légzés, izom- és csontfájdalom, hányinger). A folyamathoz előzetes érzékenyítés nem szükséges, antitestek nem fejlődnek ki. Az endotoxin hatására kialakuló FEV 1 típusú válasz az endotoxin belélegzése után 30 perccel már erőteljesen érezhető, és 5 órán át vagy még tovább tart. A FEV 1 endotoxinválasz atópiás egyénekben sokkal kifejezettebb, és határozott összefüggésben áll a légúti fogékonyság mértékével; kialakulása egészséges egyénekben 80 µg feletti, asztmatikus betegekben már 20 µg feletti endotoxin belélegzése esetén tapasztalható.

2 A levegőben terjedő endotoxin mennyisége különböző foglalkozási környezetekben 1. táblázat Ipari ágazat/tevékenység Mezőgazdaság Gabona kezelése Állati takarmány Sertéstelep Baromfitelep Zöldségtermesztés, feldolgozás Ipar Gyapotfeldolgozás Biotechnológia Gépi megmunkálás (fémmegmunkáló folyadékok) Üveggyapot (üvegrost) mosóvíz Hulladékfeldolgozás Szennyvízfeldolgozás Szemétkezelés Komposztálás Hivatalok Irodák Levegőben terjedő endotoxin koncentrációja (ng/m 3 ) , , ,07 162,85 0, , , , , , Az LPS (lipopoliszacharid) által indukált gyulladás mértéke a teljes vér neutrofil szegmenseinek számlálásával határozható meg. LPS akut inhalációjának küszöbértéke kisebb, mint 0,5 µg. Az egyéni endotoxinválaszok ebben az esetben is széles intervallumban változnak, az asztmatikus betegek intenzívebben reagálnak. Egyes epidemiológiai tanulmányok alapján a krónikus endotoxinhatás dózisfüggő gyulladást okozhat, amely krónikus hörghuruthoz, gyapotporbelégzés okozta tüdőmegbetegedéshez (gyapot pneumoconiosis vagy más néven byssinosis) és csökkent tüdőfunkcióhoz vezet. Az endotoxin közvetett módon is kifejtheti biológiai hatását, amelynek során például a sejteket mediátorok termelésére és felszabadítására serkenti. Az endotoxinra reagáló számos sejt közül a legmeghatározóbb szerepűek a monociták/makrofágok, endoteliális sejtek, simaizomsejtek és neutrofil részek. A tüdőben az alveoláris makrofág reagál elsőként az endotoxin hatására. A CD14 biológiai marker egy 55 kda-os glikoproteinhez kapcsolódó glikozil foszfatidil inozitol, amely a plazmamembránhoz foszfatidil inozitol kötéssel kötődik. Hatását elsősorban monocitákon/makrofágokon, neutrofilokon, csökkenő mértékben granulocitákon, Langerhans sejteken illetve B sejteken fejti ki. LPS rendkívül nagy affinitással kötődik CD14-hez a lipid A részen keresztül.

3 A CD14-expresszió az emberi alveoláris makrofágokon endotoxinhatást követően növekszik. A mediátorok indukciója az LPS stimulációra adott válaszban anti CD14 antitestekkel gátolható. Az LPS kötő fehérje (LBP) egy 60 kda-os plazma glikoprotein, amely fontos közvetítő szerepet játszik az endotoxin interakcióiban. LPS komplexet képez LBP-vel, ez a komplexképződés elősegíti LPS kötődését CD14-hez és csökkenti a CD14 által közvetített sejtaktiválás számára szükséges LPSkoncentrációt. Megfelelő vérmintából számos mediátor azonosítható és mérhető áramlásos citometriával, és ezáltal biomarkerként alkalmazhatók immuntoxikológiai válaszok esetén. A vérben található egyes sejtpopulációk, citokinek, interleukinek, adhéziós molekulák és más fehérjék szerkezete a légzőszerveket érintő káros hatásokra adott válaszok során módosulnak. Ezideig még csak néhány immunparamétert sikerült megbízható biomarkerként bevezetni és validálni az emberi immuntoxicitás értékelésében. A CD14 biológiai markert abban a reményben vizsgálják, hogy az eddigieknél specifikusabb marker lesz az endotoxinhatásra adott válasz meghatározásában. In vitro vizsgálat Az áramlásos citometriás analízist vénás vérmintából végezték. A vizsgálat során a teljes vért inkubálták Escherichia coli 055 B5-ből származó lipopoliszachariddal (LPS), humán szérum albuminnal (HSA) vagy PBS-sel. Ezekből aliquot részeket vettek, majd megjelölték. A vörösvérsejteket feloldották, a maradék sejteket rögzítették, és ezt követően áramlásos citometriás módszerrel átlagos lineáris fluoreszcenciát (MLF) mértek. A limfociták és monociták azonosítását elvégezték, amely lehetőséget ad a CD45 monocitákon és limfocitákon való összehasonlítására. Az LPS-hatás folyamán a CD14-expresszió a monocitákon 30 perc után növekedett, legmagasabb értékét 1 4 óra között érte el. Habár a monocitapopuláció csökkent (és 24 óra után eltűnt az LPS-sel kezelt mintákban), CD14 mennyisége a maradék monocitákon visszaesett az alapszintre. Ez arra utal, hogy a monociták gyorsan eltávolították az endotoxint vagy internalizálták a receptorokat. CD14 átszabályozását az LPS hatásra adott válaszban a monocitákon erősen szignifikánsnak találták a PBS-sel és HSA-val kezelt sejtekkel való összehasonlítás során (1. ábra). CD45 expressziója az LPS hatására adott válaszban a monocitákon szintén szignifikánsan átszabályozott volt a PBS-sel és HSA-val kezelt sejtekhez képest. A limfocitákon nem tapasztaltak szignifikáns különbséget a CD45 expresszióban a PBS-sel, HSA-val, illetve LPS-sel végrehajtott kezelést követően; ebből következik, hogy CD14-től eltérően CD45 nem endotoxinspecifikus marker.

4 100 CD14 átlagos lineáris fluoreszcencia g LPS g PBS HSA g 1. ábra In vitro CD14-expresszió monocitákon Az LPS/CD14 interakció mechanizmusa mostanáig még ismeretlen. Az itt ismertetett in vitro modell meglehetősen pontosan utánozza az endotoxinhatást követő in vivo eseményeket. A sejttípus tekintetében azonban ez a tanulmány sem oldja meg az endotoxinválasz specificitásának kérdését, mivel a vizsgálatok során az endotoxin csak megváltoztatta a monociták felszíni markereinek expresszióját. A monocitafrakció a PBS-sel és HSA-val kezelt mintában kimutatható maradt, az LPS-hatás közvetlen eredményeképpen viszont eltűnt. E hatás mechanizmusát ezekből a vizsgálatokból nem lehet meghatározni. Lehetséges, hogy az LPS stimulálta a sejt felszíni markereinek expresszióját, ez a sejteket tapadóssá tette, így az LPS-hatásnak kitett monociták a kémcső falához tapadtak. Más nem bizonyítható magyarázat alapján a receptorkötésű LPS gyors internalizációja megsemmisítette a sejteket és fiziológiás sejthalált okozott. A monocitafrakció in vivo eltűnésében részt vevő folyamatok alapos ismeretével megmagyarázható lenne néhány endotoxinhatás következtében fellépő hosszú távú légzőszervi megbetegedés. Az endotoxinhatás kimutatásának in vivo validálása A CD14 biomarkerként való alkalmazásának validálását foglalkozási ártalomként gyapotpor expozíciójának kitett populáció endotoxinválasza alapján végezték. A vizsgálati és kontrollalanyoktól teljes vérmintát gyűjtöttek hétfőn reggel az első műszak előtt; az első műszak hatodik órájában; majd utoljára a negyedik napon, az első műszak végén a 72. órában. A mérésekhez antitestfestést és áramlásos citometriát alkalmaztak. A kontrollcsoport a CD14-expresszió nem szignifikáns növekedését mutatta a 72 órás időperiódus alatt, valójában 6 óra után szignifikáns csökkenést

5 tapasztaltak (2. ábra). A gyapotpor-expozíciónak kitett munkásokban a CD14- expresszió 6 óra után szignifikánsan növekedett. Mindkét csoportban a 72. óra elteltével a CD14-expresszió a kiindulási szint alá esett, a kontrollcsoportban még a szignifikancia is megfigyelhető volt. CD14 átlagos lineáris fluoreszcencia kontroll személyek gyapotmunkások órák 2. ábra CD14-expresszió monocitákon gyapotmunkásokban A gyapotmunkásokban előforduló akut és krónikus légzőszervi tüneteket általános elnevezésként byssinosisnak (gyapotporbelégzés okozta tüdőártalom) nevezik. A megbetegedés klasszikus eseteiben a tünetek a gyapotpor hatása után körülbelül 4 órával lépnek fel, a munkások közérzete hétfőn reggel, a hétvégi pihenés után a legrosszabb. A tünetek mellkasi szorító érzés, köhögés, ziháló, sípoló jellegű légzés formájában jelennek meg. A gyapotpor ismételt, hosszan tartó belélegzésével a tünetek és funkcionális változások súlyosabbá válnak, krónikus obstruktív tüdőbetegség fejlődhet ki. A gyapotmunkásokban mért akut és krónikus tüdőfunkció változás összefüggésben áll az endotoxin káros hatásával. A CD14-expresszió változásai arra utalnak, hogy az endotoxin interakciója CD14 biomarkerrel fontos része lehet a byssinosisért felelős mechanizmusoknak. A CD14-expresszió növekedése endotoxinhatás alatt gyulladást okozó mediátorok termeléséhez vezethet, amely a gyulladásos tünetek növekedését és néhány esetben krónikus légzőszervi betegséget eredményez. A vizsgálati eredmények alapján a CD14 biológiai markerként való alkalmazása további vizsgálatot igényel. A módszer in vivo validálását a gabona, gyapot, kender és gyapjú feldolgozásából, illetve a baromfifélék tenyésztéséből származó por endotoxinhatása alatt álló munkások populációjában kell folytatni. A legfrissebb adatok alapján szignifikáns öszefüggés figyelhető meg

6 a CD14-expresszió és a vizsgált köpet neutrofil válasza között LPS inhalációja után 6 órával. Endotoxin a háziporban (0 62 ng/mg mennyiségben) is kimutatható. Lehetséges, hogy egyes asztmaszerű tüneteket produkáló betegek valójában endotoxinexpozíció okozta légzőszervi problémától szenvednek, és az asztma súlyossága öszefüggésben áll az endotoxin mennyiségével. Ez ideig még csak néhány immunparamétert validáltak elfogadható biomarkerként az emberi immuntoxicitás értékelésében. A megbízhatóan működő immunológiai biomarkerek a káros hatásokra gyakran már nagyon korán választ adnak. Ezek detektálásának segítségével megelőzhető lenne a betegség kifejlődése, nem kellene megvárni a tünetek megjelenését ahhoz, hogy az érintett munkást mentesítsék az endotoxin káros hatása alól. A vizsgálatokból levonható következtetések A CD14-expresszió az endotoxinexpozíciót követő hat óra elteltével specifikusan és szignifikánsan átszabályozódik a monociták felszínén, és a megfelelő vérmintából könnyen meghatározható áramlásos citometriával. Az átszabályozás azonban csak az első 72 órában észlelhető. A vizsgálati eredmények alapján a CD14-expresszió monocitákon való áramlásos citometriás analízise az endotoxinexpozícióra adott válasz in vivo biomarkereként szolgálhat olyan munkások esetében, akik endotoxinnal szennyezett aeroszolok belélegzése következtében légzőszerveket érintő, gyenge egészségi állapotban vannak. (Molnár Kinga) Swan, J.R.M.; Beckett, P. stb.: A review of the use of CD14: a biomarker for workplace airborne endotoxin exposure? = International Biodeterioration & Biodegradation, 50. k. 2. sz szept. p Rylander, R.: Health effects among workers in sewage treatment plants. = Occupational and Environmental Medicine, 56. k. 4. sz p Laitinen, S.; Linnainmaa, M. stb.: Endotoxins and IgG antibodies as indicators of occupational exposure to the microbial contaminants of metal-working fluids. = International Archives of Occupational and Environmental Health, 72. k. 6. sz p