Röntgendiffrakció egyetlen molekulán Tegze Miklós MTA Szilárdtestfizikai és Optikai Kutató Intézet Budapest Munkatársak: Bortel Gábor, Faigel Gyula, Jurek Zoltán
Szerkezetmeghatározás atomi felbontással Szóráskísérletek (diffrakció) k minta q k I q ~ r i e qr d 3 r 2 detektor Hullámhossz: ~atomi távolság Röntgen, elektron, neutron STM, AFM, EM, NMR
Nobel-díj W.K. Röntgen fizika 1901 röntgensugárzás M. von Laue fizika 1914 röntgendiffrakció W.H. Bragg, W.L. Bragg fizika 1915 kristályszerkezet diffrakcióból J.C. Kendrew & M.F. Perutz kémia 1962 globuláris fehérjék szerkezete F. Crick, J. Watson, M. Wilkins orvosi 1962 DNS szerkezete D.C. Hodgkin kémia 1964 B12 vitamin szerkezete W. Lipscomb kémia 1976 boránok szerkezete A. Klug kémia 1982 elektron krisztallográfia H.A. Hauptman, J. Karle kémia 1985 krisztallográfiai direkt módszer J. Deisenhofer, R. Huber, H. Michel kémia 1988 fotoszintézis reakciócentrum szerkezete C.G. Shull fizika 1994 neutrondiffrakció R. MacKinnon kémia 2003 ioncsatornák szerkezete R.D. Kornberg kémia 2006 RNS polimeráz enzim szerkezete V. Ramakrishnan, T.A. Steitz, A.E. Yonath kémia 2009 riboszóma szerkezete
Miért kristály? Szórt intenzitás ~ atomok száma N kristály >> N molekula 10 17 2-10 5 Sugárkárosodás inkoherens >> koherens ~10:1 Miért egyetlen molekula? Sokfajta (biológiailag fontos) molekulát nem lehet kristályosítani pl. membránfehérjék többsége
Hogyan lehet egyedülálló molekulákon diffrakciót csinálni? Sugárkárosodás kialakulásához id kell Nagyon rövid ideig, nagyon nagy intenzitással kell mérni R. Neutze, R. Wouts, D. van der Spoel, E. Weckert & J. Hajdu, Nature 406 (2000) 752 Röngen szabadelektron lézer (XFEL) t = 10-100 fs N foton = 10 12 foton/impulzus I = 10 19 foton/cm 2
Röntgen szabadelektron lézer (XFEL) Elektron forrás Lineáris gyorsító Undulátor Röntgen nyaláb 2 km 17.5 GeV 200 m 12 kev http://www-xfel.spring8.or.jp
Röntgen szabadelektron lézerek impulzushossz foton/ impulzus hullámhossz impulzus gyakoriság start dátum FLASH (Hamburg) 10-50 fs 1012-1013 6.5-50 nm 150-4000/s 2005 LCLS (Stanford) 10-300 fs 1011-1012 0.15 nm 10-120/s 2009 0.1 nm 60/s 2010 SCSS (Japan) FERMI (Trieste) Eu XFEL (Hamburg) SPARX (Roma) SwissFEL (Villingen) FLASH 50-200 fs 1012-1014 10-100 nm 10/s 2011 100 fs 1012-1014 0.1-6 nm 30000/s 2014 30-200 fs 1012-1014 0.6-40 nm 50-100/s 2014 25 fs 1011-1012 0.1-7 nm 10-100/s 2016 LCLS SwissFEL SCSS European XFEL
XFEL Schenefeld West
I. Robinson, G. Gruebel, S. Mochrie, New J. Phys. 12, 035002 (2010)
http://lcls.slac.stanford.edu
Problémák Megoldások R. Neutze et al. Nature 406 (2000) 752 Molekula felrobban Rövid impulzus T4 lizozin fehérje Kevés szórt foton Átlagolás Véletlen orientáció Orientálás küls térrel Orientálás a szóráskép alapján
Coulomb robbanás Folyamatok: Fotoeffektus, Auger-effektus, másodlagos ionizáció, tér-ionizáció Elektrosztatikus kölcsönhatás Modell: Atomok, ionok, elektronok mozgása: Ionizáció, Auger-effektus, bels átmenetek: klasszikus molekuladinamika hatáskeresztmetszetek átmeneti valószín ségek Z. Jurek, G. Faigel, M. Tegze, Eur. Phys. J. D 29 217 (2004)
10Å Z. Jurek, G. Faigel, M. Tegze, Eur. Phys. J. D 29 217 (2004)
Z. Jurek, G. Faigel, Eur. Phys. J. D 50 35 (2008)
G. Huldt, A. Sz ke & J. Hajdu, J. Struct. Biol. 144 219 (2003) osztályozás, átlagolás orientálás rekonstrukció ~1 millió kép ~10 000 osztály 3D intenzitáseloszlás atomi pozíciók
Osztályozás RuBisCo enzim 560 kda Azonos orientációhoz tartoznak-e a szórásképek? korreláció relatív szög Ki lehet használni, hogy a bees nyaláb körüli forgatás csak elforgatja a képet 3 Euler-szög helyett csak 2 szerint kell osztályozni G. Bortel, G. Faigel, M. Tegze, J. Struct. Biol. 166 226 (2009)
Osztályozás Intenzitás Szóráskép Orientációs osztályok Orientálási hiba eloszlása G. Bortel, G. Faigel, M. Tegze, J. Struct. Biol. 166 226 (2009)
Orientálás A szórásképek a 3D térben metszik egymást közös vonal Közös vonal módszer G. Huldt, A. Sz ke & J. Hajdu, J. Struct. Biol. 144 219 (2003) V.L. Shneerson, A. Ourmazd & D.K. Saldin, Acta Cryst. A64, 303 (2008) Közös vonalban kevés és zajos információ Kissé eltér orientációjú szórásképek hasonlítanak egymásra rendezés Önszervez térkép és társai (SOM, GTM) R. Fung, V.L. Shneerson, D.K. Saldin & A. Ourmazd, Nature Phys. 5, 64 (2009) korreláció Közvetlen rendezés a szomszédok alapján Torzult intenzitáseloszlást adhat relatív szög Lehetséges mindkét tulajdonságot egyszerre felhasználni: A mért szórásképet minden lehetséges orientációban hozzápróbáljuk a 3D térben a feltételezett megoldáshoz A legjobban illeszked orientációban javítjuk vele a megoldást N.-T. D. Loh & V. Elser, Phys. Rev. E 80, 026705 (2009) Lassan konvergál, ha véletlen zajból indulunk ki
átlag 0.5 foton/pixel 500 mérés
korreláció átlag 0.5 foton/pixel 500 mérés
Orientálás A szórásképek a 3D térben metszik egymást közös vonal Közös vonal módszer G. Huldt, A. Sz ke & J. Hajdu, J. Struct. Biol. 144 219 (2003) V.L. Shneerson, A. Ourmazd & D.K. Saldin, Acta Cryst. A64, 303 (2008) Közös vonalban kevés és zajos információ Kissé eltér orientációjú szórásképek hasonlítanak egymásra rendezés Önszervez térkép és társai (SOM, GTM) R. Fung, V.L. Shneerson, D.K. Saldin & A. Ourmazd, Nature Phys. 5, 64 (2009) korreláció Közvetlen rendezés a szomszédok alapján Torzult intenzitáseloszlást adhat relatív szög Lehetséges mindkét tulajdonságot egyszerre felhasználni: A mért szórásképet minden lehetséges orientációban hozzápróbáljuk a 3D térben a feltételezett megoldáshoz A legjobban illeszked orientációban javítjuk vele a megoldást N.-T. D. Loh & V. Elser, Phys. Rev. E 80, 026705 (2009) Lassan konvergál, ha véletlen zajból indulunk ki
Orientálás 1. Rendezés a forgatások redukált (2 Euler szög) terében a közös vonal módszerrel 2. 3D intenzitás finomítása iterációval az elforgatott szórásképek alapján Szimmetriák figyelembe vétele
Rekonstrukció Fázisprobléma: Csak az intenzitást mérjük, a fázist nem I q ~ r i e qr d 3 r 2 Kristály: periodikus elektrons r ség intenzitás csak a Bragg-csúcsokban I q hkl Az információ fele (a fázis) hiányzik. A hiányzó információ csak küls forrásból pótolható (pozitivitás, atomicitás).
Egyedülálló részecske: I q folytonos Lehetséges a Shannon-mintavételezésnél nagyobb szögfelbontású mérés (oversampling)
(r) r/a 0 N = 20
(r) F(q) r/a 0 k/(2 N/a 0 ) N = 20 2 /a 0 F i FT j F q r e iqr dr
(r) F(q) r/a 0 k/(2 N/a 0 ) N = 20 2 /a 0 kristály
(r) F(q) r/a 0 k/(2 N/a 0 ) N = 20 2 /a 0 egyedülálló részecske
Egyedülálló részecske: I q folytonos Lehetséges a Shannon-mintavételezésnél nagyobb szögfelbontású mérés (oversampling) A molekula méreténél nagyobb térfogatot mérünk A molekula körüli tartományban az elektrons r ség zérus A probléma nem-lináris, csak iteratív megoldás lehetséges Itt is ki lehet használni, hogy az elektrons r ség pozitív Hibrid input-output algoritmus J.R. Fienup, Appl. Opt. 21 2758 (1982) Charge flipping algoritmus G. Oszlányi, A. Süt, Acta Crystallogr. A 60 134 (2004)
minta: 0.1 m Au SiN membránon Kísérlet J. Miao et al., Phys. Rev. B 67, 174104 (2003) szóráskép = 2 Å rekonstrukció A minta körüli tartományban az elektrons r ség zérus Fázisprobléma: iteratív megoldás
Összefoglalás Röntgendiffrakció egyetlen molekulán Mérés rövid (10 fs) és nagy intenzitású (10 26 foton/m 2 ) röntgenimpulzussal Röntgen szabad elektron lézer Osztályozás orientáció szerint korreláció alapján zajos képeken is elvégezhet Orientálás metszet és korreláció alapján Rekonstrukció 3D intenzitás fázisprobléma